TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE
ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Hà Nội - 2012
1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************
VŨ VĂN LỢI
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE
ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 62 42 40
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. PHÍ QUYẾT TIẾN
Hà Nội – 2012
2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị
Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ
Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo
điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1
ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực
công nghiệp chế biến đến năm 2020.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động
viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2012
Vũ Văn Lợi
i
3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Một số số liệu đã được đăng trên
các tạp chí khoa học chuyên ngành như trong: “Danh mục công trình khoa
học đã công bố có liên quan đến luận án”, đã được sự đồng ý cho phép sử
dụng các số liệu của các đồng tác giả và phần còn lại là các kết quả như trong
luận án.
Hà nội, ngày
tháng
năm 2012
Học viên
Vũ Văn Lợi
ii
4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
bp
cDNA
DEPC
his
DNA
dNTP
EDTA
EtBr
kb
kDa
LiP
LiP H8
rLiP H8
mRNA
OD
ORF
PCR
18
19
20
21
pI
RNA
rRNA
RT-PCR
22
23
SDS
SDS-PAGE
24
25
26
TAE
TEMED
tRNA
Cặp bazơ (base pair)
DNA bổ trợ (Complementary DNA)
Diethyl pyrocarbonate
Histidine dehydrogenase
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleotide
Ethylene diamine tetra-acetic acid
Ethidium bromide
Kilo bazơ
Kilo Dalton
Lignin peroxidase
Lignin peroxidase isozyme H8
Lignin peroxidase isozyme H8 tái tổ hợp
ARN thông tin (messenger RNA)
Mật độ quang (Optical Density)
Khung đọc mở (Open Reading Frame)
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain
reaction)
Điểm đẳng điện (isoelectric point)
Ribonucleic acid
ARN ribosom
Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase
(Reverse transcription polymerase chain reaction)
Sodium dodecyl sulfate
Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl
sulfate
Tris-acetat EDTA
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine
ARN vận chuyển
iii
5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
2.1
Thành phần gel chạy SDS-PAGE
29
3.1
So sánh độ tương đồng của trình tự amino acid giữa các LiP
38
Trang
H8 từ P. chrysosporium
3.2
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hoạt tính rLiP H8
44
của chủng P. pastoris C132
3.3
Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng đến khả năng
47
phát triển và sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris
C132
3.4
Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men trong môi trường đến
48
khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132
3.5
Ảnh hưởng của nồng độ peptone trong môi trường đến khả
49
năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132
3.6
Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate đến
50
hoạt tính rLiP H8.
iv
6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin
3
1.2
Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin
4
1.3
Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của
5
polymer lignin, tạo thành các oligomer
1.4
Cơ chế phân cắt mối liên kết C-C tạo thành gốc aryl
6
1.5
Cơ chế xúc tác của laccase
7
1.6
Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus
14
his4
3.1
Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của
33
nấm đảm P. chrysosporium 36210
3.2
Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen lipH8 và plasmid
35
pCR2.1::lipH8 trên gel agarose 1,0%
3.3
So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen lipH8 từ
36
chủng P. chrysosporium 36210 với trình tự amino acid của
các protein tương ứng từ các chủng P. chrysosporium khác
được đăng ký trên GenBank
3.4
Cây phân loại thể hiện sự tương đồng về trình tự amino acid
38
suy diễn của LiP H8 từ chủng P. chrysosporium 36210 và
các trình tự LiP H8 tương ứng của các chủng P.
chrysosporium khác
3.5
Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pPIC9::lipH8 bằng hai
39
enzyme giới hạn
3.6
Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen lipH8 với khuôn
40
v
7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
DNA là bộ gen của P. pastoris tái tổ hợp
3.7
Điện di đồ protein dịch nuôi cấy của năm dòng P. pastoris
42
tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel
3.8.
Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau
43
84 giờ nuôi cấy
3.9.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8
45
của chủng P. pastoris C132
3.10
Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi
51
chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo
110 dung tích 7,5 lít
3.11.
Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau
52
quá trình tối ưu
3.12.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8
53
sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132
3.13.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh
54
tổng hợp bởi P. pastoris C132
3.14
Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các
55
nhiệt độ khác nhau theo thời gian
3.15
Độ bền của rLiP H8 ở các pH khác nhau theo thời gian
55
vi
8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
i
Lời cam đoan
ii
an m c c c
i
c
i
iii
an m c c c ản
an m c c c
n
vi
đ
v
M cl c
vii
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
c ức năn
3
1.2. H enzyme p ân ủy li nin
4
1.2.1. Lignin peroxidase
5
1.2.2. Mangan peroxidase
6
1.2.3. Laccase
7
1.3. Vi sin
8
1.1. Lignin-cấ
rúc
ậ p ân ủy li nin
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
8
1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn
9
1.4. Ứn d n của li nin peroxidase
1.5. T n
n n iên cứ
iể
10
i n lignin peroxidase rên
iới
11
ại Vi Nam
1.6. Vec or iể
i n pPIC9
iể
i n nấm men
12
1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9
12
1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men
13
1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115
14
1.7. Mộ số y
16
ố ản
ưởn
ới q
rn
iể
i n enzyme i ổ
ợp ron P. pastoris
1.7.1. Ảnh hưởng methanol
16
vii
9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.7.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
17
1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men
18
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.1. Vậ li
20
2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid
20
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu
20
2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy
21
2.2. P ươn p p n
iên cứ
22
2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase
22
2.2.2. Điện di DNA/RNA trên gel agarose
22
2.2.3. Tách chiết RNA tổng số từ P. chrysosporium 36210
23
2.2.4. Tổng hợp cDNA
24
2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa LiP H8 từ cDNA
24
2.2.6. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8
25
2.2.7. Đăng ký trình tự lipH8 trên GenBank
25
2.2.8. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn
25
2.2.9. Phản ứng ghép nối gen
26
2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli và P. pastoris
26
2.2.11. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P.
28
pastoris
2.2.12. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp
28
2.2.13. Sàng lọc dòng P. pastoris biểu hiện LiP H8 tái tổ hợp hoạt
29
tính cao
2.2.14. Xác định hàm lượng protein
29
2.2.15. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS
30
2.2.16. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men biểu hiện rLiP
30
H8 của chủng P. pastoris C132
2.2.17. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính và độ bền của
31
viii
10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
33
3.1. Nhân dòng gen lipH8
33
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
33
3.1.2. Khuếch đại gen lipH8 từ cDNA
34
3.1.3. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 của P.
35
chrysosporium 36210
3.2. T i
ec or iể
i n rLiP H8 trong P. pastoris
3.3. Tạo c ủn P. pastoris i ổ ợp iể
3.4. Biể
i n
x cđn
38
i n rLiP H8
39
oạ ín rLiP H8 ron c c dòn P.
41
pastoris i ổ ợp
3.5. Nân cao
ả năn
iể
i n rLiP H8 của c ủn P. pastoris C132
43
3.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
43
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
45
3.5.3. Nồng độ chất cảm ứng methanol
46
3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và peptone
48
3.5.5. Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate
49
3.6. Độn
50
i lên men sin
3.7. N iên cứ c c y
ổn
ố ản
ợp rLiP H8
ưởn
ới oạ ín
độ ền của rLiP
53
H8
3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của rLiP H8
53
3.7.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ xúc tác của rLiP H8
54
3.7.3. Độ bền của rLiP H8 với nhiệt độ
53
3.7.4. Độ bền của rLiP H8 với pH
55
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
62
PHỤ LỤC
63
ix
11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật, có mặt trong
nguyên liệu, phụ phẩm và chất thải của sản xuất nông, lâm, công nghiệp.
Lignocellulose chứa lignin, hemicellulose và cellulose; trong đó lignin (chiếm
khoảng 20÷30% sinh khối khô) là hợp chất khó bị phân giải nhất. Thành phần
hóa học chính của lignin là polymer của các phenylpropanoid phức tạp được
cấu trúc từ ba loại rượu thơm coniferyl, sinapsyl và p-coumaryl (Elis, 2002).
Trong quy trình sản xuất bột giấy, cần phải loại bỏ lignin khỏi sinh khối
gỗ và giữ lại bột giấy (cellulose và một phần hemicellulose) sao cho độ dài,
độ bền của xơ sợi chứa cellulose được bảo tồn cao nhất. Một trong các hướng
có triển vọng được quan tâm nhiều là sử dụng các enzyme phân hủy lignin
trong sản xuất bột giấy và giấy (xử lý dăm mảnh nguyên liệu, tẩy trắng bột
giấy, khử màu nước thải) nhằm giảm sử dụng hóa chất và giảm thải các chất
độc hại ra môi trường (Elis, 2002). Các enzyme phân hủy lignin quan trọng
nhất là lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase (Kirk
et al., 1996; Gettemy et al., 1998; Wang et al., 2004; Hong et al., 2006).
Lignin peroxidase là enzyme phân hủy lignin mạnh nhất, oxy hóa các tiểu
phần lignin không chứa hợp chất phenol (chiếm 90% polymer của các
phenylpropanoide) (Gold et al., 2000; Martinez, 2002). Các nghiên cứu trước
đây cho thấy khi sử dụng enzyme phân hủy lignin từ Phanerochaete
chrysosporium để tẩy trắng bột giấy cho phép giảm 2/3 hàm lượng lignin, độ
trắng của bột tăng 54,6% (Elis, 2002). Ngoài ra, các enzyme phân hủy lignin
được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác như xử lý nguyên liệu
phế phụ phẩm nông nghiệp trong sản xuất cồn nhiên liệu, xử lý các nguồn ô
nhiễm lignin hay các hợp chất hydrocarbon đa vòng thơm (Polycyclic
Aromatic Hydrocarbon, PAH)...
Lignin peroxidase được sinh tổng hợp bởi nhiều loại vi khuẩn (thuộc
các chi Pesudomonas, Bacillus, Serritia...), xạ khuẩn (thuộc các chi
Streptomyces, Thermomonospora...), nấm mốc (Aspergillus) hay nấm đảm
1
12Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
(Phanerochaete, Trametes...) sống ký sinh trên thân thực vật bị mục hoặc
trong các nguồn cơ chất có chứa lignin. Có 6 loại isozyme LiP bao gồm H1,
H2, H6, H7, H8 và H10 đã được tách từ dịch nuôi cấy của P. Chrysosporium
(Leisola et al., 1987; Ollikka et al., 1993). Các isozyme này được cho rằng có
thể tạo ra từ quá trình sửa đổi các protein sau quá trình dịch mã (posttranslational modification). Các gen mã hóa enzyme H2, H6, H8 và H10 đã
được xác định và giải trình tự trong khi một số gen mã hóa các isozyme LiP
khác chưa được xác định. Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có
hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả. Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp
trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng
thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996).
Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P.
chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004),
đã được thực hiện thành công trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái
tổ hợp sử dụng vector pGV1503, hoạt tính enzyme đạt 1,125 nkat/mg. Trong
khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP H8 trong P. methanolica có hoạt tính
lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector pMETA và 1933 U/L đối với
pMETαA (Wang et al., 2004). Vì vậy, biểu hiện LiP H8 trong các vi sinh vật
khác nhau nhằm thu LiP hoạt tính cao đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên
thế giới quan tâm (Doyle, Smith, 1996; Martinez, 2002; Wang et al., 2004).
Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các
isozyme LiP từ P. chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột
giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của
của luận văn này là:”Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8
của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris“ nhằm
thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2
13Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lignin-cấu trúc và chức năng
Lignin là một polymer không tham gia vào quá trình trao đổi chất trong
thực vật. Nó thường tập trung ở các mô hoá gỗ, đóng vai trò như chất liên kết
các tế bào, làm tăng sức bền cơ học, khả năng chống thấm, ngăn chặn sự xâm
nhập của các chất độc, các enzyme vi sinh vật và các tác động khác từ bên
ngoài. Lignin có cấu trúc 3 chiều không đồng nhất và là đại phân tử với khối
lượng 600÷1000 kDa. Tuy phức tạp, nhưng về cơ bản, lignin được hình thành
từ 3 loại monomer: p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol
(Hình 1.1). Các monomer này được tích hợp vào lignin dưới dạng các
phenylpropanoid tương ứng là: p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringal
(S).
Hình 1.1. Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin
Tùy theo từng loài thực vật mà tỷ lệ ba thành phần này trong lignin
khác nhau. Lignin của cây hạt trần chứa chủ yếu dạng G và một lượng nhỏ H;
của cây hạt kín hai lá mầm thường chứa hỗn hợp G và S và ít dạng H, còn ở
cây một lá mầm thì là hỗn hợp của cả ba dạng trên. Nhiều loại cỏ có lignin
dạng
G,
trong
khi
ở
cây
cọ
chủ
yếu
là
dạng
S
(http://en.wikipedia.org/wiki/Lignin).
Như vậy, lignin thực chất không phải là một hợp chất có công thức xác
định mà là nhiều loại hợp chất khác nhau tùy thuộc vào thành phần và số
3
14Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
lượng các tiểu phần cấu tạo nên nó cũng như cơ chế kết hợp giữa các thành
phần đó.
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin
Do sự phức tạp trong cấu trúc lignin với các tiểu phần khác nhau bắt
cặp với nhau một cách ngẫu nhiên, nên cho đến nay người ta vẫn chưa mô tả
được chính xác và đầy đủ cấu trúc hoá học của lignin.
1.2. Hệ enzyme phân hủy lignin
Trong thực tế, lignin được phân giải bằng quá trình oxy hóa phức tạp,
nhưng nhờ tác động của một số enzyme cơ bản (lignin peroxidase (LiP),
mangan peroxidase (MnP) và laccase) do nấm mục trắng và vi sinh vật sinh
tổng hợp. Ngoài ra, một thành phần quan trọng của hệ thống enzyme phân
huỷ lignin là các enzyme oxidase, bao gồm: glyoxal oxidase, glucose oxidase,
aryl alcohol oxidase… Các enzyme này không trực tiếp tham gia vào cơ chế
phân cắt mạch lignin nhưng chúng tiến hành phản ứng oxy hoá chuyển
C2H2O2 (có sự tham gia của O2) thành H2O2 cần thiết cho hoạt động của các
peroxidase ngoại bào.
4
15Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.2.1. Lignin peroxidase
Lignin peroxidase (EC 1.11.1.14) được tìm thấy trong môi trường nuôi
cấy P. chrysosporium sau nhiều năm nghiên cứu độc lập của hai nhà khoa học
người Mỹ và người Nhật (Tien, Kirk, 1983). Sau này enzyme này còn tìm
thấy trong các nấm làm mục gỗ khác như Phlebia radiate, P. tremellose,
Trametes
versicolor
và
xạ
khuẩn
Streptomyces
viridosporus,
Thermomonospora fusca…
Lignin peroxidase là một glycoprotein có nhân heme, khối lượng phân tử
38÷43 kDa. pH tối thích cho hoạt động của lignin peroxidase tương đối thấp,
khoảng 2,5÷3,0 và điểm đẳng điện pI là 3,2÷4,0. Lignin peroxidase hoạt động
với sự tham gia của hydro peroxide (H2O2) sinh ra từ các enzyme khác, tiến hành
phản ứng oxy hoá nhường electron cho các cơ chất. Cơ chất của LiP là veratryl
alcohol và các phenolic acid nhưng chủ yếu là veratryl alcohol. Nó thực hiện xúc
tác các quá trình oxy hóa khác nhau trong mối liên kết aryl của phức hợp lignin,
cắt mối liên kết C-C của nhánh bên lignin (Hình 1.3), thực hiện oxy hóa
veratryl alcohol và các cấu trúc tương tự tạo thành aldehyde và ketone, phân cắt
mối liên kết intradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic
methylene (Hình 1.4).
Hình 1.3. Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của
polymer lignin, tạo thành các oligomer
5
16Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 1.4. Cơ chế phân cắt mối liên kết C-C tạo thành gốc aryl
Lignin peroxidase phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế
tiếp chuyển dịch một điện tử, hình thành cation-gốc tự do trung gian. Do thế
oxy hóa khử cao (1.5V), lignin peroxidase cũng có thể oxy hóa đơn vị mắt
xích của lignin là phenyl propan ở dạng không phenolic (Schoemaker,
Piontek, 1996).
Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của lignin peroxidase
trong quá trình phân giải lignin và các thực vật chứa lignin. Enzyme này có
thể phân giải lignin trong dung dịch loãng, oxy hóa và phân giải hàng loạt
dimer và oligomer tương ứng với các cấu trúc của lignin trong điều kiện
phòng thí nghiệm, xúc tác cho quá trình tạo ra các phân tử oxy hoạt tính.
1.2.2. Mangan peroxidase
Mangan peroxidase được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P.
chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984. Mangan
peroxidase là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 40÷48 kDa và
có điểm đẳng điện pI 2,9÷7,0. Ngoài P. chrysosporium, MnP còn được tìm
thấy trong nấm mục trắng khác T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis
cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma frowadic. Enzyme này hoạt động
như một phenoloxydase trên cơ chất phenolic bằng cách sử dụng Mn 3+/Mn2+
6
17Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
làm cặp oxy hoá khử trung gian. Nhiệm vụ chính của enzyme này là tham gia
vào phản ứng oxy hoá hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenolic của lignin
(có - OH phenol tự do). Mangan peroxidase tấn công trực tiếp vào cấu trúc
vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc có khối lượng phân tử thấp
theo con đường oxy hóa khử mangan gián tiếp (Johansson, Nyman, 1993;
Gold et al., 2000).
1.2.3. Laccase
Laccase (benzeldiol: O2 oxydoreductase) cũng đóng vai trò quan trọng
trong quá trình phân giải lignin. Phần lớn nấm mục trắng có khả năng sản sinh
ra enzyme này (Donal, Muralidhara, 1993; Bononi et al., 2005).
Tất cả các laccase đều là glycoprotein. Enzyme này có chứa 4 ion đồng,
phân bố ở ba vị trí liên kết khác nhau (một ion dạng I, một ion dạng II và hai
ion dạng III) và mọi ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc
tác. Ion đồng dạng I có vai trò là một ion vận chuyển điện tử từ cơ chất tới
tâm hoạt động của enzyme được tạo thành bởi ion dạng II và dạng III, là nơi
chúng liên kết với oxy và bị khử trở thành hai phân tử nước. Các ion đồng này
giúp cho quá trình khử 4 electron của phân tử oxy không tạo thành chất trung
gian là oxy nguyên tử hoạt động mạnh.
Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của laccase
Laccase là enzyme oxy hóa, thực hiện thủy phân các hợp chất hydroxyl
thơm hoặc các amino thơm tới các gốc phenol và gốc amino tự do. Laccase
cũng oxy hóa cấu trúc lignin phenol thành các gốc phenol tự do dẫn đến thay
đổi các chất quinon. Sự thay đổi này dẫn tới việc phân tách bộ khung cacboncacbon hoặc cacbon-oxy bên trong các tiểu đơn vị phenylpropan của lignin.
7
18Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả là hai chuỗi bên và các vòng thơm bị phân hủy. Đây là những bước
phản ứng quan trọng cho quá trình chuyển hóa, phân hủy các hợp chất lignin.
Trong quá trình xúc tác, laccase kết hợp với một số enzyme như glucose
oxydase, lignin peroxidase….thực hiện phân cắt các mối liên kết cacboncacbon, cacbon-oxy trong cấu trúc lignin và hợp chất lignin thành các vòng
thơm có cấu trúc đơn giản hơn.
1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin
Trong tự nhiên, gỗ là cơ chất khó bị phân huỷ do thành phần hoá học và
kết cấu đặc trưng của nó. Các polyme cấu trúc chính của gỗ bao gồm
cellulose (chiếm 40÷50 % trọng lượng khô của gỗ), hemicellulose (25÷40%),
lignin (20÷30%) và một lượng nhỏ protein (<5%). Như vậy trong gỗ có chứa
rất ít nitơ, mà nitơ lại cần để tạo ra các enzyme phân huỷ các hợp phần này.
Ngoài ra, lignin nằm trong vách tế bào cũng cản trở sự phân hủy gỗ do nó hạn
chế khả năng thấm nước của cellulose và hemicellulose, do vậy cũng cản trở
sự phân hủy của các polysacaride này; đồng thời nó hình thành một rào chắn
các enzyme vi sinh vật tấn công 2 thành phần còn lại. Bên cạnh đó, trong gỗ
luôn có các chất độc như ta-nanh, terpen, stilbenen, flavonoit và troponol
khiến cho côn trùng và vi sinh vật khó tiêu hóa được gỗ. Mặc dầu vậy, vẫn có
một số loài nấm và vi sinh vật tấn công được vào thành tế bào gỗ và phân hủy
mô gỗ.
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
Tác nhân làm mục gỗ nhiều nhất trong tự nhiên là các loại nấm thuộc
nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) - tác nhân cần thiết trong quá trình tuần
hoàn sinh khối và làm giàu đất cho hệ sinh thái rừng. Theo cách thức tấn công
vách tế bào mà chúng được chia thành ba loại: nấm mục trắng, mục nâu và
mục xốp. Tuy nhiên, chỉ có nấm mục trắng là có khả năng phân hủy lignin,
còn hai loại nấm kia chủ yếu tấn công vào cellulose và hemicellulose.
Nấm mục trắng là tác nhân phân huỷ gỗ hiệu quả nhất, chúng có khả
năng khoáng hoá hoàn toàn các thành phần của gỗ, tạo ra CO 2 và nước. Đúng
8
19Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
với tên gọi của mình, nấm mục trắng có thể phân hủy cả cellulose,
hemicellulose và lignin, khiến cho vị trí thân gỗ bị nấm tấn công trở thành
màu trắng. Tuy có khả năng phân huỷ triệt để lignin, chúng lại không thể sử
dụng lignin như nguồn cacbon duy nhất. Người ta cho rằng chúng phân giải
lignin để tiếp cận nguồn nitơ và cacbon có trong các thành phần protein và
cacbonhydrat còn lại (Highley, Dashek, 1998).
Có hai dạng nấm mục trắng chủ yếu được phân loại dựa trên tính đặc
hiệu khi tấn công. Dạng thứ nhất là phân hủy có chọn lọc, ở giai đoạn đầu
lignin được phân hủy nhanh hơn so với cellulose và hemicellulose, khiến cho
gỗ mất màu nhưng vẫn giữ được một phần cấu trúc. Dạng thứ hai là phân hủy
đồng thời, hệ enzyme do những loài nấm này sinh ra có thể phân hủy cả ba
thành phần chính của gỗ với tốc độ gần như nhau, thân gỗ bị phá hủy hoàn
toàn, trở thành dạng mùn trắng (Highley, Dashek, 1998). Tuy nhiên, tốc độ
phân huỷ các thành phần cacbonhydrat của nấm mục trắng vẫn chậm hơn nấm
mục nâu và nấm mục xốp. Nấm mục trắng tấn công vào các cây gỗ cứng. Các
loài nấm mục trắng có hệ enzyme phân giải lignin mạnh được quan tâm
nghiên cứu nhiều nhất là Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor,
T. hirsuta, chi Cerrena (C. unicolor), Pleurotus và một số chi khác.
1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn
Các vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas, Acinetobacter và Xanthomonas
được cho là có tham gia vào quá trình phân giải lignin nhưng vai trò của chúng
vẫn chưa thực sự rõ ràng. Một số tác giả đã phân lập được vi khuẩn thuộc chi
Agrobacterium, Burkholderia, Arthrobacter và Sphingomonas thường xuyên có
mặt trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium. Quan hệ giữa vi khuẩn và loài
nấm này được giả thiết là cộng sinh, vì chúng có khả năng phân giải các hợp
chất thơm là sản phẩm từ quá trình phân hủy lignin của nấm.
Một số nghiên cứu mới đây đã cho thấy khả năng phân giải lignin của các
vi khuẩn thuộc chi Clostridium đã chứng minh được rằng lignin cũng có thể bị
phân huỷ trong điều kiện yếm khí (Crawford, 1978).
9
20Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Xem thêm -