Tài liệu Tìm hiểu quy trình vi nhân giống cây khoai lang nhật từ đốt thân

LỜI MỞ ĐẦU Trong các loại cây lương thực có củ, khoai lang chiếm vị trí quan trọng. Trên thế giới khoai lang là 1 trong 5 cây có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, khoai tây). Thành phần chính khoai lang gồm tinh bột, đường, protein, vitamin, và các chất khoáng. Khoai lang được dùng làm lương thực thực phẩm chính cho con người, làm thức ăn cho gia súc và là nguồn nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến: bánh kiện kinh tế còn khó khăn cây khoai lang được coi là cây trồng cứu đói nhưng hiện nay nó là một cây trồng mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế. Ở nước ta, khoai lang là một trong bốn cây lương thực chính sau lúa, ngô, sắn. Trên thế giời, Việt Nam được xếp thứ năm về sản lượng khoai lang xuất khẩu. Tuy nhiên, năng suất còn thấp và bấp bênh do sử dụng giống đã thoái hóa, ít quan tâm đến biện pháp canh tác, sâu bệnh. Hiện nay, những giống khoai lang Nhật nổi tiếng về chất lượng cao và đã thích nghi trong điều kiện ở Việt Nam và trở thành đối tượng nghiên cứu thời sự. Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật từ thế kỷ 20 đã mở ra cuộc cách mạng mới trong công tác tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng hoàn thiện giúp cho việc nhân giống và phục hồi giống tốt hơn. Do đó việc ứng dụng kỹ thuật này vào trong sản xuất khoai lang sẽ tạo ra nhiều triển vọng mới trong việc tăng năng suất cũng như diện tích khoai lang Nhật, nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường tiêu thụ ngày càng cao.. 1 Mục đích của khóa luận này nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang. Đề tài này được thực hiện tại phòng CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT- VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI-VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM. 2 3 1.1. Giới thiệu về cây khoai lang 1.1.1. Sơ lược về khoai lang 1.1.1.1. Phân loại khoa học Tên khoa học: Ipomoea Batatas L. Giới: Plantae Lớp: Magnoliopsida Bộ : Solanales Họ: Convolvulaceae Chi: Ipomoea Loài : I. batatas Tên tiếng Anh: Sweet potato Hình 1.1. Cây khoai lang 1.1.1.2. Nguồn gốc Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên. Dấu tích củ khô tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970). Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ. Astin (1977) đã giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang tại Guatamala và nam Peru. Trong một số công trình khác cũng chỉ ra sự đa dạng loài khoai lang cao nhất ở Colombia, Equador và nam Peru. Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm tìm ra châu Mỹ năm 1492. Ông đã đưa nó vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tây Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang. 4 Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nha giới thiệu vào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn. Con đường khác do người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982) vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau đó tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin, 1963). Khoai lang được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến (Fukien) năm 1594. Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm 1674. Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615. Khoai lang được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á. Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh nam tạp kỷ” và “Quảng Đông tân ngữ“ của Lê Quí Đôn thì khoai lang được du nhập vào nước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta. Cây được trồng trong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao 2.300 m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996). 1.1.1.3. Phân bố  Trên thế giới Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó. Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng toàn thế giới là 127 triệu tấn. Trong đó phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn và diện tích trồng là 49.000 km². Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc được dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm . Sản lượng trên đầu người lớn nhất tại các quốc gia mà khoai lang là mặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với 160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg. Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ về sản xuất khoai lang, hiện nay cung cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của quốc gia này. 5 Mississippi cũng là bang chủ lực trong việc trồng khoai lang, tại đây khoai lang được trồng trên diện tích khoảng 8.200 mẫu Anh. Khoai lang từ Mississippi đóng góp khoảng 19 triệu USD vào nền kinh tế bang này và hiện nay có khoảng 150 trang trại ở Mississippi trồng khoai lang. Năm quận đứng đầu canh tác khoai lang ở Mississippi là Calhoun, Chickasaw, Pontotoc, Yalobusha và Panola. Lễ hội khoai lang quốc gia (Hoa Kỳ) được tổ chức hàng năm tại Vardaman vào tuần đầu tiên của tháng 11, và Vardaman được gọi là "The Sweet Potato Capital" (tạm dịch: Thủ đô khoai lang). Thị trấn Benton, Kentucky kỷ niệm khoai lang hàng năm cùng với Lễ hội Ngày Tater vào thứ hai đầu tiên của tháng 4.  Trong nước Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp hàng thứ ba sau lúa và ngô. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven biển. Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứng mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ, đất thịt, đất cát. Khoai lang lại có thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long,... Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung tâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dòng lai. Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển chọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518. Năm 6 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995). 1.1.2. Đặc điểm thực vật, sinh trưởng và phát triển của khoai lang 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật Hình 1.2 Cây khoai lang và các bộ phận Rễ Khoai lang sau khi trồng 3 - 4 ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các đốt thân dưới đất. Mỗi đốt có khả năng ra 15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ có 5 - 10 rễ được phân hoá thành rễ dầy mới có cơ hội hình thành củ. Rễ khoai lang chia làm ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ. Thân 7 Thân khoai lang có dạng bò hay nửa đứng. Thân phổ biến màu xanh, tím và xanh tím. Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác nhau. Ở mắt đốt mọc ra rễ phụ. Độ dài đốt phụ thuộc vào giống. Căn cứ vào độ dài thân chính người ta chia làm hai loại: Loại thân dài khoảng 2- 5 m , loại thân ngắn: 0,5 -1 m. Thân phát triển dài ngắn ngoài yếu tố chính là giống còn phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa, loại đất và phân bón. Lá Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mắt một lá gồm cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài 6 - 20 cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảng không gian và có thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sử dụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân nằm bò dưới mặt đất. Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ có năng suất chất xanh cao. Màu sắc cuống lá do giống qui định. Đa số các giống khoai lang có cuống lá màu xanh, một số khác có cuống màu tím nhạt, tím. Hoa Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngọn thân, hoa hình chuông có cuống dài. Hoa mọc thành chùm hay riêng rẽ. Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt hồng, bên trong nó có nhiều lông tơ và tuyến mật hấp dẫn côn trùng. Một hoa gồm 5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái. Quả và hạt Quả khoai lang thuộc loại quả sóc hình tròn màu nâu đen, sau khi thụ tinh một đến hai tháng thì quả chín và còn tùy thuộc giống và mùa vụ. Một quả có từ 1 đến 4 hạt, hạt có vỏ cứng, hạt dễ bị rụng khi quả chín. 2.1.3.1. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Khoai lang có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm và ra rễ; Phân cành và tạo củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ . Thời kỳ ra rễ và chồi xanh 8 Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau. Thời kỳ phân cành và hình thành củ Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày. Các nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bò trải dần trên mặt luống. Củ hình thành khoảng 1,0 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc giống và điều kiện môi trường. Đây là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bó mạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ Thời kỳ phát triển thân lá Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 - 85 ngày. Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt và rãnh luống. Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể. Nhưng những củ đã được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng. Một số củ hình thành sớm bắt đầu quá trình tích lũy chất khô. Thời kỳ phát triển củ Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoan này khoảng 90 - 105 ngày đối với các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam. Điều kiện thuận lợi cho quá trình phình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng ấm, ban đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuối thì năng suất củ khoai lang càng cao. Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trong khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây khoai lang 1.1.3.1. Thế giới Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nó được trồng trên 9 hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến. Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào. Trong một nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng. Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng. Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khô hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổng diện tích là 11.200 hectares với năng suất là 30 tấn/ha. Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho khoai lang ở Ai Cập đạt được năng suất tối đa. Trong đó bệnh virus được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đó, Viện Kỹ thuật Gen trong Nông nghiệp của Ai Cập (AGERI) đã áp dụng kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang gồm các bước như sau:  Cải tạo giống địa phương bằng việc sản xuất nguồn cây giống sạch bệnh.  Phát triển một hệ thống nhân giống có hiệu quả có khả năng ngăn chặn sự lây lan của virus.  Phát triển một hệ thống phát hiện virus ở các cánh đồng trồng khoai lang.  Ngoài ra họ còn thiết lập các hệ thống theo dõi đảm bảo chất lượng của sản phẩm khoai lang được sản xuất ra. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Castro và Andrate (1995) chỉ ra trên môi trường MS bổ sung 0,005 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l GA3 cho kết quả tốt. 10 Các nghiên cứu của Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), Castro và Andrate (1995) trên các giống khoai lang khác nhau: Kết quả đều không thấy sự khác biệt giữa các giống. Các nghiên cứu về cây khoai lang trên thế giới rất đa dạng và phong phú.  Hướng nghiên cứu tạo cây khoai lang in vitro sạch virus: Năm 1975, Alconero và ctv đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,4 -0,8 mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin (NAA, IAA). Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo. Trong số cây con được test virus thì có 47% không nhiễm bệnh. Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), sử dụng môi trường MS bổ sung auxin (2,4-D), cytokinins (KN, BA), GA3 (0,1 mg/l) để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng với 2 - 3 lá mầm được cắt và cấy trên các môi trường có các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau, và đặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux. Kết quả thí nghiệm cho thấy 2,4-D (1 mg/l) và BA (0,25 mg/l) tạo được cây con tốt hơn. Trường hợp 2,4-D và KN ở nồng độ cao hơn tương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo ra mô sẹo. Mervat và ctv (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóng khoai lang (SPFMV). Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virus bằng phương pháp dot- ELISA. Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý nhiệt ở nhiệt độ 42 0C/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 39 0C/ đêm (8giờ bóng tối) trong thời gian 3 tuần trước khi tách đỉnh sinh trưởng. Những cây hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA. Kết quả nghiên cứu cho thấy không có cây nào bị nhiễm. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sự nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và ctv (2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l KN và 0,5 mg/l GA 3. Và các chồi này hình thành trực tiếp thành cây mà không phát triển mô sẹo. Theo tác 11 giả, TDZ và BA làm cho chồi phát triển qua mô sẹo nên không dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.  Vi nhân giống: Đây là nghiên cứu sớm nhất của cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự công bố vào năm 1974 về tái sinh khoai lang thông qua mô sẹo. Kết quả cho thấy sự hình thành mô sẹo từ rễ củ trên môi trường White có bổ sung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l ABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D. Năm 1984, sự tái sinh chồi qua mô sẹo từ lá, đỉnh chồi, thân và rễ cũng thực hiện bởi Liu và Cantiliffe trên môi trường MS có bổ sung 0,5 đến 2 mg/l 2,4 – D. Sự tái sinh chồi khoai lang in vitro từ rễ đã được công bố bởi Hwang và cộng sự (1983). Theo nghiên cứu này, đầu tiên các đoạn rễ kích thước 2 – 3 cm được nuôi cấy lên môi trường MS biến đổi có bổ sung nồng độ muối khoáng cao, 100 mg/l meo – inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 mg/l đường và 10 g/l agar. Sau đó, từ các nốt rễ sẽ tạo mô sẹo và các vùng giống như mô phân sinh để phát triển tiếp thành chồi. Mười năm sau, Berlamino (1993) đã thực hiện lại quá trình tái sinh chồi từ các nốt rễ khoai lang in vitro trên giống Benni Azuma thông qua nuôi cấy mô lá trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l BA và thu được tần số tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ . Chee và cộng sự (1990) cho rằng bằng cách giảm nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy xuống còn 1,6% cùng với việc bổ sung 2,4 – D sẽ tăng cường sự phát triển phôi. Năm 1995, sự tái sinh khoai lang qua cuống lá được Desai và ctv thực hiện thành công trên 27 giống. Giai đoạn đầu, các lá được cấy lên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/l zeatin cho tới khi cuống lá bắt đầu phình lên (2 – 4 ngày). Giai đoạn thứ hai, chúng được cấy truyền sang môi trường MS có bổ sung 0,8 mg/l zeatin và đạt tần số tái sinh chồi cao. Một tần số tái sinh cây cao được thiết lập từ các mô sẹo có nguồn gốc từ các mảnh lá khoai lang in vitro nuôi cấy trên môi trường LS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D, 12 3g/l dịch chiết nấm men, 50 g/l đường và chuyển sang môi trường thứ hai gồm khoáng LS có bổ sung 2 mg/l ABA hoặc 2 mg/l AgNO 3 để tái sinh thành cây (Otani và ctv, 1996). Một quy trình tái sinh cây trực tiếp gồm 2 giai đoạn cũng đã được công bố bởi Prakash và ctv (1996). Các mô cuống lá trong môi trường MS có bổ sung 2,4 – D trong giai đoạn đầu tiên và TDZ trong giai đoạn thứ hai. Công bố này cho thấy khả năng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu di truyền, giai đoạn phát triển và hướng đặt mô cuống lá trên môi trường nuôi cấy. Năm 1997, Liu và ctv đã thiết lập thành công một hệ thống hiệu quả qua nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có khả năng phát sinh phôi và tái sinh thành cây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4 – D và ABA. Cũng trong năm 1997, Sihachakr đã nghiên cứu thành công hệ thống tái sinh cây khoai lang qua con đường phát sinh phôi. Các nhân tố ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo và hình thành chồi cũng đã được thực hiện. Công bố này đã cung cấp một loại môi trường cải biên trong nghiên cứu tái sinh khoai lang, môi trường SPM (Standard Sweet Potato Medium). SPM là môi trường MS có bổ sung vitamin Dtaba 100mg/l; meo – inositol 50 mg/l và 30 g/l đường. Kết quả cho thấy trên môi trường SPM có bổ sung tổ hợp của 0,5 mg/l kinetin và 0,1 mg/l 2,4 – D mô sẽ tái tạo chồi.  Quang tự dưỡng: Sự phát triển của cây khoai lang in vitro được cải thiện dưới các điều kiện vi nhân giống quang tự dưỡng (không bổ sung đường trong môi trường nuôi cấy, cường độ chiếu sáng 100 µM.m-2.s-1 PPFD và nồng độ CO2 cao) (Kozai và ctv, 1993). 1.1.3.2. Việt Nam Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp hàng thứ ba sau lúa và ngô. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven biển. Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứng 13 mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ, đất thịt, đất cát. Khoai lang lại có thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long... Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung tâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dòng lai. Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển chọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518. Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995). Hiện nay, trên lĩnh công nghệ sinh học, cây khoai lang chưa được nghiên cứu nhiều ở nước ta. Tuy nhiên vẫn có một số các nghiên cứu nổi bật, trong đó có nghiên cứu của Nguyễn Mỹ Uyên và ctv (2006) khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây khoai lang Ipomoea batatas L. trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên. 1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 1.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, 14 đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009) 1.2.2. Lịch sử và thành tựu trong nuôi cấy mô 1.2.2.1. Lịch sử hình thành Vào năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đưa ra học thuyết tế bào và nêu rõ: “ Tế bào là đơn vị cơ bản của sự sống, mọi sinh vật dù phức tạp đến cũng đều được cấu tạo từ các đơn vị rất nhỏ, đó là các tế bào”. Bảng 1.1. Các mốc quan trọng trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm Sự kiện Haberlandt lần đầu tiên thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật, ông 1902 nhận thấy có sự ảnh hưởng của muối khoáng tới sự chuyển hóa tế bào. Kotte và Robins nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo 1922 và nhận thấy sự ảnh hưởng của khoáng và glucose. Tuy nhiên, sự sinh trưởng ngừng lại sau đó dù đã được cấy chuyền. White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua trong thời gian vô hạn 1934 trên môi trường chứa khoáng, glucose và dịch chiết nấm men. Sau đó, phát hiện ra sự ảnh hưởng của các vitamin nhóm B (B1, B6) và acid nicotinic và sử dụng để thay thế cho dịch chiết nấm men. 1938 1939 Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng thực vật đầu tiên là IAA. Nobécourt và Gautheret duy trì thành công mô sẹo cà rốt trong môi trường agar bằng cách cấy chuyền 6 tháng một lần. 15 Sterward xác định tác dụng của nước dừa trong quá trình phân chia 1948 mô sẹo cà rốt. Tổng hợp thành công các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D. 1954 1957 Skoog phát hiện ra kinetin (thuộc nhóm cytokinin) và ảnh hưởng của nó trong việc phân chia tế bào mô thân cây thuốc lá. Skoog và Miller nhận thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệ cytokinin/auxin lên sự biệt hóa và tái sinh cơ quan của mô sẹo thuốc lá. 1954 -1959 Bắt đầu nghiên cứu tách và nuôi cấy tế bào đơn của thực vật. 1956 Muir, Hildebrandt và Riker tách thành công tế bào đơn từ mô sẹo bằng máy lắc. Bergman tiến hành thu tế bào đơn bằng lọc đơn giản và đưa ra kỹ 1960 thuật gieo tế bào đơn. Cooking tạo ra các tế bào trần bằng enzym cellulase. Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy và môi 1962 trường của họ được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau cây khác nhau. 1966 Guha và Maheswari công bố nuôi cấy thành công túi phấn của cà độc dược và tạo thành các cây đơn bội. Nagata và Takebe tái tạo thành công vách tế bào trần cây thuốc lá 1970 và mở rộng ra khả năng lai các giống khác nhau của cùng một loài thực vật và tái sinh cây mới bằng các kỹ thuật dung hợp tế bào trần. 16 1980 – 1992 Sử dụng kỹ thuật gen vào việc nghiên cứu và lai tạo nhiều loại thực vật khác nhau. Và kết quả cho đến nay, các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vẫn đang phát triển và được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống cây trồng; sản xuất các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học nhằm đáp ứng một phần tương đối lớn cho nhu cầu nhiều mặt của con người. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vẫn đang tiếp tục hứa hẹn nhiều điều trong tương lai. 1.2.2.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như:  Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp ( nuôi cấy tế bào trần ).  Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng ( nuôi cấy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glucoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.  Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn). Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).  Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.  Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.  Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử. 17  Nuôi cấy quan tự dưỡng. 1.2.3. Các bước thực hiện trong vi nhân giống Quá trình vi nhân giống được chia thành các giai đoạn sau: 1.2.3.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm sinh trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn có khả năng sinh trưởng. Khử trùng bề mặt bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. Mẫu sau khi rửa sách sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường sử dụng để khử trùng mẫu là hupochloride sodium 0,5 – 5,25% , cồn, hupochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromie, clorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữ nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Sau khi khử trùng, mẫu cấy phải được rửa lại vài lần với nước cất vo trùng trong tủ cấy để sửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thường phải cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. 18 Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nấu haowjc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tanin haowjc các hợp chất hydroxyphenol. Các mô non thường ít bị hóa nâu hơn mô trưởng thành hay mô già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase có nhân Cu( ví dụ như polyphenoloxidase và tryoxidase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thu bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5g/l. Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone(PVP),acid ascorbic, acid citric, L-cytein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercatoethanol. Từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để lam giảm hiện tượng hóa nâu của mẫu cấy nên:  Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất.  Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi trường.  Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sáng trong 1 – 2 tuần.  Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. 19  Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần lể từ khi bắt đầu nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ.  Tạo thể nhân giống in vitro: - Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi , thể cắt đốt. - Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khă năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. - Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. 1.2.3.2. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. 1.2.3.3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Ở giai đoạn này cây non được tạo ra hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một thước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của 20