Tài liệu Tinh dầu, hương liệu - Phương pháp nghiên cứu và ứng dụng

PGS.TS. V¨n Ngäc H−íng Tinh dÇu, h−¬ng liÖu ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vµ øng dông nhµ xuÊt b¶n ®¹i häc quèc gia hµ néi ii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ...................................................................................................1 Chương 1 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ TINH DẦU ......................................................3 1.1. Định nghĩa tinh dầu ..................................................................3 1.2. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật ............................3 1.3. Tính chất của tinh dầu...............................................................4 1.4. Phân loại tinh dầu .....................................................................9 Chương 2 NGUYÊN LIỆU CHO TINH DẦU.........................................................30 2.1. Nguồn tài nguyên thực vật có tinh dầu ...................................30 2.2. Sự định khu của tinh dầu trong thực vật.................................30 2.3. Một số thực vật có tinh dầu ở Việt Nam.................................34 Chương 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TINH DẦU ....................................44 3.1. Phương pháp cất tinh dầu với nước ........................................44 3.2. Phương pháp chiết tinh dầu ...................................................51 3.3. Phương pháp hấp phụ điều chế tinh dầu.................................61 3.4. Phương pháp ép tinh dầu ........................................................63 Chương 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ NGHIÊN CỨU TINH DẦU .............64 4.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) khảo sát thành phần tinh dầu ...................................................................................64 4.2. Sắc ký khí (GC) và GC kết hợp với khối phổ (GC-MS) nghiên cứu tinh dầu ............................................................................70 Chương 5 PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CỦA TINH DẦU ............................72 5.1. Phương pháp cất phân đoạn phân lập các thành phần của tinh dầu ...................................................................................72 iii 5.2. Phương pháp sắc ký cột phân lập các thành phần của tinh dầu ...................................................................................80 Chương 6 ÁP DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ CHO NGHIÊN CỨU TINH DẦU ..............................................................................................87 6.1. Phổ hồng ngoại (IR – Infrared Spectrocopy)..........................87 6.2. Phổ tử ngoại (UV – Ultra Violet Spectrometry).....................93 6.3. Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS – Electron Impact Mass Spectrometry) ................................................................98 6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR ......................108 6.5. Ví dụ về xác định cấu trúc phân tử tecpenoit bằng phương pháp phổ................................................................................131 Chương 7 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ CHẤT THƠM ..............................................147 7.1. Khái niệm về mùi và chất thơm............................................147 7.2. Cơ chế cảm nhận mùi ...........................................................148 7.3. Thụ quan hoá học (cảm thụ hoá học)....................................150 Chương 8 ĐÁNH GIÁ VỀ MÙI.............................................................................151 8.1. Độc tính và độ an toàn mùi...................................................151 8.2. Sự quyến rũ và ưa chuộng ....................................................152 8.3. Cường độ mùi .......................................................................154 8.4. Đánh giá mùi qua tính chất hoá lý của chất thơm ................157 8.5. Đánh giá mùi qua tác dụng sinh lý .......................................158 8.6. Giá trị mùi.............................................................................159 8.7. Cảm nhận tín hiệu mùi..........................................................159 Chương 9 MỐI LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC PHÂN TỬ VÀ HOẠT TÍNH MÙI ..........................................................................161 9.1. Sự lựa chọn lập thể đối quang ..............................................161 9.2. Sự lựa chọn lập thể không đối quang ...................................162 9.3. Đặc tính điện tử.....................................................................164 iv 9.4. Một vài ví dụ về nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính mùi ....................................................................165 Chương 10 CÁC THÀNH PHẦN CỦA CHẤT THƠM ..........................................171 10.1. Đơn hương.............................................................................171 10.2. Chất điều hương ....................................................................177 10.3. Chất định hương....................................................................177 10.4. Dung môi...............................................................................179 Chương 11 ỨNG DỤNG CỦA TINH DẦU ............................................................181 11.1. Tinh dầu cho nước hoa và mỹ phẩm .....................................181 11.2. Tinh dầu cho thực phẩm........................................................182 11.3. Tinh dầu cho dược phẩm.......................................................183 11.4. Tinh dầu cho sản xuất hương liệu .........................................183 Chương 12 MỘT SỐ CHUYỂN HOÁ TINH DẦU.................................................184 12.1. Mục đích, thành phần và khả năng chuyển hoá ....................184 12.2. Một số chuyển hoá của các tinh dầu .....................................185 Chương 13 ỨNG DỤNG CỦA CHẤT THƠM........................................................192 13.1. Kỹ thuật pha chế hương liệu .................................................192 13.2. Pha chế hương liệu ................................................................195 13.3. Pha chế hương bắt chước và một số đơn pha chế hương bắt chước ....................................................................................196 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................203 v vi MỞ ĐẦU Nước ta ở vùng nhiệt đới gió mùa, ánh sáng nhiều, lượng mưa lớn, độ ẩm cao nên thực vật phát triển mạnh. Thảm thực vật nước ta đa dạng và phong phú vào bậc nhất thế giới, có hàng nghìn họ, hàng vạn loài và đặc biệt phong phú là các loại cây có tinh dầu. Có nhiều cây quý hiếm như thảo quả, quế chi, bạch đậu khấu, dương xuân sa, sa nhân… Có nhiều cây đặc hữu như riềng Bắc bộ, riềng Phú Thọ… Các cây có tinh dầu không chỉ là nguồn nguyên liệu phong phú cho khai thác tinh dầu mà còn là nguồn cây thuốc dân tộc, chữa được nhiều bệnh hiểm nghèo và hiệu dụng, là cây gia vị nổi tiếng trong chế biến thực phẩm. Nếu biết đi sâu nghiên cứu nguồn tài nguyên này, biết bảo tồn quỹ gen quý giá và phát triển thì chắc chắn nó sẽ mang lại lợi ích to lớn về kinh tế xã hội, góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng và phát triển kinh tế nông thôn. Tinh dầu là một lĩnh vực rất lớn và quan trọng của hợp chất thiên nhiên. Nghiên cứu tinh dầu sẽ góp phần phát triển hoá hữu cơ, đặc biệt sinh tổng hợp hữu cơ qua vi sinh vật, qua công nghệ biến đổi gen và nuôi cấy mô tế bào. Hơn nữa, nói đến tinh dầu là nói đến hương liệu, nói đến chất thơm, nói đến gia vị vì hầu hết tinh dầu phục vụ cho các lĩnh vực này và làm thuốc phục vụ cho đời sống. Nền văn minh của con người càng phát triển, nhu cầu này càng lớn. Như vậy, nghiên cứu và phát triển tinh dầu có đầy đủ điều kiện về nguyên liệu cũng như nhu cầu, do đó nó trở thành ngành có nhiều tiềm năng và triển vọng. Cuốn sách được chia thành ba phần chính. Phần thứ nhất là các khái niệm cơ bản về tinh dầu, về nguồn gốc, các tính chất vật lý và hoá học của tinh dầu, về phân loại tinh dầu, về nguyên liệu và các phương pháp điều chế tinh dầu. Phần thứ hai đề cập đến các phương pháp nghiên cứu tinh dầu; các phương pháp sắc ký phân tích định tính, định lượng, nhận biết các thành phần của tinh dầu, các phương pháp vật lý hiện đại xác định cấu trúc phân tử của các thành phần của tinh dầu. Phần thứ ba của 1 cuốn sách là các ứng dụng và chuyển hoá tinh dầu thành các mặt hàng đắc dụng khác. Với các nội dung trên, chúng tôi hi vọng cuốn sách không chỉ đưa đến cho độc giả những kiến thức cơ bản, sâu sắc và toàn diện về tinh dầu mà còn đưa đến cho độc giả các phương pháp nghiên cứu hiện đại đối với tinh dầu. Rõ ràng cuốn sách như một cẩm nang đối với những ai say mê nghiên cứu và ứng dụng tinh dầu. Tuy vậy, khó mà đáp ứng được hết mọi yêu cầu của độc giả, hơn thế không thể nói là không có những thiếu sót. Do đó, những ý kiến đóng góp của độc giả đối với cuốn sách là vô cùng quý giá đối với chúng tôi, chúng tôi rất trân trọng và tham khảo để tu sửa cuốn sách tốt hơn nữa. Tác giả 2 Phần thứ nhất TINH DẦU Chương 1 KIẾN THỨC CƠ SỞ VỀ TINH DẦU 1.1. Định nghĩa tinh dầu Hiện nay có một số quan niệm khác nhau về tinh dầu. Người thì cho rằng tinh dầu là các chất thơm thu được từ thực vật, người khác cho rằng tinh dầu là sản phẩm thứ cấp trong quá trình trao đổi chất trong thực vật. Theo Martin Petozilka, Charles Ehret, tinh dầu là sản phẩm thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước từ nguyên liệu thực vật. Quan niệm này cho đến nay được nhiều người thừa nhận hơn cả. 1.2. Vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật Với nguyên tố cacbon đánh dấu và các phương pháp khác, người ta đã chứng minh được rằng tinh dầu cũng như nhiều hợp chất khác trong cơ thể thực vật được sinh tổng hợp từ cùng một chất khởi nguyên, đó là axit axetic. Axit này chuyển thành Geranylpyrophotphat và Farnesylpyrophotphat; từ hai dẫn xuất này sinh tổng hợp ra hàng loạt chất khác nhau, đáp ứng nhu cầu và phát triển của cơ thể thực vật. Quá trình đó được Nicolaev mô tả trên sơ đồ hình 1.1. Người ta cũng chứng minh được rằng tinh dầu tham gia vào nhiều quá trình chuyển hoá trong cơ thể thực vật. Nó tồn tại trong thực vật không những ở dạng tự do trong các túi tinh dầu mà còn liên kết với các hợp chất khác nhau trong các mô của tế bào thực vật và như thế tinh dầu tham gia vào các quá trình trao đổi chất, quá trình sinh lý, sinh hoá trong cơ thể thực vật. Có người cho rằng tinh dầu tự do trong các túi tinh dầu là chất tiết của cơ quan tiết của thực vật, nhưng nhiều người cho rằng đó là chất dự trữ, chất bảo vệ. Còn tinh dầu liên kết với các chất khác trong các mô, các cơ quan khác nhau của thực vật là tinh dầu chuyển hoá, tinh dầu chức năng. 3 Axit axetic Geranylpyrophosphat Monotecpenoit Farnesylpyrophosphat Geranyl - geronyl (P) Serquitecpenoit §itecpenoit Carotenoit Vitamin E vµ K Phyton Vitamin A Cophermen Hocmon sinh s¶n Plastoquinon C¸c vitamin D Giberilin Steroit Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá Geranylpyrophotphat và Farnesylpyrophotphat trong cơ thể sống (Nicolaev, 1968) Theo P.X. Tanaxienco (1985), tinh dầu trong thực vật có các vai trò sau đây: – Bảo vệ: chống sâu bệnh, chống nấm, chống tàn phá của ngoại cảnh; – Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tăng hiệu quả của phản ứng enzym. Gần đây người ta cho rằng tinh dầu, nhất là phần nhẹ, phần có mùi là thông tin hoá học giữa các cơ thể sống trong giới thực vật và có khi đóng vai trò duy trì sự tồn tại và phát triển của thực vật, đặc biệt là tinh dầu của các loài hoa, chính nhờ mùi của tinh dầu của các loài hoa mà ong, bướm, côn trùng bị lôi cuốn để hưởng thụ nên chúng chuyển từ hoa này sang hoa khác, từ hoa đực sang hoa cái, mang theo các nhuỵ hoa làm cho quá trình thụ phấn thêm kết quả và thực vật thêm phát triển. 1.3. Tính chất của tinh dầu Tinh dầu là một hỗn hợp nhiều thành phần, nó thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước nên nó không tan hoặc kém tan trong nước. Tuy là một hỗn hợp nhiều thành phần nhưng mỗi loại tinh dầu của mỗi loài, hay một bộ phận của thực vật xác định thì có số thành phần xác 4 định, hàm lượng các thành phần cũng xác định nên các hằng số vật lý như tỷ trọng (d), chiết suất (n), độ quang cực (α) và các chỉ số hoá học như chỉ số axit, chỉ số ancol, chỉ số cacbonyl, chỉ số este… của nó là xác định. Chính vì thế, người ta căn cứ vào các hằng số vật lý và các chỉ số hoá học của tinh dầu để sơ bộ nhận biết và đánh giá tinh dầu. 1.3.1. Tính chất vật lý và hằng số vật lý của tinh dầu Nếu tinh dầu là chất lỏng thì chúng thường có nhiệt độ sôi không ổn định và có khi cao đến 320oC và chiết suất từ 1,378 đến 1,5850, tỷ trọng nhỏ hơn hoặc lớn hơn 1 một chút. Nếu tinh dầu là chất rắn thì có điểm chảy ≤ 160oC. Tinh dầu không tan hay kém tan trong nước, tan tốt trong cồn 99,5%, đietyl ete, benzen, etylaxetat… a) Tỷ trọng của tinh dầu Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của trọng lượng của một thể tích xác định của tinh dầu và trọng lượng của nước có cùng thể tích. Tỷ trọng phụ thuộc vào bản chất tinh dầu, thành phần tinh dầu và vào nhiệt độ. Tỷ trọng càng cao thì mạch cacbon tinh dầu càng dài nếu là mạch thẳng, số vòng càng lớn nếu là mạch vòng, các dẫn xuất oxi có tỷ trọng cao hơn các hiđrocacbon tương ứng. Khi đo ở 20oC, ta có: m −m d 20 = 1 20 m2 − m trong đó: d là tỷ trọng; 20 ở trên là nhiệt độ tinh dầu lúc đo; 20 ở dưới là nhiệt độ của nước lúc đo; m là trọng lượng của cuvet; m1 là trọng lượng của cuvet và tinh dầu; m2 là trọng lượng của cuvet và nước. Tỷ trọng của một chất nguyên chất hay một hỗn hợp có thành phần không đổi là một hằng số ở một nhiệt độ xác định nên người ta dùng tỷ trọng để đánh giá độ tinh khiết một chất hay đánh giá thành phần của một hỗn hợp. Vì thể tích thay đổi theo nhiệt độ, đối với nước khối lượng riêng của nó lớn nhất khi ở 4oC, khi đó 1 ml nước nặng 1 g. Từ 4oC đến 20oC khối lượng của nó giảm, nên khi đo nước ở nhiệt độ khác mà muốn đưa về 4oC thì phải nhân thêm khối lượng riêng của nước lúc đo, ví dụ đo ở 20oC: 5 d 20 = 20 m1 − m m2 − m ×Q trong đó: Q là khối lượng riêng của nước lúc đo (cho trong các tài liệu). b) Chiết suất (chỉ số khúc xạ) Chiết suất của tinh dầu là tỷ số của sin góc tới trên sin góc khúc xạ khi cho tia sáng đi từ không khí vào tinh dầu. Chiết suất phụ thuộc vào bản chất của chất, phụ thuộc vào thành phần của hỗn hợp, phụ thuộc vào nhiệt độ và bước sóng của ánh sáng dùng để đo. Thường người ta đo chiết suất ở 20oC và ánh sáng là bước sóng vạch D của natri và khi đó ta có n 20 . D Đối với một số tinh dầu chiết suất của nó thay đổi từ 0,013 đến 0,014, nhưng thông thường từ 0,003 đến 0,004 khi nhiệt độ thay đổi, nghĩa là thay đổi rất ít ở con số thứ ba sau dấu phảy. Vì vậy, điều hoà nhiệt độ chính xác khi đo chiết suất là rất quan trọng, thường dùng nhiệt kế có độ chính xác 0,1oC. Vì có độ chính xác cao và rất phụ thuộc vào thành phần nên người ta dùng chiết suất để theo dõi quá trình phản ứng, ví dụ phản ứng chuyển hoá pseudoionon thành α,β-ionon hay thành phần hỗn hợp α và β-ionon. Quá trình hiđro hoá, polime hoá hay vòng hoá đều có ảnh hưởng lớn đến nD, nên người ta có thể dùng n 20 theo dõi các quá trình đó. D Ví dụ: geraniol: n 20 = 1,4760; D xitronelol: n 20 = 1,4560; D xitral: n 20 = 1,4890; D xitronelal: n 20 = 1,4880; D pseudoionon: n 20 = 1,5330; D α-ionon: n 20 = 1,4980. D Chiết suất của một chất lỏng nguyên chất hay một hỗn hợp có thành phần xác định là một hằng số ở một nhiệt độ xác định nên người ta dùng chiết suất để nhận biết và đánh giá tinh dầu, xác định độ tinh khiết của chất. c) Độ quay cực của tinh dầu Hầu hết tinh dầu đều có cacbon bất đối xứng nên có đồng phân quang học, nghĩa là nó làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực đi một góc nào đó khi cho ánh sáng phân cực qua tinh dầu. Tuỳ theo tinh dầu tạo 6 ra góc quay bên phải hay bên trái mà ta có tinh dầu quay phải +α hay quay trái –α. Để xác định chiều quay của tinh dầu người ta đo độ quay cực của D-glixeranđehit, nếu cùng chiều thì tinh dầu thuộc dãy D (quay phải) và ngược lại là dãy L (quay trái). Độ quay cực α phụ thuộc vào bản chất của chất, vào nồng độ, vào chiều dài của cuvet đựng tinh dầu để ánh sáng đi qua, vào nhiệt độ khi t đo, vào bước sóng của ánh sáng dùng để đo. [α]D gọi là độ quay cực riêng của chất quang hoạt. t Thông thường người ta xác định [α]D theo công thức sau: t [α ]D = 100α l.C ở đây: α là góc đọc được trên quang cực kế; l là chiều dài cuvet dùng để đo; t là nhiệt độ khi đo; C là nồng độ (số gam tinh dầu trong 100 ml dung dịch). Đối với tinh dầu nguyên chất, người ta thường đo độ quay cực ở o 20 C, ánh sáng vàng vạch D của đèn natri, chiều dài cuvet là 1 dm và C lúc đó chính là tỷ trọng và ta có công thức: α [α ]20 = D d ở đây: α: trị số đo được trên máy; d: tỷ trọng của tinh dầu đã xác định ở 20oC. Độ quay cực riêng của một chất lỏng quang hoạt trong hỗn hợp chất lỏng có chất quang hoạt và thành phần không đổi là một hằng số ở một nhiệt độ xác định và bước sóng xác định nên người ta dùng nó để đánh giá độ tinh khiết của một chất hay thành phần của hỗn hợp. 1.3.2. Các chỉ số hoá học của tinh dầu a) Chỉ số axit của tinh dầu Chỉ số axit của tinh dầu là số miligam KOH dùng để trung hoà hết số axit tự do có trong 1 gam tinh dầu: 5, 61.a Ax = m 7 a: số ml dung dịch KOH 0,1N; m: lượng cân của tinh dầu theo gam. Nếu biết phân tử lượng của axit có trong tinh dầu thì hàm lượng axit có trong tinh dầu là: a.M % axit = 5, 61 M: phân tử lượng của axit. Chỉ số axit cho biết hàm lượng axit trong tinh dầu. b) Chỉ số este Chỉ số este của tinh dầu là số miligam KOH cần để thuỷ phân hết lượng este có trong 1 gam tinh dầu: (v − v ).5, 61 E= 1 2 m v1: số ml KOH 0,1N cho vào để thuỷ phân este; v2: số ml KOH 0,1N dư sau phản ứng; m: lượng cân của tinh dầu theo gam. Chỉ số este cho biết hàm lượng este trong tinh dầu. Chú ý: Để có chỉ số este chính xác, người ta dùng tinh dầu đã xác định chỉ số axit để xác định chỉ số este, hoặc là tinh dầu đã loại hết axit tự do rồi xác định chỉ số este. c) Chỉ số ancol tự do trong tinh dầu Chỉ số ancol tự do trong tinh dầu được tính bằng chỉ số axyl hoá tinh dầu. Chỉ số axyl hoá tinh dầu là hiệu số của chỉ số este sau khi axyl hoá và chỉ số este của tinh dầu. Gọi chỉ số ancol là An, chỉ số este sau khi axyl hoá là E2 và chỉ số este của tinh dầu là E1, ta có chỉ số ancol tự do trong tinh dầu: An = E2 – E1 Chỉ số ancol cho biết hàm lượng ancol trong tinh dầu. d) Chỉ số cacbonyl (anđehit và xeton) Hầu hết các anđehit và xeton tham gia phản ứng oxim hoá: C 8 → O + NH2OH.HCl ⎯⎯ C N OH + HCl Chuẩn độ lượng HCl hình thành trong phản ứng chúng ta biết lượng NH2OH tham gia phản ứng và từ đó suy ra được lượng nhóm cacbonyl có trong tinh dầu tham gia phản ứng. Có thể nói chỉ số nhóm cacbonyl trong tinh dầu là số miligam hiđroxylamin để oxim hoá hết nhóm cacbonyl có trong 1 gam tinh dầu: 33N C= m N: số mol NH2OH.HCl dùng cho phản ứng; m: lượng cân. Chỉ số cacbonyl cho biết hàm lượng hợp chất cacbonyl trong 1 gam tinh dầu. 1.4. Phân loại tinh dầu Người ta thường phân loại tinh dầu theo hai cách: phân loại theo nguồn gốc nguyên liệu để điều chế tinh dầu và phân loại theo thành phần hoá học chính của tinh dầu. 1.4.1. Phân loại tinh dầu theo nguồn gốc Cách phân loại này dựa vào nguyên liệu để sản xuất ra tinh dầu để gọi tên tinh dầu, vì thế tên của tinh dầu xuất phát từ tên nguyên liệu và khi đó mùi của tinh dầu cũng đặc trưng cho mùi của nguyên liệu dùng để sản xuất tinh dầu. Ví dụ tinh dầu của quả chanh gọi là tinh dầu chanh và mùi của tinh dầu chanh cũng là mùi của quả chanh; tinh dầu của hoa bưởi gọi là tinh dầu hoa bưởi và mùi của tinh dầu này là mùi của hoa bưởi; tinh dầu của vỏ cây quế gọi là tinh dầu quế và mùi của tinh dầu quế là mùi của vỏ cây quế… Cách phân loại này vừa nói được loại nguyên liệu dùng để sản xuất tinh dầu, vừa nói được mùi đặc trưng của tinh dầu cũng như của nguyên liệu và như vậy nó rất thuận lợi cho người dùng. 1.4.2. Phân loại tinh dầu theo thành phần hoá học Thành phần hoá học chính của tinh dầu là thành phần có hàm lượng lớn nhất hay tổng các thành phần có hàm lượng lớn và căn cứ thành phần chính người ta gọi tên tinh dầu. Ví dụ: Tinh dầu thảo quả (Amomam aromaticum Roxb) có hàm lượng các dẫn xuất isopren (C5) chiếm tới 80 – 85%, đặc biệt lớn là 9 1,8-cineol nên người ta gọi tinh dầu thảo quả là tinh dầu tecpenoit. Tinh dầu màng tang (Litsea cubeba Lour) cũng là tinh dầu tecpenoit vì thành phần chính của nó là citral, một dẫn xuất oxi của monotecpen, chiếm trên 60%. Nhưng tinh dầu xá xị (Cinnamomum Porecterum Kosterm) là tinh dầu phenylpropanoit (C6-C3). Vì thành phần chính của tinh dầu này là safrol - một dẫn xuất của phenylpropan. Tinh dầu hương nhu trắng (Ocimum Gratisimum L.) có thành phần chính là eugenol (60 – 80%), một dẫn xuất của phenylpropan nên nó cũng là tinh dầu phenylpropanoit. Cách phân loại này không chỉ cho biết thành phần chính của tinh dầu mà còn cho biết thành phần chính thuộc loại hợp chất gì nên rất thuận tiện cho nhận thức và định hướng sử dụng tinh dầu. Tuy vậy, cách phân loại như trên chỉ là tương đối vì có nhiều loại tinh dầu không những có thành phần tecpenoit mà còn có cả thành phần phenylpropanoit nữa. Ví dụ tinh dầu bạch đậu khấu (Mefristica fragram H.), ngoài thành phần tecpenoit như pinerycamphen còn có cả myristixen là dẫn xuất của phenylpropan. 1.4.2.1. Tinh dầu tecpenoit Trong thiên nhiên, số lượng tinh dầu tecpenoit chiếm đại đa số. Nghiên cứu cấu trúc phân tử của tinh dầu tecpenoit, L. Ruzika (1922) đi đến nhận xét rằng tất cả các phân tử của thành phần tinh dầu tecpenoit đều được xây dựng trên cơ sở đơn vị isopren (C5). Nói một cách khác, người ta có thể phân chia khung cacbon phân tử của các thành phần tinh dầu tecpenoit thành các đơn vị isopren (C5) và như thế, tuỳ theo số đơn vị isopren trong cấu trúc phân tử mà người ta chia tecpenoit thành các lớp chất khác nhau: + Hemitecpen được xây dựng từ 1 đơn vị isopren (C5); + Monotecpen được xây dựng từ 2 đơn vị isopren (C10); + Sesquitecpen được xây dựng từ 3 đơn vị isopren (C15); + Đitecpen được xây dựng từ 4 đơn vị isopren (C20); + Sestotecpen được xây dựng từ 5 đơn vị isopren (C25); + Tritecpen được xây dựng từ 6 đơn vị isopren (C30); + Politecpen được xây dựng từ nhiều đơn vị isopren (C5)xn. Đến đây chúng ta thấy thuật ngữ tecpenoit có nghĩa rất rộng, nó bao gồm không những các hợp chất thuộc lớp hemi, mono, sesqui, đi, tri… 10 mà cả các dẫn xuất chứa oxi, các dẫn xuất thoái biến của tecpen như ionon; chòn thuật ngữ tecpen thường chỉ một lớp chất, ví dụ monotecpen, sesquitecpen… và các dẫn xuất của chúng. Tuy vậy, trong sử dụng đôi khi ranh giới này cũng không rõ ràng. L. Ruzika còn nhận xét rằng các đơn vị isopren trong phân tử tecpenoit thường liên kết “đầu đuôi” với nhau: ®u«i ®Çu ®u«i + ®Çu ®u«i ⎯⎯ → ®Çu C5H8 C5H8 C10H16 isopren isopren oximen Phát hiện này vô cùng quan trọng, không những nó thúc đẩy tìm kiếm quy luật chung của sự hình thành các phân tử tecpenoit trong thiên nhiên trên cơ sở các đơn vị isopren mà còn giúp ích rất lớn trong viẹc xác định cấu trúc phân tử của các tecpenoit mới tìm được và còn gợi mở sự tìm kiếm các đơn vị isopren thiên nhiên để tìm ra sự phát sinh sinh học (biogenesis) các tecpenoit. a) Sự phát sinh sinh học các tecpenoit Sự phân lập được axit mevalonic của Folker năm 1956 và các nghiên cứu tiếp theo của Blocklynen, Dopjax đã làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp axit mevalonic và cơ chế chuyển hoá axit này thành các đơn vị isopren sinh học, làm cơ sở cho các quá trình sinh tổng hợp các tecpenoit trong thiên nhiên. Quá trình này được J. Manh (1992) tóm tắt như sau: Đầu tiên là sự ngưng tụ 2 phân tử axetyl-ScoA tạo thành axetoaxetyl-SCoA (I), tiếp theo là sự cộng hợp ái nhân của axetyl-ScoA khác vào phân tử xetoaxetyl-ScoA vừa tạo thành rồi thuỷ phân cho sản phẩm 3-hiđroxy-3-metylglutaryl-SCoA (II). Khử sản phẩm này thành hemithioaxetyl (III) và khử tiếp thành axit 3R-mevalonic (IV), axit này bị photphat hoá, decacboxyl hoá và loại nước để tạo thành isopentenylpyrophotphat (V) (IPP) và đimetylallylpyrophotphat (VI) (DMAPP) hay tạo thành IPP rồi đồng phân hoá thành DMAPP. Các đơn vị isopren hoạt động này là những nguyên liệu cho sinh tổng hợp các tecpenoit trong thiên nhiên. 11 CH3 C H SCoA + CH2 SCoA ⎯⎯⎯ CH3 → C O − HSCoA O C CH2 C O SCoA O (I) CH3 C CH2 C O C SCoA + CH3 O O OH CH khö ⎯⎯ HOOC → (III) HOPP SCoA (II) khö → SCoA ⎯⎯ HOOC OH OH CH2OH (IV) ⎯⎯ → ⎯⎯⎯ HOOC → OH CO → SCoA ⎯⎯ HOOC OH CH2OPP CH2OPP − H2O IPP (V) − CO2 ⎯⎯ → CH2OPP DMAPP (VI) Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp các “isopren hoạt động” b) Các hemitecpen (C5) Các hemitecpen hình thành là do sự chuyển hoá các đơn vị “isopren hoạt động” IPP và DMAPP qua các phản ứng thuỷ phân, hợp nước, oxi hoá, khử hay tác dụng với các hợp chất khác, và như thế bộ khung cacbon của nó chỉ có một đơn vị isopren (C5). Hầu hết chúng là các chất có hoạt tính sinh học, các pheromon giới tính, các chất báo động hay phòng vệ. Ví dụ 2-metyl-3-buten-2-ol (1) là một pheromon tập hợp, nghĩa là khi có mùi của hợp chất này thì các loại côn trùng cánh cứng tập hợp lại thành tốp lớn; 3-metyl-3-buten-1-ol (2) là một pheromon báo động của ong bò vẽ; este 3-metyl-2-pentin-2-buteonal (3) tạo thành trong tuyến nọc độc của ong thợ Vespa Crabro. Sau đây là một số hemitecpen thường gặp: N OH HO O C S O (1) 12 (2) (3) (4) O S HO S (5) (7) (6) S S S (8) (9) Trong thành phần mùi của các loài hoa cũng có một số hemitecpen, khi đó các chất này đóng vai trò là chất dụ dẫn côn trùng mang phấn hoa đực sang hoa cái tạo điều kiện cho nòi giống phát triển. c) Monotecpen (C10) Sinh tổng hợp monotecpen (C10) bắt nguồn từ sự cộng hợp ái điện tử đimetylallylpyrophotphat (C5) vào liên kết đôi của isopentenylpyrophotphat (C5), sau đó loại axit pyrophotphoric (HOPP) tạo thành geranylpyrophotphat (C10) là một chất khởi nguyên của các monotecpen. Chính sự ngưng tụ đầu đuôi này của phân tử đimetylallylpyrophotphat (I) với isopentenylpyrophotphat (II) là cơ sở lý thuyết cho nguyên tắc đầu đuôi của L. Ruzicka. isopenteylpyrophotphat 1 4 3 1 H2 C 3 OPP (I) ®imethylallylpyrophotphat ⎯⎯ → OPP 2 1 CH2 HR HS 4 (II) 4 3 1 CH2 2 OPP 2 4 3 2 OPP HR CH2OPP ⎯⎯⎯ → HOPP HS Geranyl PP (GPP) ⎯⎯ → ←⎯ ⎯ CH2OPP Neryl PP (NPP) Hình 1.3. Sơ đồ sinh tổng hợp tiền chất của monotecpen: GPP và NPP 13 Geranylpyrophotphat (GPP) đồng phân hoá dễ dàng thành các dạng khác nhau theo sơ đồ sau: OPP OPP ⎯⎯ → ⎯⎯ → OPP ⎯⎯ → OPP OPP ⎯⎯ → ⎯⎯ → OPP ⎯⎯ → ⎯⎯ → C¸c tecpen vßng ®¬n vßng ®«i Hình 1.4. Chuyển hoá GPP thành monotecpen Chính sự đa dạng trong đồng phân hoá này mà từ các chất khởi nguyên GPP sinh tổng hợp được trên 500 monotecpen khác nhau, có cả trong các vi khuẩn, vi trùng, vi nấm, tảo, côn trùng thực vật và cả động vật như cá sấu, hải li… Nhưng phổ biến và quan trọng nhất của monotecpen là trong thực vật. Nó có trong hơn 100 họ thực vật và chiếm khoảng 0,01% trọng lượng tươi, chiếm phần lớn mùi của hoa, tinh dầu và turpentin, phổ biến nhất là trong các họ cây hạt kín như orrchidaceae, asteraceae và limiceae. Sau đây là một số khung cacbon cơ sở của monotecpen (C10): (1) 2,6-§imetyloctan 14 (2) Lavandulan (3) Artemizan (4) p-Mentan