GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản
của mọi sinh vật, mà còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong
y học, kĩ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.
Cụ thể, trong bài tiểu luận này chúng em sẽ đề cập đến ỨNG DỤNG CỦA ENZYME
TRONG Y HỌC, TRONG PHÂN TÍCH, NGHIÊN CỨU nhằm cung cấp thêm một số
hiểu biết về vấn đề này.
Trong quá trình làm tiểu luận, chúng em đã rất cố gắng trình bày những kiến thức kỹ thuật
mới và có hệ thống. Tuy nhiên, chắc chắn không thể tránh khỏi sai sót. Chúng em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của cô để rút kinh nghiệm cho những lần sau.
MỤC LỤC
I.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME
II.
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC
II.1 Giới thiệu enzyme chữa bệnh.
II.2 Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh.
II.3 Ứng dụng trong chữa bệnh và sản xuất thuốc.
III.
ỨNG DỤNG ENZYME TRONG PHÂN TÍCH
III.1 Sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất
III.2 Ứng dụng enzyme trong phân tích thực phẩm
III.3 Điện cực enzyme không tan
IV.
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU
V.
MỞ RỘNG
V.1 Ứng dụng khác của enzyme.
V.2 Tình hình sử dụng enzyme trong nước và thế giới.
VI.
KẾT LUẬN
I. GIỚI THIỆU ENZYME:
Enzyme là chất xúc tác cho phản ứng sinh hóa. Bản chất của enzyme là protein. Nhưng
so với chất xúc tác cơ, enzyme có những đặc tính ưu việt hơn:
Phản ứng thực hiện gần như có hiệu quả 100% và không kèm theo phụ phẩm thừa.
Đồng thời có thể xảy ra nhiều phản ứng độc lập khác nhau, không bị rối bởi các sản
phầm phụ.
Vận tốc phản ứng nhanh hơn, cường độ xúc tác mạnh hơn.
Điều kiện phản ứng ôn hòa, đại đa số xảy ra ở môi trường trung tính.
Các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lý và tiết kiệm nhất, tiêu tốn năng lượng là tối
thiểu.
Một đặc tính rất quan trọng nữa của enzyme là trong quá trình thực hiện phản ứng nó
không bị phá hủy. Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do và tiếp tục xúc
tác các phân tử cơ chất mới.
Chính vì vậy enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và kỹ thuật.
Sau đây, chúng ta sẽ tìm hiểu sâu hơn về ứng dụng của enzyme trong y học, trong phân tích,
nghiên cứu.
II. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC
II.1 Giới thiệu enzym chữa bệnh
Enzym cũng như một số chất dùng trong chữa bệnh cho người và gia súc có
những đặc tính không phù hợp chung như sau:
Khối lượng phân tử lớn, khó qua màng tế bào.
Dễ dàng bị phân huỷ trong đường tiêu hoá.
Dễ bị mất hoạt tính sinh học do hoạt động ức chế của các chất hiện diện trong
hệ dịch và trong mô.
Có thể biểu hiện như một kháng nguyên.
Tuy nhiên, enzym cũng có những đặc tính riêng, được sử dụng như một loại thuốc chữa
bệnh có hiệu quả.
II.2 Ứng dụng của enzym trong chuẩn đoán bệnh
II.2.1 Ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp:
- Phương pháp xác định điểm cuối (end-point methods)
- phương pháp đo tốc độ phản ứng (measurement of reaction rate)
Phương pháp xác định điểm cuối
Nguyên tắc: khi cho enzym tác động vào cơ chất, cơ chất sẽ giảm và sản phẩm
cuối sẽ tăng lên. Ta có thể xác định được những chỉ số này.
Đối với nồng độ cơ chất thấp hơn giá trị của của hằng số Michaelis (Km), tốc độ
phản ứng tuân theo phương trình sau:
= es x /Km
Thời gian cần cho kết thúc phản ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và hằng số
(Km) của enzym sử dụng.
Phương pháp xác định glucose với glucose-oxydase
Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hoá bởi glucose-oxydase (EC.1.1.3.4),
tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau:
glucose + O2 + H2O glucose-oxidase 10 UI/ml
gluconate + H2O2
Trong phản ứng thứ hai peroxide hydro, dưới tác dụng của enzym horse-radish
peroxidase (EC.1.11.1.7) sẽ tạo màu theo phản ứng sau:
H2O2 + chromogen horse-radish peroxidase màu + H2O
Trong phân tích này, 2,2’-azino-bis (3-ethyl 2,3-dihydrobenzothiazol sulfonate
(ABTS) ) được sử dụng như chromogen.
Phương pháp xác định urea
Urea bị thuỷ phân bởi urease (EC.3.5.3.1) ở 0.7 UI/ml. Và amoniac được tạo
thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase (EC.1.4.1.3) có hoạt tính 6.2 UI/ml tác
động.
Urea + H2O
2NH3 + CO2
2-Cetoglutarate + 2NH4+ + 2NADH
2L-glutamate + 2NAD+ + 2H2O
Phương pháp động học (kinetic methods)
Phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km
Xác định glucose:
D–glucose + ATP
D–glucose–6–phosphate + NADP+
D–glucose–6–phosphate + ADP
D–glucono––lactose –
6 – phosphate + NADPH + H+
Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase(EC.2.7.1.1), sau đó
glucose–6–phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động của glucose–6–phosphate
dehydrogenase (EC.1.1.1.49). Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng máy
quang điện.
Xác định triglyceride:
Triglyceride + 3 H2O
glycerol + 3 acid béo
Glycerol + ATP
glycerol–3–phosphate + ADP
ADP + phosphoenolpyruvate
ATP + pyruvate
Pyruvate + NADH + H+
L–lactate + NAD+
Chất béo được thủy phân bằng lipase(EC.3.1.1.3) carboxylesterase (EC.3.1.1.1)
tạo ra glycerol và sẽ được phosphoryl hóa bởi glycerol kinase(EC.2.7.1.30), ADP
tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phosphoenolpyruvate và
pyruvate kinase(EC.2.7.1.40), cuối cùng pyruvate được hydrogen hóa bởi L–
lactate dehydrogenase (EC.1.1.1.27) và NADH giảm dần.
II.1.2 Xác định hoạt tính của enzym
Xác định hoạt tính của alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1)
4–nitrophenylphosphate + H2O
phosphate + 4–nitrophenolate
Ở pH tối ưu 9.8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ tăng theo độ hấp thụ
ở bước sóng 405 nm.
Xác định hoạt tính của creatine kinase (EC.2.7.3.2)
creatine phosphate + ADP
createne + ATP
ATP tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzym creatine kinase.
II.1.3 Thực hành miễn dịch
Enzym được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên-kháng thể, tạo
thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng máy so màu quang điện,
hùynh quang để xác định phản ứng.
a) Alkaline phosphatase
Enzym này được ứng dụng trong phản ứng miễn dịch. Để xác định hoạt tính
alkaline phosphatase có thể sử dụng máy huỳnh quang với 4–
methylumbelliferyphosphate làm cơ chất. enzym này thường được sử dụng
với hoạt tính 2500UI/mg ở nhiệt độ 370C
b) -galactosidase (EC.3.2.1.23)
Hoạt tính của -galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4methylumbelliferyl--galactosidase hoặc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactoside.
c)
Horseral peroxidase (EC.1.11.1.7)
Enzym này chứa hai đến ba nhóm họat động aminE trong phân tử và chứa
12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzym này bằng máy quang điện
với cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis hay 3ethylbenzothiazoline-sulfonate (ABTS)
Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chấtlà 3,3’ hay 5,5’-tetramethyl
benzidine.
II.3 Ứng dụng trong chữa bệnh và sản xuất thuốc:
Hiện nay, enzym được sử dụng chủ yếu chữa các bệnh như sau:
Enzym như chất cho thêm vào cơ thể để chữa bệnh kém tiêu hoá.
Enzym được sử dụng như chất làm sạch vết thương và làm lành vết
thương.
Enzym được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch.
Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết
thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làmthuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần
của các loại thuốc dùng trong daliễu và mỹ phẩm…
Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trườngdinh dưỡng để
nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất khángđộc… Ngoài ra người ta c.n dùng
enzyme protease để cô đặc và tinh chếcác huyết thanh kháng độc để chữa bệnh.
Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C,ATP, carboxylase
để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh,
phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa.
Phát hiện enzyme giúp điều trị bệnh Alzheimer
Các nhà khoa học Mỹ vừa phát hiện một enzyme có thể
chữa lành các tế bào não bị bệnh Alzheimer - một chứng
bệnh mất trí nhớ.
Nhóm nghiên cứu tại Trường ĐH Columbia đặt tên cho
enzyme này là Uch-L1.
Alzheimer là căn bệnh ăn mòn trí nhớ con người. Theo nhóm
nghiên cứu, não người bị tác động bởi bệnh này có khuynh
hướng giảm Uch-L1.
Trong nghiên cứu của mình, nhóm đã tiêm Uch-L1 vào não của chuột thí nghiệm bị bệnh
Alzheimer. Kết quả họ phát hiện enzyme này đã giúp trí nhớ của loài gặm nhấm này phục hồi.
Điều đặc biệt là enzyme này không tiêu diệt các protein amyloid beta bám ở não - được cho là
nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer - mà làm cho nó trở nên bình thường và không có hại cho trí
nhớ. Theo nhà nghiên cứu Ottavio Arancio, điều này rất quan trọng bởi protein amyloid beta giữ
một vai trò quan trọng trong cơ thể.
Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu hơn trước khi đưa enzyme này vào
thử nghiệm ở con người. Dù vậy, họ tỏ ra rất lạc quan bởi hiệu quả điều trị của nó.
Tính đến nay đã có hàng triệu người trên thế giới mắc bệnh Alzheimer, trong đó chỉ riêng tại Mỹ
có 4,5 triệu bệnh nhân, và số lượng người bệnh dự kiến sẽ bùng nổ trong vài thập kỷ tới khi số
người già tăng lên, trong khi một số loại thuốc điều trị hiện có hầu như ít có tác dụng. Kết quả
nghiên cứu này có thể giúp các nhà khoa học phát triển loại thuốc mới điều trị bệnh Alzheimer
hiệu quả hơn.
Nhận dạng enzym chống dị ứng nặng
Một nghiên cứu của Canada vừa khẳng định rằng nồng độ của một enzym trong máu ảnh
hưởng đến tính nghiêm trọng của các phản ứng dị ứng. Vai trò của enzym này từng được
chứng minh ở loài động vật, nhưng nghiên cứu mới trên lần đầu tiên khẳng định hiện tượng này
ở người.
Các nhà nghiên cứu thuộc các trường Đại học Toronto và Manitoba đã chứng minh rằng những
người có nồng độ enzym acyl-hydrolase PAF trong máu thấp bị phản ứng dị ứng nặng hơn so
với những người có nồng độ enzym này thấp hơn.
Theo tác giả nghiên cứu Peter Vadas, enzym này tiêu hủy một hóa chất được gọi là thành phần
hoạt hóa tiểu cầu. Hóa chất này được hình thành trong quá trình phản ứng dị ứng. Những người
có nồng độ enzym acyl-hydrolase PAF thấp không thể làm trung hòa hóa chất PAF nhất để ngăn
ngừa phản ứng dị ứng nặng.
Phát hiện này có thể giúp điều chế những loại thuốc chống dị ứng do thức ăn gây nguy cơ chết
người tiềm ẩn như đậu phộng, các loại hải sản, hay một số phản ứng do thuốc hoặc vết chích
côn trùng.
III. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH:
III.1 Sử dụng enzyme để phân tích, định lượng các chất:
Có thể xác định các chất đặc biệt với hàm lượng rất thấp và bị lẫn với các chất
tương tự về mặt hóa học, mà với phương pháp hóa học khó lòng xác định định
được chính xác.
- Có thể phân tích các chất không bền, sử dụng enzyme để phân tích có thể tiến
hành ở những điều kiện nhẹ nhàng về pH ( gần trung tính), nhiệt độ ( gần nhiệt độ
phòng).
- Có thể sử dụng enzyme để định lượng cơ chất, coE, các chất hoạt hóa, các chất
kìm hãm enzyme.
III.1.1 Những nguyên tắc chung khi sử dụng enzyme để phân tích:
Xác định cơ chất enzyme: thông qua việc xác định sản phẩm được tạo thành dưới tác
dụng của enzyme. Do đó phải tạo điều kiện như thế nào để toàn bộ cơ chất được chuyển
hóa thành sản phẩm, và co sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc đầu phản ứng với nồng
độ chất cần phân tích, cụ thể như sau:
- Nồng độ enzyme phải đủ cao.
- Nồng độ cơ chất đủ thấp để đảm bảo phản ứng tiến hành là pản ứng bậc một, chỉ
phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cần xác định. Khi cần thiết phải thử với các nồng
độ cơ chất khác nhau để lựa chọn nồng độ thích hợp đạt yêu cầu phân tích.
Nếu sử dụng enzyme cần coE thì nồng độ coE phải đủ lớn để đảm bảo không làm thay
đổi đặc tính của phản ứng bậc một.
Phải đảm bảo sản phẩm phản ứng ( hoặc đồng sản phẩm phản ứng, ví dụ NADPH,
NADH đối với cá phản ứng trong đó NADP+ hoặc NAD+ là cơ chất hoặc cofactor) hoàn
-
toàn không có mặt khi phản ứng chưa bắt đầu. Nếu như vậy thì phản ứng chỉ phụ thuộc
vào nồng độ cơo chất ban đầu ( ví dụ NAD+ hoặc NADP+) mà ta cần phân tích, và có thể
đo trực tiếp sản phẩm được tạo thành ( đo độ hấp thụ của NADH ở 340 nm, vì NAD+
hoặc NADP+ không hấp thụ ở bước sóng này) để tính nồng độ cơ chất ban đầu.
Nói chung việc sử dụng enzyme để định lượng cơ chất của nó được tiến hành thuận lợi
khi sản phẩm của phản ứng có thể được định lượng dễ dàng.
III.1.2 Một số ví dụ:
- Xác định cơ chất sử dụng amylase (sau đó kết hợp với thủy ngân bằng acid) để
định lượng tinh bột sẽ cho kết quả chính xác hơn khi dùng acid (vì một số
polysaccharide khác như hemicellululose cũng bị thủy phân bởi acid ở các điều
kiện giống với tinh bột).
- Xác định coE, vì coE có vai trò như là chất đồng cơ chất nên có thể định lượng
coE theo cách hoàn toàn giống như định lượng cơ chất.
- Xác định chất hoạt hóa enzyme: có thể sử dụng enzyme để định lượng chất hoạt
hóa của nó trong trường hợp nó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc đầu phản
ứng với một khoảng nồng độ thấp của chất hoạt hóa, ở nồng độ enzyme, cơ chất
và nồng độ coE giữ cố định khi tiến hành phản ứng. Ở nồng độ chất hoạt hóa cao,
toàn bộ phân tử enzyme được hoạt hóa, vận tốc đầu phản ứng (vo) đạt cực đại.
Lập đồ thị chuẩn biểu diễn ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến v, từ đó tính nồng độ
của chất hoạt hóa trong dung dịch phân tích.
V0
Nồng độ chất hoạt hoá
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của v0 vào nồng độ chất hoạt hoá
Nồng độ E,S và coE (nếu có) giữ cố định
Dựa vào đồ thị ta thấy nên pha loãng dung dịch có chứa chất hoạt hóa cần phân tích
sao cho vo nằm trong phần thẳng của đường biểu diễn để có thể có được kết quả phân
tích chính xác.
Ví dụ: Mn2+ là chất hoạt hóa isocitrate dehydrogenase, sử dụng enzyme này có thể xác
định chính xác hàm lượng Mn2+ ở nồng độ rất thấp.
- Xác định các chất kìm hãm enzyme, tiến hành xác định ở những điều kiện đã nêu
giống như khi xác định chất hoạt hóa, lập đồ thị chuẩn với các nồng độ I khác
nhau. Tiến hành xác định chất kìm hãm (I) trong dung dịch nghiên cứu, đối chiếu
với đồ thị chuẩn và tính hàm lượng I trong mẫu nghiên cứu. Có thể lập đồ thị
chuẩn theo 2 cách: vo đối với [I], hoặc tính % bị kìm hãm theo sự tăng nồng độ I.
Đôi khi người ta cũng dùng I50 để biểu diễn nồng độ các chất kìm hãm làm giảm 50% hoạt độ
ở những điều kiện xác định.
Ví dụ: sử dụng cacboxyl esterase của gan để định lượng fluoride trong dung dịch có lượng lớn
phosphate ( vì phosphate ảnh hưởng đến việc xác định chính xác fluoride khi dùng phương
pháp hóa học).
Nguyên lý thử như sau: enzyme acetylcholinesterase (AchE) xúc tác thủy phân cơ chất
acetylcholin thành cholin và axetic. Acid acetic sẽ phản ứng với chất chỉ thị màu màu vàng.
Nếu mẫu phân tích có thuốc trừ sâu lẫn hữu cơ, cacbamat sẽ kìm hãm hoạt động của AchE,
hàm lượng acid acetic giảm, màu sẽ thay đổi. Dựa vào sự đổi màu so với mẫu đối chứng
(không có thuốc trừ sâu) hoặc dựa vào thang màu chuẩn có thể định tính hoặc bán định lượng
thuốc trừ sâu trong mẫu phân tích.
Nếu enzyme bị kìm hãm đặc hiệu, nhạy với một chất nào đó, có thể dùng enzyme để phát
hiện và định lượng chất đó. Ví dụ: sử dụng acetylcholineesterase để phát hiện dư lượng thuốc
trừ sâu nhóm phospho hữu cơ. Các chất độc thần kinh,…
Do enzyme có thể bị kìm hãm hoặc hoạt hóa bởi nhiều chất khác như ion kim loại do đó khi
sử dụng enzyme để định lượng các chất cần lưu ý đến các chất này mới có kết quả chính xác
được.
%Kìm hãm
100
Không thuận nghịch
V0
Thuận nghịch
Thuận nghịch
Không thuận nghịch
a)
b)
[I]
[II]
Lập đồ thị chuẩn để xác định chất kìm hãm enzyme trong dung dịch nghiên cứu
a) vo đối với [I]
b) % hoạt độ bị kìm hãm ở các chất [I] khác nhau.
Vo vận tốc đầu phản ứng không có I, voi vận tốc đầu phản ứng có, xác định ở cùng điều kiện
giống nhau. Đồ thị trên cũng cho thấy: khi sử dụng enzyme để định lượng các chất kìm hãm, cần
pha loãng dung dịch sao cho có được sự phụ thuộc tuyến tính giữa vận tốc với nồng độ chất kìm
hãm (đoạn đầu của đường biểu diễn).
Các I không thuận nghịch, theo định nghĩa sẽ làm mất hoàn toàn (kìm hãm 100%) hoạt độ
enzyme khi nồng độ của nó đủ lớn, còn đối với chất I thuận nghịch thì dù nồng độ cao bao nhiêu
cũng không kìm hãm 100% được.
III.2 Ứng dụng của enzyme trong phân tích thực phẩm:
III.2.1. Xác định cacbohydrate
Trong thực phẩm, cacbohydrate chieám khối lượng lớn và đóng vai trò quan trọng
trong dinh dưỡng. Các loại đường là những đối tượng được phân tích thường xuyên.
Glucose : được xác định bằng phương pháp enzym hexokinase. Phản ứng của
quá trình đó xảy ra như sau:
D-glucose + ATP
hexokinase
ADP + glucose-6-phosphate
glucose-6-phosphate + NADP+ glucose-6-phosphate dehydrogenase
D-glucose-6-phosphate + NADPH + H+
Fructose : enzym hexokinase cũng tác động lên fructose. Ta có thể xác định
fructose sau khi xác định glucose.
D-glucose + ATP
ADP + fructose-6-phosphate
fructose-6-phosphate glucose phosphate isomerase glucose-6-phosphate
Galactose : được xác định theo phản ứng sau
D-galactonic acid + NADH + H+ galactose dehydrogenase D-galactose + NAD+
Mannose : xác định mannose tự do theo phương trình phản ứng sau
D-mannose + ATP
hexokinase
ADP + mannose-6-phosphate
mannose-6-phosphate phosphomannose isomerase fructose-6-phosphate
Saccharose : thường không có trong tế bào động vật.
Saccharose + H2O P–fructosidase D-glucose + D-fructose
Maltose : xác định maltose theo phương trình phản ứng sau
Maltose + H2O
Lactose : thường có trong sữa.
-glucosidase
2-D-glucose
-galactosidase
Lactose + H2O
D-galactose + D-glucose
Rafinose : rafinose có trong củ cải đường.
-galactosidase
Rafinose + H2O
D-galactose + saccharose
Tinh bột : tinh bột có nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài vi sinh vật.
Xác định tinh bột theo phương trình phản ứng sau.
Tinh bột + (n-1)H2O
amyloglucosidase
n D-glucose
III.2.2. Xác định acid hữu cơ
Acid hữu cơ và muối của chúng có nhiều trong nguyên liệu và sản phẩm thực
phẩm. Chúng đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý người, động vật, thực vật
và vi sinh vật. Chúng còn được tạo ra do quá trình lên men.
Acetic acid : Thuộc nhóm acid bay hơi, người ta sử dụng enzym để xác định
acetic acid. Acetate có nhiều trong vang.
Acetate + ATP + CoA
acetyl-CoA-synthetase
Acetyl-CoA + AMP +
Pyrophosphate
citrate synthetase
Acetyl-CoA + oxaloacetate + H2O
citrate + CoA
L-malate + NAD+ L-malate dehydrogenase
oxaloacetate + NADH + H+
Phản ứng sau cùng được xem như phản ứng chỉ thị.
Ascorbic acid : giống như vitamin, ascorbic acid đóng vai trò sinh học lớn
trong sinh lý người và động vật. Chúng được sử dụng như chất phụ gia trong thực phẩm.
Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid.
L-ascorbic acid (XH2) + MTT
PMS
dehydro ascorbic acid (X) +
formazan + H+
PMS: 5-methylphenazinium sulfate
MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Ascorbate được oxy hóa tiếp:
L-ascorbic acid
ascorbate oxidase
dehydro ascorbic acid + H2O
Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả, trong rau, quả, trong sữa,
trong sản phẩm thịt.
dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử)
L-ascorbic acid +
dithiothreitol (chất oxy hóa)
Aspartic acid : có nhiều trong nước táo và được xác định theo phản ứng sau.
GOT
L-aspartate + -oxoglutarate
oxaloacetate + L-glutamate
LMDH
Oxaloacetate + NADH + H+
L-malate + NAD+
Citric acid : đóng vai trò cơ bản trong trao đổi chất ở sinh vật. Chúng có
nhiều trong trái cây, trong sữa và được xác định theo phươngtrình sau.
Citrate citrate (pro-35) lyase oxaloacetate + acetate
Ascorbic acid : giống như vitamin, ascorbic acid đóng vai trò sinh học lớn
trong sinh lý người và động vật. Chúng được sử dụng như chất phụ gia trong thực phẩm.
Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid.
L-ascorbic acid (XH2) + MTT
PMS
dehydro ascorbic acid (X) +
formazan + H+
PMS: 5-methylphenazinium sulfate
MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Ascorbate được oxy hóa tiếp:
L-ascorbic acid
ascorbate oxidase
dehydro ascorbic acid + H2O
Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả, trong rau, quả, trong sữa,
trong sản phẩm thịt.
dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử)
L-ascorbic acid +
dithiothreitol (chất oxy hóa)
Aspartic acid : có nhiều trong nước táo và được xác định theo phản ứng sau.
GOT
L-aspartate + -oxoglutarate
oxaloacetate + L-glutamate
Oxaloacetate + NADH + H+
LMDH
L-malate + NAD+
Citric acid : đóng vai trò cơ bản trong trao đổi chất ở sinh vật. Chúng có nhiều
trong trái cây, trong sữa và được xác định theo phươngtrình sau.
Citrate
citrate (pro-35) lyase
oxaloacetate + acetate
Formic acid : là sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn và của nấm sợi. Acid này
được xem như là chất bảo quản thực phẩm nhưng phải tuân thủ nghiêm ngặt an
toàn và vệ sinh thực phẩm. acid formic được xác định theo phương trình sau.
Formate + NAD+ + H2O formate dehydrogenase hydrogencarbonate +NADH
+ H+
Gluconic acid : sử dụng enzym gluconate kinase để xác định.
D-gluconate + ATP
gluconate kinase
D-gluconate-6-phosphate + NADP+
D-gluconate-6-phosphate + ADP
6.PGDH
D-ribulose-5-phosphate + NADPH + H+ + CO2
(6.PGDH : 6-phosphogluconic acid dehydrogenase)
Glutamic acid : enzym được sử dụng là glutamate dehydrogenase
L-glutamate + NAD+ + H2O glutamate dehydrogenase -oxoglutarate + NADH
+ NH4+
3-hydroxybutyric acid : Trong trứng có nhiều 3-hydroxybutyric acid. Enzym sử
dụng là 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (3-HBDH)
D-3-hydroxybutyrate + NAD+ 3-HBDH
acetoacetate + NADH + H+
Isocitric acid : sử dụng enzym isocitrate dehydrogenase .
D-isocitrate + NADP+ isocitrate dehydrogenase
-oxoglutarate + NADH
+ CO2 + H+
Lactic acid : lactic acid được tạo ra nhiều trong quá trình lên men.
L-lactate + NAD+ L-lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH + H+
D- lactate + NAD+ L-lactate dehydrogenase pyruvate + NADH + H+
Malic acid : có nhiều trong nho, trong rau, quả khác. Sử dụng enzym malate
dehydrogenase và NAD+
L-malate + NAD+ malate dehydrogenase
GOT
Oxaloacetate + L-glutamate
oxaloacetate + NADH + H+
L-aspartate + -oxoglutarate
Oxalic acid : oxalid acid đóng vai trò quan trọng trong hấp thụ calcium của cơ
thể người.
oxalate dehydrogenase
Oxalate
formate + CO2
Pyruvic acid : là một acid cơ bản trong chu trình chuyển hóa ở mọi cơ thể.
Enzym được sử dụng là L-lactate dehydrogenase
Pyruvate + NADH + H+
L-lactate dehydrogenase
L-lactate + NAD+
Succinic acid : là một acid quan trọng trong chu trình tricarboxylic acid.
succinyl-CoA-synthetase
Succinate + ITP + CoA
pyruvate kinase
IDP + PEP
IDP + Succinyl-CoA + P
ITP + pyruvate
III.2.3. Xác định alcohol
Ethanol : ethanol là sản phẩm lên men đường bởi nấm men. Ngoài những
phương pháp bình thường, người ta còn dùng enzym để xác định ethanol.
Ethanol + NAD+ alcohol dehydrogenase (ADH) acetaldehyde + NADH + H+
Glycerol : glycerol phổ biến nhiều trong thiên nhiên và có nhiều trong quá
trình lên men.
Glycerol + ATP
ADP + PEP
glycerol kinase
pyruvate kinase
glycerol-3-phosphate + ADP
ATP + pyruvate
Alcohol đường :
Người ta xác định sorbitol bằng enzym sorbitol dehydrogenase.
D-sorbitol + NAD+ sorbitol dehydrogenase D-fructose + NADH + H+
Tương tự, người ta cũng xác định xylitol bằng enzym sorbitol dehydrogenase
Xylitol + NAD+ sorbitol dehydrogenase xylulose + NADH + H+
III.3.4. Xác định các thành phần khác
Cholesterol : cholesterol là một steroid có ý nghĩa rất lớn trong sinh lý người
và động vật. Các phản ứng xác định cholesterol như sau.
Cholesterol + O2 cholesterol oxidase cholestenone + H2O2
catalase
H2O2 + methanol
formaldehyde + 2H2O
Formaldehyde + NH4+ + 2 acetylacetone
lutidine + 3H2O
Triglyceride : xác định triglyceride bằng esterase và lipase.
Triglyceride + 3H2O esterase và lipase
glycerol + 3 acid béo
Acetaldehyde : đây là chất tạo mùi cho bia, yaourt và các loại nước giải khát.
Acetaldehyde + NAD+ + H2O acetaldehyde dehydrogenase
acetic acid +
NADH + H+
Amoniac : người ta sử dụng enzym glutamate dehydrogenase
-oxoglutarate + NADH + H+ + NH4+
glutamate dehydrogenase
L-glutamate + NAD+ + H2O
Nitrate: enzym được sử dụng để xác định nitrate là nitrate reductate.
Nitrate + NADPH + H+ nitrate reductate nitrite + NADP+ + H2O
Sulfite : enzym được ứng dụng để xác định sulfite là sulfite oxidase.
SO32- + O2 + H2O sulfite oxidase SO42- + H2O2
H2O2 + NADH + H+ NADH-peroxidase
2H2O + NAD+
Creatine và Creatinine : hai chất này có trong cơ.
Creatinine + H2O creatininase creatine
Creatine + ATP creatine kinase creatine phosphate + ADP
Lecithin : (phosphotidylcholine) là một phospholipide quan trọng.
Lecithin + H2O phospholipase C
1,2-diglyceride + phosphorylcholine
Phosphorylcholine + H2O alkaline phosphatase choline + Pi
Choline + ATP choline kinase phosphorylcholine + ADP
Urea : người ta sử dụng urease để xác định urea.
Urea + H2O urease 2NH3 + CO2
III.3. Điện cực enzyme không tan
III.3.1. nguyên tắc cấu tạo và hoạt động:
Thành phần cấu tạo sinh học của điện cực này là enzyme, được cố định trên bề mặt của
điện cực, đáp ứng với nồng độ của một trong các cơ chất, hoặc các sản phẩm của phản ứng
do enzyme xúc tác.
Enzyme có thể là lớp gel ( enzyme không tan giữ trong gel) mỏng bao xung quanh cảm
biến điện hóa hoặc tiếp xúc với cảm biến này nhờ màng thấm chọn lọc. Cơ chất đi qua lớp
gel hay màng chọn lọc, tiếp xúc với enzyme và chuyển hóa thành sản phẩm. Ví dụ: phản ứng
oxi hóa-khử các chất do oxidoreductase xúc tác, các điện tử của phản ứng được vận chuyển
từ chất phản ứng đến điện cực, tạo ra tín hiệu điện. Tín hiệu điện có thể được phát hiện bằng
cách đo dòng điện (amperometric biosensor), hoặc đo điện thế (potentiometric biosensor).
III.3.2. Một số ví dụ về ứng dụng điện cực enzyme để phân tích các chất:
Điện cực enzyme được dùng để xác định nồn độ nhiều chất khác nhau như: glucose, một
số acid hữu cơ (acid acetic, acid pyruvic, acid lactic, acid fomic,…) amino acid, các lipid,
penicillin, và alcohol, … trong số các biosensor ứng dụng trong lâm sàng, glucose biosensor
được ứng dụng rộng rãi nhất để xác định glucose trong máu.
IV. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU:
Do enzyme có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống nên nghiên cứu enzyme là một
trọng tâm của sinh hóa học, dẫn đến môn enzyme học. Có người cho rằng : “sự sống có thể
định nghĩa là hệ thống tích hợp, được điều phối của các phản ứng enzyme”.
Nghiên cứu enzym của ếch để điều trị ung thư
Theo các nhà khoa học Anh và Mỹ, một enzyme trong tế bào trứng ếch có triển vọng rất
lớn trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư não. Liệu pháp mới này đang được thử
nghiệm tiền lâm sàng.
Các nhà nghiên cứu thuộc Trường Đại học Bath (Anh) và công ty Alfacell (Mỹ) đã phân lập và
thử nghiệm thành công amphinase, một phiên bản của enzyme ribonuclease từ tế bào trứng của
loài ếch Northern Leopard (Rana pipiens).
Ribonuclease là một loại enzyme có trong tất cả mọi sinh vật và có nhiệm vụ thu dọn các dải tế
bào trôi tự do của phân tử RNA (ribonucleic acid) bằng cách thâm nhập vào phân tử này và cắt
nó ra thành những đoạn ngắn.
Ở động vật hữu nhũ, hoạt động của enzyme này được kiểm soát chặt chẽ bằng các chất ức chế
nên nó không gây nguy hại gì. Nhưng amphinase là một ribonuclease của ếch – một loài động
vật lưỡng cư chứ không phải loài hữu nhũ – nên amphinase vượt qua được các phân tử gây ức
chế của loài hữu nhũ để phá hủy tế bào ung thư.
Kết quả thử nghiệm cho thấy amphinase có khả năng nhận ra một lớp đường đặc thù trên tế
bào ung thư và bám chặt vào đó, rồi tìm cách thâm nhập vào bên trong tế bào để tấn công.
Khi vào được bên trong tế bào ung thư, phân tử amphinase sẽ phá vỡ hoạt động bình thường
của tế bào và giết chết tế bào bằng cách làm đứt rời các chuỗi RNA – chất liệu di truyền có
nhiệm vụ chuyển tải những chỉ thị của DNA đến cơ quan sản xuất protein trong tế bào.
Loại enzyme có trong loài ếch Northern Leopard có tác dụng
điều trị ung thư, nhất là ung thư não. (Ảnh: Biology.mcgill.ca)
Mặc dù có khả năng tiềm tàng trong điều trị nhiều bệnh ung thư, nhưng amphinase được đánh
giá là mở ra cơ hội lớn nhất trong điều trị ung thư não – một loại ung thư mà chỉ có thể được can
thiệp bằng phẫu thuật và hóa trị liệu rất phức tạp.
Nhóm nghiên cứu hy vọng rằng amphinase sẽ dẫn đến việc ra đời của loại thuốc đầu tiên trị ung
thư não.
Theo giáo sư Ravi Acharya, thuộc Khoa Sinh học và Hóa sinh học của Đại học Bath, kết quả thử
nghiệm cho thấy amphinase “có khả năng rất cao trong việc tìm kiếm, thâm nhập và phá hủy các
khối ung thư.” Ông nói: “Đây là một phân tử hoạt động rất mạnh mẽ. Nó giống như một viên đạn
kỳ diệu của Đấng Tạo hóa có khả năng nhắm vào tế bào ung thư để tiêu diệt”. Theo ông, enzyme
này “có thể tổng hợp được dễ dàng trong phòng thí nghiệm và có triển vọng trở thành một loại
thuốc điều trị ung thư trong tương lai”.
Theo nhóm nghiên cứu, thuốc được bào chế từ amphinase sẽ được tiêm trực tiếp vào vùng
có khối u và không gây hại cho các tế bào lành mạnh xung quanh, vì amphinase chỉ phát
hiện và tấn công tế bào ung thư mà thôi.
Tuy nhiên, giáo sư Acharya cho biết: “Việc thử nghiệm amphinase chỉ mới ở giai đoạn đầu, và
phải mất vài năm nữa mới có thể có một loại thuốc như thế. Và thuốc đó phải qua những thử
nghiệm lâm sàng qui mô lớn để được chứng minh là an toàn và hiệu quả trong điều trị ung thư”.
Amphinase là phiên bản thứ 2 của enzyme ribonuclease do Alfacell Corporation phân lập từ
trứng ếch Rana pipiens. Phiên bản đầu tiên là ranpirnase, hiện đang được thử nghiệm lâm sàng
giai đoạn 3 trong điều trị u trung biểu mô ác tính không thể cắt bỏ được – một dạng hiếm và nguy
hiểm của ung thư phổi. Hai giai đoạn thử nghiệm trước đó tập trung vào ung thư phổi không phải
tế bào nhỏ và các khối u cứng khác.
Amphinase là phiên bản thứ 2 của enzyme ribonuclease được
phân lập từ trứng ếch Northern Leopard. (Ảnh: Wikipedia)
Ông Kuslima Shogen, Chủ tịch kiêm Tổng giám đốc Alfacell Corporation, cho biết “ông rất hài
lòng trước thành quả tuyệt vời mà giáo sư Acharya và các cộng sự đã đạt được”. Ông cho rằng:
“Nghiên cứu này rất quan trọng đối với việc tìm hiểu và phát triển những liệu pháp mới dựa trên
ribonuclease, mở ra cơ hội điều trị cho người bị ung thư hoặc mắc các bệnh nguy hiểm khác”.
Hiện nay, Alfacell Corporation đang tiếp tục các thử nghiệm tiền lâm sàng đối với Amphinase
trước khi chuyển sang thử nghiệm lâm sàng trong thời gian tới.
Nghiên cứu này vừa được công bố trên Journal of Molecular Biology (Tập san Sinh học Phân tử)
của tập đoàn Elsevier, có trụ sở ở Amsterdam, Hà Lan.
Máy Tính Làm Từ ADN Và Enzym
Các nhà khoa học Israel vừa chế tạo ra một máy tính có thể thực hiện 330.000
tỷ phép tính/giây, gấp 100.000 lần tốc độ của PC nhanh nhất hiện nay. Chạy bằng ADN
nên máy được ghi vào sách kỷ lục Guinness là "thiết bị điện toán sinh học nhỏ nhất thế
giới".
Ngay từ năm 2002, các nhà nghiên cứu của Viện khoa học Weizmann ở thị xã
Rehovot (miền Trung Israel) đã sản xuất được máy tính từ các phân tử ADN và enzyme
thay vì microchip. Lần này, họ chỉ dùng một phân tử ADN để cung cấp dữ liệu đầu vào
và năng lượng cho thiết bị. Nếu nhìn bằng mắt thường, máy tính ADN trông giống dung
dịch nước. 1.000 tỷ thiết bị có thể nằm gọn trong một giọt nước.
Cấu trúc của máy tính sinh học gồm ADN đóng vai trò phần mềm và enzyme giữ
vai trò phần cứng. Phản ứng hoá học giữa các phân tử trong ống nghiệm cho phép nhà
khoa học thực hiện những phép tính đơn giản. Nhà khoa học ra lệnh cho thiết bị làm
việc bằng cách thay đổi thành phần phân tử ADN. Thay vì xuất hiện trên màn hình, kết
quả được phân tích thông qua một kỹ thuật cho phép nhà khoa học nhận biết chiều dài
của phân tử ADN đầu ra.
Hiện nay, máy tính ADN chỉ thực hiện được các phép tính đơn giản và chưa có ứng
dụng thực tế. Theo trưởng nhóm nghiên cứu, Ehud Shapiro, thiết bị có thể kiểm tra
danh sách con số, trả lời câu hỏi dạng "có/không"...
Tuy nhiên, xét về tốc độ và dung lượng lưu trữ, máy tính ADN vượt xa thiết bị truyền
thống. Các nhà khoa học cho biết phân tử ADN trong nhân của mọi tế bào có thể chứa
nhiều thông tin trong 1 cm3 hơn 1.000 tỷ CD nhạc. Hiệu suất sử dụng năng lượng của
máy tính ADN cũng gấp 1 triệu lần so với PC.
Trong khi máy tính để bàn được thiết kế để thực hiện một phép tính thật nhanh thì
máy tính ADN tạo ra hàng tỷ câu trả lời cùng một lúc. Điều này khiến thiết bị sinh học
phù hợp với việc giải quyết các vấn đề logic mờ. Tương lai có thể xuất hiện loại máy
tính lai ghép dùng silicon truyền thống để thực hiện các nhiệm vụ thông thường và
những bộ đồng xử lý ADN để giải quyết nhiều vấn đề phức tạp.
Điện toán ADN trên thế giới vẫn đang ở giai đoạn sơ khai. Tuy nhiên, nó có thể thay đổi
tương lai của máy tính, đặc biệt là các ứng dụng về sinh y học và dược học. Một số nhà
khoa học dự đoán rằng bác sĩ sẽ đưa máy tính ADN vào cơ thể người để kiểm tra sức
khoẻ. Thiết bị sẽ phun thuốc để điều trị những mô bị tổn hại.
"Máy tính siêu nhỏ" sinh hoá tồn tại trong mọi sinh vật nhưng con người gần như
không thể kiểm soát chúng, ví dụ không thể lập trình cây xanh để tính toán số pi.
Ý tưởng sử dụng ADN để lưu trữ và xử lý thông tin xuất hiện từ năm 1994 khi một nhà
khoa học Mỹ lần đầu tiên dùng ADN trong ống nghiệm để giải quyết một vấn đề toán
học đơn giản.
V. MỞ RỘNG
V.1. Ứng dụng khác của enzyme:
Ứng dụng trong hóa học
Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme trong hóa học là do enzyme có
cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường.
Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú . nhất
trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác
cho phản ứng nhiều bước. Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid,
sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để
sử dụng trong công nghệ xử l. nước thải, sản xuất alcohol, amino acid…
Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme,
ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để
nghiên cứu cấu trúc nucleic acid …
Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích.
Ứng dụng trong công nghiệp
Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và
đ. đạt được nhiều kết quả to lớn. Thử nh.n thống kê sơ bộ sau đây về các
l.nh vực đ. dùng protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp
thịt, công nghiệp chế biến cá,công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh
m., bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng,
công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da,
công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Với amylase, đ. được dùng
trong sản xuất bánh m., công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất
bia, sản xuất mật,glucose, sản xuất các sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ con, sản
xuất các mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp
dệt, công nghiệp giấy…Trong phạm vi giáo tr.nh này chúng ta chỉ đề cập
đến việc ứng dụng chế phẩm enzyme trong một số l.nh vực.
Dùng enzyme trị kẹo cao su
Các nhà khoa học đã thử nghiệm một hợp chất sinh học có thể giúp nước
Anh trị được thảm hoạ môi trường khiến họ phải tiêu tốn gần 190 triệu
euro mỗi năm. Đó là nạn
phun kẹo cao su xuống mặt
đường
Hẳn nhiều người còn nhớ hình ảnh
ông huấn luyện viên nổi tiếng Alex
Ferguson của câu lạc bộ
Manchester United luôn miệng nhai
kẹo cao su trong lúc điều hành trận
đấu trên sân. Ở Anh, vấn đề này trở
nên nghiêm trọng trong những năm
gần đây. Kẹo cao su là một trong
những thứ kẹo phổ biến nhất ở đất
nước này, bằng chứng là mức tiêu
thụ nó đã tăng 7% trong ba năm
qua. Hậu quả là lề đường các thành
phố dính đầy kẹo cao su vứt ra.
Theo tờ The Guardian, vụ tẩy sạch đường Oxford Street mới đây tại London, một trong
những huyết mạch giao thông chính ở thủ đô, đã giúp kiểm đếm có khoảng 300.000 tàn
tích kẹo cao su được người nhai phun ra. Những hoạt động dọn dẹp kiểu này ngày càng
trở nên tốn kém kinh khủng. Năm 2007, một thanh kẹo cao su giá 3 xu Anh làm nhà
nước mất đến 10 xu để tẩy sạch.
Mới đây, hai nhóm nghiên cứu ở Manchester và Belfast đã chế ra một dung dịch có khả
năng hoà tan kẹo cao su bám dính trên mặt đường phố, thay cho phương pháp tẩy sạch
bấy lâu nay là dùng những chiếc máy tẩy rửa hoạt động bằng hơi nước áp suất cao hoặc
các loại hoá chất rất độc hại cho môi trường.
Ý tưởng của các nhà khoa học trên xuất hiện khá tình cờ. Nhà hoá sinh học Gill Stephen
ở đại học Manchester kể: “Chúng tôi đang uống nước thì cuộc tranh luận bỗng dưng
chuyển hướng sang sự ghê tởm trước thói quen nhai kẹo cao su và phun xuống đường.
- Xem thêm -