Tài liệu ứng dụng hệ nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan hồ điệp lai ( phalaenopsis hybrid)

Sở Khoa học & Công nghệ TP. Hồ Chí Minh Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Trung tâm Công nghệ Sinh học BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis hybrid) ( Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/11/2007) Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài: ThS. Cung Hoàng Phi Phượng TP. Hồ Chí Minh, Tháng 11/2007 Sở Khoa học & Công nghệ TP. Hồ Chí Minh Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Trung tâm Công nghệ Sinh học BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis hybrid) Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài: ThS. Cung Hoàng Phi Phượng TT Công nghệ sinh học TP HCM GIÁM ĐỐC Sở Khoa học &Công nghệ TP HCM GIÁM ĐỐC TP. Hồ Chí Minh, Tháng 11/2007 Sở Khoa học & Công nghệ TP. Hồ Chí Minh Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Trung tâm Công nghệ Sinh học BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỐNG CÂY LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis hybrid) Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh Chủ nhiệm đề tài: ThS. Cung Hoàng Phi Phượng Danh sách cán bộ tham gia thực hiện : 1. PGS.TS Bùi Văn Lệ 2. TS. Nguyễn Quốc Bình 3. ThS. Hà thị Loan 4. CN. Nguyễn Quốc Thiện 5. CN. Nguyễn Văn Hiếu 6. CN. Lê Thành Tâm 7. SV Lê Thùy Mỹ Tiên ĐH Khoa học tự nhiênTP HCM Trung tâm Công nghệ Sinh học Trung tâm Công nghệ Sinh học Trung tâm Công nghệ Sinh học Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐH Khoa học tự nhiên TP HCM ĐH Mở TP HCM TP. Hồ Chí Minh, 11/2007 MỤC LỤC Mục lục ............................................................................................................................i Danh sách các bảng ........................................................................................................v Danh sách các hình ...................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... viii Lời mở đầu.....................................................................................................................ix Phần I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các Kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan........ 1 1.1.1 Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn ...............................................1 1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng ......................................................................................2 1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời ..............................................................4 1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống ......................................4 1.1.3.2 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời .........................................5 1.1.3.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống ..10 1.1.3.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion system) ...................................................................................16 1.2 Giới thiệu về Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) 1.2.1 Phân loại ..........................................................................................................18 1.2.2 Mô tả hình thái .................................................................................................19 1.2.2.1 Cơ quan sinh dưỡng.................................................................................19 1.2.2.2 Cơ quan sinh sản .....................................................................................19 1.2.3 Điều kiện sinh trưởng .....................................................................................20 1.2.3.1 Nhiệt độ và ẩm độ....................................................................................20 1.2.3.2 Ánh sáng ..................................................................................................20 1.2.3.3 Tưới nước.................................................................................................20 1.2.3.4 Bón phân ..................................................................................................21 1.2.3.5 Sự thông gió.............................................................................................21 1.2.4 Các phương pháp nhân giống Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) từ phát hoa ...21 1.2.5 Thị trường tiêu thụ ...........................................................................................24 PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 NỘI DUNG 1:Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống ...................................................................................................................27 2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa. ...............................................................................................................................27 2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB ......................................................................................................................28 2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs. ......................................30 i 2.1.4 Thí nghiệm 1.4: Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ ...............................30 2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc hay không lắc (lỏng tĩnh)...................................................................................................31 2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc. ......................................................................................31 2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng không có lắc ............................................................................31 2.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan .............................................................................................................................31 2.4 Nội dung 4 : Nghiên cứu sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima của Đài Loan .....................................................................................................................32 2.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima...........................................................................32 2.4.2 Thí nghiệm 4.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLBs trong hệ thống Plantima...........................................................................32 2.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan ...........................................................................................................................33 2.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ PLB, thể tích môi trường nuôi cấy lên tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima .................................................................33 2.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống Plantima..................................................................33 2.6 Nội dung 6: Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima của Đài Loan ..............................................................................................................34 2.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ nuôi cấy lên sự ra phát triển của cây con trong hệ thống Plantima. .....................................34 2.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát thời gian ngập và tần suất ngập của mẫu cấy lên sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima .........................................................34 2.7 Chuyển cây con ra vườn ươm: ............................................................................34 2.8 Điều kiện thí nghiệm ...........................................................................................34 2.9 Xử lý số liệu:..........................................................................................................35 ii PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NỘI DUNG 1: Thu thập mẫu thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống ...............................................................................................................36 3.1.1 Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường tạo chồi in vitro từ các mắt ngủ của phát hoa. ...............................................................................................................................36 * Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn mẫu in vitro. ......................................................................................................................................36 * Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên sự hình thành chồi ở phát hoa ....38 3.1.2 Thí nghiệm 1.2: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân PLB. * Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLBs từ mẫu lá của các chồi thu được trong thí nghiệm 1 .........................................................................................41 * Xác định nồng độ hormon tối ưu để nhân nhanh PLBs. ..................................44 * Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLBs ................................47 3.1.3 Thí nghiệm 1.3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB..........................................51 3.1.4 Thí nghiệm 1.4: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau lên sự hình thành rễ của chồi tái sinh từ PLBs .......................................................................53 3.2 NỘI DUNG 2: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc hay không lắc....................................................................................................56 3.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng có lắc............................................................................................56 * Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên........................56 * Với mẫu cấy là PLB dạng cụm..................................................................................57 3.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh........................................................................................59 * Với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang hoặc PLB để nguyên........................59 * Với mẫu cấy là PLB dạng cụm..................................................................................60 3.3 Nội dung 3: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan .............................................................................................................................63 iii 3.4 Nội dung 4 : Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan .....................................................................................................................67 3.4.1 Thí nghiệm 4.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima ...................................................................67 3.4.2 Thí nghiệm 4.2 : Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên sự nhân PLBs trong hệ thống Plantima......................................................................................73 3.5 Nội dung 5: Nghiên cứu tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan ...................................................................................................................77 3.5.1 Thí nghiệm 5.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên tái sinh chồi từ PLBs. .......................................................................................................77 3.5.2 Thí nghiệm 5.2: Khảo sát tần suất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLB trong hệ thống Plantima mật độ 50 PLBs và thể tích 200ml. ...................................82 3.6 Nội dung 6 : Nghiên cứu sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima của Đài Loan ...............................................................................................................83 3.6.1 Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường, IBA, mật độ nuôi cấy lên sự phát triển của chồi Hồ điệp trong hệ thống Plantima .......................83 3.6.2 Thí nghiệm 6.2: Khảo sát tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây con trong hệ thống Plantima ......................................................................................91 3.7 Sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm. ...................94 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận .............................................................................................................................99 4.2 Đề nghị ............................................................................................................................100 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................101 PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLBs từ lá ...................................................................................................28 Bảng 2.2 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân PLBs ............................................................................................................................29 Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLBs. ........................................................................................................29 Bảng 3.1 Trung bình số mẫu sạch .......................................................................................36 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi dinh dưỡng ...................................... .....38 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLBs từ lá .41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh PLBs từ một PLB ban đầu ...................................................................................................................44 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLBs ................................................47 Bảng 3.6a Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 1(Dtps. Taida Salu)........................................................................................................................ .....51 Bảng 3.6 b Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLBs của giống số 2 (Dtps. Taida FireBird) .................................................................................................................................51 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của hai giống lan Hồ Điệp .........................54 Bảng 3.8 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên ......................................... ......56 Bảng 3.9 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng lắc của giống số 1với mẫu cấy là PLBs dạng cụm .........................................................................................................58 Bảng 3.10 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với mẫu cấy là PLB cắt đôi theo chiều ngang và PLB để nguyên .......................................59 Bảng 3.11 Sự hình thành PLBs từ phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh của giống số 1 với mẫu cấy là PLB dạng cụm ...................................................................................................60 Bảng 3.12 Tóm tắt các kết quả nuôi cấy tối ưu của các dạng PLBs trên môi trường lỏng ..............................................................................................................................61 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs trong hệ thống Plantima Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân PLBs .............70 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLBs ...................................73 v Bảng 3.16 So sánh hệ số nhân PLBs của các hệ thống nuôi cấy khác nhau ..............74 Bảng 3.17 Ảnh hưởng mật độ nuôi cấy lên sự tái sinh chồi từ PLBs ..........................77 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tái sinh chồi từ PLB .......................80 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên quá trình tái sinh chồi từ PLBs......82 Bảng 3.20 Ảnh hưởng mật độ chồi lên sự phát triển của cây con trong bình Plantima 84 Bảng 3.21 Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển của chồi Hồ điệp ....................................87 Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên sự phát triển cây con Hồ Điệp ......89 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển cây con Hồ Điệp.......91 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1 : Hệ thống APCS của Tisserat và Vandercook, 1985 ...................................................5 Hình 2 :- A : Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988),- B: Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991) ......................................................................................................................6 Hình 3: Hệ thống RITA® ...............................................................................................8 Hình 4: Hệ thống BIT® ............................................................................................................9 Hình 5A: Các thành phần của Bình Plantima, Đài Loan..........................................................9 Hình 5B: Hệ thống Plantima a. Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập; b. Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima ..................................................................10 Hình 6: Các giống lan Hồ Điệp sử dụng trong thí nghiệm.....................................................37 Hình 7: Chồi hình thành từ mắt ngủ của phát hoa Hồ Điệp ...................................................40 Hình 8: PLBs hình thành từ mẫu lá nuôi cấy trên các môi trường khác nhau........................43 Hình 9: PLBs và chồi của giống số 1 (Dtps. Taida Salu) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau .......................................................................................45 Hình 10: PLBs và chồi của giống số 2 (Dtps. Taida Firebird) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. .................................................................................46 Hình 11: Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự nhân PLBs của giống số 1 và số 2...........................................................................................................................................50 Hình 12: Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB ......................................................53 Hình 13: Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ ...........................................................................55 Hình 14:Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lên sự nhân PLBs của 3 loại mẫu cấy .....................62 Hình 15: Sơ đồ lắp ráp hệ thống ngập chìm tạm thời của Đài Loan ......................................63 Hình 16: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong bình Plantima.......................66 Hình 17:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự nhân PLBs ..................................................69 Hình 18:Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự nhân PLBs.................................................72 Hình 19:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLBs ............................................76 Hình 20:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tái sinh chồi từ PLBs..................................79 Hình 21:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tái sinh chồi và nhân chồi từ PLBs ........................................................................................................................................81 Hình 22:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự tái sinh chồi từ PLBs ............................83 Hình 23:Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự phát triển của cây con ................................86 Hình 24: Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo chồi nách của ở Lan Hồ Điệp lai ...........................88 Hình 25:Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp trong bình Plantima .................................................................................................................90 Hình 26:Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự phát triển của cây con Hồ Điệp ............93 Hình 27: Cây con Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm ....................................................................95 Hình 28: Tóm tắt quy trình nhân giống Hồ Điệp có sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời .98 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT MS: Murashige & Skoog MS1/2: Murashige & Skoog giảm một nửa khoáng đa lượng BA: 6-benzyladenin NAA: -naphthalene acetic acid IBA : Indole-3 –butyric acid PLBs: Protocorm-like bodies CW: nước dừa CA: activated charcoal (than hoạt tính) B1: Thiamine B6: Pyridoxine PVP: Polyvinylpyrrolidone TIS: Temporary Immersion system (hệ thống ngập chìm tạm thời) chất ĐHSTTV: chất điều hòa sinh trưởng thực vật SPSS: Statistical Program Scientific System viii Lời mở đầu Trong những năm gần đây, các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được nhiều nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây trồng. Ảnh hưởng tích cực của hệ thống này đã được thể hiện trong việc tăng sinh chồi, nuôi cấy đốt thân, nuôi cấy củ bi và tạo phôi vô tính. Hệ thống này có tác dụng làm tăng chất lượng cây trồng thể hiện ở việc làm tăng cường sức sống của chồi và khả năng tạo phôi soma không bị biến dị ở tần số cao. Hiện tượng thủy tinh thể, thường gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến chất lượng mẫu cấy khi nuôi cấy lỏng, có thể được loại bỏ khi sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời hoặc có thể được kiểm soát bằng cách điều khiển thời gian ngập chìm. Thực vật được nhân giống trong hệ thống ngập chìm có khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm so với các thực vật được nuôi cấy trong hệ thống bán rắn hay lỏng. Với những ưu điểm trên hệ thống ngập chìm tạm thời đang được mở rộng ở quy mô lớn phục vụ trong sản xuất thương mại. Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa kiểng đặc biệt là phong lan ở Việt Nam hầu như còn bỏ ngỏ. Xuất phát từ nhu cầu Lan Hồ Điệp là một loại cây trồng không những có giá trị về mặt thẩm mỹ mà còn có giá trị thương mại cao nhưng khó nhân giống, chúng tôi đã sử dụng lan Hồ Điệp như một đối tượng thực vật trong nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để nhân giống loại lan này. Mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống nuôi cấy thông thường để góp phần mở ra khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường tại Việt Nam. Tác giả và nhóm thực hiện đề tài xin cảm ơn Sở KHCN TP. HCM đã tạo điều kiện trong suốt 2 năm qua để có thể bước đầu hoàn thành đề tài này. Chúng tôi hy vọng đề tài này sẽ là tài liệu tham khảo tốt cho những ai quan tâm đến kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời. ix PHAÀN 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Toång quan tài liệu 1.1 Các kỹ thuật vi nhân giống sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào, cơ quan 1.1.1 Kỹ thuật vi nhân giống trên môi trường bán rắn Vi nhân giống đã trở nên là một phần quan trọng trong ngành nhân giống thực vật (George và Sherrington, 1984). Kỹ thuật phổ biến nhất của vi nhân giống thực vật là nghiên cứu các mô thực vật trên môi trường bán rắn và hiện đang được sử dụng trong hầu hết các quay trình nhân giống mà đặc biệt là sự tái sinh cây từ các tế bào nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo. Nhờ những ưu điểm so với các phương pháp nhân giống khác (Debergh, 1987; Litz, 1987; Kyte, 1987; Macdonald, 1986) vi nhân giống thường được sử dụng trong các mục đích sau: nhân giống số lượng lớn những cây giống đồng dạng về kiểu gen, sản xuất giống cây sạch bệnh, sản xuất cây giống đầu dòng sử dụng cho mục đích lai tạo giống mới, bảo quản nguồn gen. a. Ưu điểm Ưu điểm chính của vi nhân giống là từ một phần mô nhỏ của thực vật có thể sản xuất ra hàng nghìn cây thực vật đó mà có thể thực vật đó sẽ được tiếp tục sử dụng như thế hệ bố mẹ. • Thu nhận được thế hệ cây con đồng nhất. • Sản xuất cây sạch bệnh. • Thực vật thường phát triển nhanh hơn, sức sống cao. • Cây trưởng thành nhanh hơn so với cây nhân giống bằng hạt. Các loài cây thân thảo có thể được nhân giống quanh năm bằng các phương pháp nhân giống truyền thống tuy nhiên số lượng rất hạn chế, vi nhân giống sẽ làm tăng tỉ lệ nhân giống loài cây này lên gấp nhiều lần đủ phục vụ cho mục đích thương mại. Vi nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền. Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu trữ được lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống vô tính truyền thống. b. Nhược điểm Một số giới hạn trong ứng dụng vi nhân giống đối với tất cả các loài thực vật: 1 Toång quan tài liệu • Giới hạn về sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống, nghĩa là cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt kiểu hình. • Tiến trình nhân giống phức tạp (bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau và kéo dài 5 - 6 tháng trước khi có thể thích ứng và trồng ngoài vườn ươm). • Giá thành sản phẩm nhân giống còn khá cao. • Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường. • Nhân giống nhanh và nhân với số lượng lớn cho đến ngày nay vẫn chưa thực hiện được trên tất cả các loài cây, cụ thể như đối với các loài ngũ cốc thì việc nhân giống vẫn còn nhiều giới hạn. • Sự tái sinh thành cây in vitro thường khó xảy ra, đặc biệt với các cây thân gỗ. Ngoài những khó khăn trên, vấn đề hiện đang được quan tâm nhất là giá thành sản phẩm còn cao. Nguyên nhân chính là sự thất thoát do nhiễm vi khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỉ lệ sống sót thấp của cây nuôi cấy trong giai đoạn vườn ươm, giá nhân công chiếm 60 - 70 % tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (chiếu sáng, bình nuôi cấy, ... ) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar, ... ) cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần sẽ làm giảm đáng kể hiệu quả về sức sinh trưởng và phát triển của thực vật có khi làm tăng tính bất thường về di truyền cho tế bào, ngay cả sự hình thành của rễ chính và rễ thứ cấp có thể không thành công. Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống trên môi trường bán rắn được xem là tỉ lệ sống sót của cây thấp sau khi được chuyển ra vườn ươm bởi vì sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in vitro và ex vitro và sự cần thiết phải nuôi cấy vô trùng bắt buộc phải sử dụng các loại trang thiết bị chuyên biệt và đắt tiền. Tất cả những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi vi nhân giống trong nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao.. 1.1.2 Kỹ thuật nuôi cấy lỏng Với phương pháp truyền thống thì sự tái sinh của mô thực vật thường được thực hiện bởi việc cho mô thực vật phát triển trên môi trường thạch hay nói cách khác phần lớn các qui trình nuôi cấy mô thường áp dụng việc điều chỉnh hợp lý tỉ lệ giữa auxin và 2 Toång quan tài liệu cytokinin trên môi trường rắn hoặc bán rắn để kích thích sự hình thành của mô sẹo, phát sinh phôi, chồi và rễ,… Tuy nhiên, có rất nhiều giới hạn trong việc nuôi cấy trên môi trường thạch trong đó quan trọng nhất là sự thành lập các độc tố quanh mô nuôi cấy sau khi cây đã sử dụng cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường này. Do những hạn chế của nuôi cấy trên môi trường thạch, nhiều nhà khoa học đã hướng đến việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường lỏng. Nuôi cấy trên môi trường lỏng có nhiều khía cạnh như nuôi cấy huyền phù tế bào để nhân sinh khối và nuôi cấy để tái sinh cơ quan. Ở đây chỉ một khía cạnh là nuôi cấy trên môi trường lỏng để tái sinh cơ quan thực vật hoàn chỉnh là được quan tâm. Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng toàn bộ bề mặt mẫu cấy tiếp xúc với môi trường giúp nâng cao sự phân chia tế bào và tái sinh cơ quan, gia tăng hệ số nhân chồi, rễ, củ, và phôi soma. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, nồng độ các chất trong môi trường đồng nhất và các hợp chất độc trong môi trường xung quanh mô nuôi cấy bị biến đổi nhanh chóng trước khi có thể ảnh hưởng đến mô. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, mẫu cấy có thể được cấy trực tiếp vào trong môi trường lỏng hay sử dụng cầu giấy lọc, bình nuôi cấy có thể được đặt trên máy lắc hoặc không. Môi trường sử dụng trong nuôi cấy lỏng cũng tương tự như môi trường sử dụng trong nuôi cấy trên thạch, chỉ có khác là không bổ sung agar vào trong môi trường nuôi cấy, do đó các bước chuẩn bị môi trường và tiến hành cấy mẫu cũng gần như tương tự khi nuôi cấy trên môi trường thạch. Hiện nay, nuôi cấy trong môi trường lỏng thường sử dụng nhằm mục đích nâng cao hệ số nhân chồi, PLBs, rễ, củ, nâng cao khả năng phát sinh phôi ở rất nhiều loài thực vật (Nhut và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, nếu chỉ với việc nuôi cấy đơn thuần là trong môi trường lỏng, mô cấy sẽ bị nhận chìm xuống nước kết quả là sẽ tạo ra sự nghèo thoáng khí có khi làm mô thực vật chết đi, có hiện tượng trương nước, thủy tinh thể. Hiện nay, có nhiều giải pháp để khắc phục tình trạng này thông qua một số hệ thống nuôi cấy dựa trên việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng: như các hệ thống Bioreactor, hệ thống ngập chìm tạm thời, … 3 Toång quan tài liệu 1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1.1.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: • Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy • Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ • Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ • Hạn chế sự dịch chuyển • Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động • Hạn chế sự nhiễm • Giá thành hạ Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylen thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường. Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: • Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại • Hệ thống timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập • Hệ thống ống dẫn và van điều khiển • Các màng lọc thoáng khí • Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh 4 Toång quan tài liệu Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau. 1.1.3.2 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ¾ Hệ thống tilting và hệ thống Rocker Hai hệ thống này được thiết kế bởi Harris và Mason (1983). Hệ thống tilting thiết kế một số bình tam giác đặt nghiêng một góc 30 độ đối diện với nhau; công suất của máy này có đặt khoảng 400 bình tam giác 50 ml hay 320 bình tam giác 125 ml. Hệ thống Rocker có thể xoay 70 bình trụ tròn miệng rộng có thể tích 910 ml trên các khay của hệ thống một góc 30 – 40 độ cứ sau mỗi 30 giây. Hai hệ thống này đều không có hệ thống bổ Hình 1: Hệ thống APCS của sung môi trường mới. Tisserat và Vandercook, 1985. ¾ Hệ thống ngập chìm hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy lớn có thể nâng lên hạ xuống, môi trường được bơm vào và rút ra khỏi buồng nuôi cấy theo chu kỳ nhất định trong điều kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy thực vật tự động (APCS, Hình 1) bao gồm hệ thống ống bằng silicone, hai bơm đẩy, hai bình thủy tinh chứa môi trường, một van inox ba chiều bằng thép không gỉ, một buồng nuôi cây, và một bản điều khiển có gắn các rờ le điện. Hệ thống này có thể sử dụng để nuôi cấy thực vật trong một thời gian dài. ¾ Hệ thống ngập chìm một phần và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng Trong hệ thống này mô thực vật luôn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ (agar, màn propylene, cellulose). Môi trường lỏng được bổ sung và rút khỏi bình nuôi cây.Chỉ có phần dưới của mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường. Hệ thống này có 2 mô hình 5 Toång quan tài liệu Mô hình Aitken – Christie và Jones (1987) và Aitken – Christie và Davies (1988) gồm một hệ thống bình chứa điều khiển bán tự động bằng polycarbonate có kích thước 250 x 390 x 120 mm. (Hình 2A). Trong hệ thống này, chồi Pinus spp. được nuôi trên môi trường với giá thể agar với hệ thống bổ sung rút và bổ sung môi trường lỏng bằng hệ thống bơm theo một chu kỳ nhất định. Môi trường lỏng từ nơi chứa tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian 4 đến 6 giờ bằng cách sử dụng máy hút chân không, sau đó môi trường sẽ được rút cạn. Maene và Debergh (1985) đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung môi trường lỏng hay auxin vào môi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuôi cấy invitro. Mô hình khác do Simonton và cộng sự năm 1991 thiết kế gồm hệ thống bơm điều khiển bằng vi tính có thể bơm môi trường lỏng vào bình nuôi cấy có thể tích 7 L theo chu kỳ (hình 2B). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuôi cấy. Hệ thống có bộ phận điều khiển sự bơm môi trường lỏng và điều tiết mức môi trường trong những bình nuôi cấy, điều khiển vòng tuần hoàn môi trường theo lịch trình lập sẵn, thay đổi chương trình theo giai đoạn nuôi cấy và có thể thay đổi được môi trường. A B Hình 2:A:Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988), B:Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991). 6 Toång quan tài liệu ¾ Hệ thống ngập hoàn toàn, trao đổi môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có chức năng thay mới môi trường Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có cả những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử dung bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cây. Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ. Môi trường lỏng được đẩy từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cây và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây. Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 – 6 tuần. Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống bình đôi (BIT®) và hệ thống Plantima. a. Hệ thống RITA® Hệ thống RITA® (hình 3) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích 1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí được sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cây, áp suất vượt mức sẽ đẩy không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình. 7