Tài liệu Xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp hplc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ VIỆT NGÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện : 1. Bộ môn hóa phân tích – độc chất 2. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành khóa luận của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Đình Chi đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp em hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo, ThS. Vũ Thị Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em gửi lời cảm ơn tới các anh chị, những người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn bên em, chia sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, Ngày 11 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Việt Ngân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN............................................. 3 1.1. Giới thiệu ..................................................................................................... 3 1.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin ............................................................. 3 1.3. Tính chất của Anthocyanin ......................................................................... 4 1.4. Tác dụng của Anthocyanin ......................................................................... 6 1.5. Sự phân bố của Anthocyanin ...................................................................... 8 1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin .............................................. 9 1.7. Tổng quan về HPLC.................................................................................. 10 1.7.1. Khái niệm chung ................................................................................ 10 1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký ............................................... 10 1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng ............................................................................ 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 17 2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị........................................................................... 17 2.2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................. 17 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 18 2.2.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 19 2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC .............. 19 2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu............................................................. 20 2.3.3. Thẩm định quy trình ........................................................................... 21 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................. 21 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 22 3.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số Anthocyanin bằng phương pháp HPLC ....................................................................................................... 22 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện.................................................................. 22 3.1.2. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký .......................................................... 23 3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .................................................................. 28 3.2.1. Khảo sát thời gian thủy phân ............................................................. 28 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân............................................................... 30 3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu..................................................... 31 3.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 33 3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ....................................................................... 33 3.3.2. Khoảng tuyến tính .............................................................................. 34 3.3.3. Độ lặp lại ............................................................................................ 37 3.3.4. Độ thu hồi ........................................................................................... 40 3.3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .................... 43 3.4. Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực phẩm rau củ ...................................................................................................... 44 3.5. Bàn luận..................................................................................................... 44 3.5.1. Lựa chọn phương pháp ...................................................................... 44 3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu ........................................................................... 45 3.5.3. Xây dựng phương pháp định lượng ................................................... 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 47 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 47 4.2.Kiến nghị .................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức HPLC High high performance liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High performance thin layer chromatography sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao IS Ionspray Voltage Thế phun ion LCMS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TEM Ion source Temperature Nhiệt độ nguồn PDA Photodiode Array Mảng diod quang DEL Delphinidin CYA Cyanidin PEL Pelargonidin DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4 Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam 8 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin 9 Bảng 2.1: Danh mục các pha động HPLC khảo sát 20 Bảng 3.1: Chương trình gradient 1 24 Bảng 3.2: Chương trình gradient 2 25 Bảng 3.3: Chương trình gradient 3 26 Bảng 3.4: Chương trình gradient 4 27 Bảng 3.5: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân 29 Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau 30 Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau 32 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn delphinidin 35 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn cyanidin 36 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn pelargonidin 37 Bảng 3.11: Độ lặp lại delphinidin trên nền mẫu rau 38 Bảng 3.12: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu rau 38 Bảng 3.13: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu rau 39 Bảng 3.14: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu củ 39 Bảng 3.15: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu củ 40 Bảng 3.16: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu rau 41 Bảng 3.17: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu rau 41 Bảng 3.18: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu rau 42 Bảng 3.19: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu củ 42 Bảng 3.20: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu củ 42 Bảng 3.21: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu củ 43 Bảng 3.22: Kết quả phân tích một số mẫu rau củ 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin 4 Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH 5 Hình 1.3: Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin 22 Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin 23 Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin 23 Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 1 25 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình gradient 2 (trên) và mẫu thực rau (dưới) 26 Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 3 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4 27 Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút) 29 Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau 30 Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2N trong dung môi chiết mẫu 31 Hình 3.11: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 33 Hình 3.12: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin 34 Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm chuẩn hỗn hợp 34 Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ delphinidin 35 Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ cyanidin 36 Hình 3.16: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ pelargonidin 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay với mức sống càng nâng cao, người dân ngày càng quan tâm hơn đến sức khỏe của bản thân. Trong nhiều năm gần đây, xã hội và giới khoa học quan tâm nhiều đến tác hại của gốc tự do, chất chống oxy hoá và stress oxy hóa [5]. “Stress oxy hóa” là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxi hóa [10]. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và lão hóa sớm [17]. Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh [19], [18], [26]. Trên thế giới đã có rất nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng Anthocyanin hay hoạt chất nhóm Anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LC-MS [21], [15], [27]. Tại Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm hay thực phẩm chức năng [3], [4], [6]. Tuy nhiên thì việc xác định từng hoạt chất trong nhóm Anthocyanin trong thực phẩm rau củ thì rất ít. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài: “Xác định một số hợp chất nhóm Anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC” Với các mục tiêu sau đây: 2 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC. 2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng để phân tích một số mẫu rau củ trên thị trường. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 1.1. Giới thiệu Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật [24]. Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh thẫm [24]. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rưc rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [25]. 1.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin Anthocyanin là những glycosid do gốc đường glucose, glactose... kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylat bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít [3]. Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycosid. Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng. Đến nay có những báo cáo của hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy nhiên trong đó chỉ có sáu chất phổ biến nhất Pelargonidin, Peonidin, Cyanidin, Malvidin, Petunidin và Delphinidin [25]. Trong bài báo cáo này chúng tôi tiến hành xác định Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin trong thực phẩm rau củ. 4 R1 OH B + OH O 3 7 5 R2 3 A OH OH Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R3′ R4′ R5′ R3 R5 R6 R7 Cyanidin −OH −OH −H −OH −OH −H −OH Delphinidin −OH −OH −OH −OH −OH −H −OH Pelargonidin −H −OH −H −OH −OH −H −OH Malvidin −OCH3 −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH Peonidin −OCH3 −OH −H Petunidin −OH −OH −OH −H −OH −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 [3]. 1.3. Tính chất của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực [3]. 5 Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH, …, trong đó khả năng tan trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [7]. Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm [3]. Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [25]. Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [3]: - Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ. - Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ. - Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base Chalcon không màu. - Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh. Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH. 6 Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid. Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [3]. Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [3]. Như vậy, trong môi trường acid, các anthocyanin là những base mạnh và có thể tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với base. Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính. Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh [3]. 1.4. Tác dụng của anthocyanin Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán do hình thành nên màu sắc sặc sỡ trên cành hoa và quả. Mặt khác, anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV cho phép bảo vệ bộ gen của thực vật trước nhóm tác nhân có thể gây đột biến gen này. Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phospho, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm…[14], [32]. Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ) [13], các anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác dụng tốt 7 trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu, hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng. Các nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học. Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [13], [31]. Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm [31]. Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA [31]. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn. Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [31]. Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được sử dụng trong thực phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao, chống lão hóa, tăng cường sức đề kháng, làm bền thành mạch, chống 8 viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng xạ [14], [16]. 1.5. Sự phân bố của Anthocyanin Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thực vật này, anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì. Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm [11]. Các họ thực vật như họ nho (Vitaceae) và họ hoa hồng (Rosaceae) là các nguồn anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có một số loài thuộc các họ khác: Cà tím (Solanaceae), quả lý (Saxifragaceae), quả việt quất (Ericaceae) và bắp cải tím (Brassicaceae)… Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycosid của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lượng các 3 – glycosid nhiều gấp 2,5 lần các 3,5 – glycosid. Loại anthocyanin hay gặp nhất chính là Cyanidin – 3 – glycosid [29]. Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam [8]. Hàm lượng STT Mẫu anthocyanin toàn phần (%) 1 Thân của loài ngô (Zea mays L.) 0,59 2 Lá chua, bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) 1,49 3 Hoa của loài chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) 0,34 4 Quả của loài dâu tằm (Mosrus alba L.) 1,75 5 Lá của loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) 1,72 9 6 Củ của loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46 7 Vỏ của loài nho (Vitis vinifera L.) 1,27 8 Lá của loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) Merr.) 1,05 9 Lá của loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74 1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin. Stt 1 2 3 Kỹ thuật phân tích HPLC HPLC HPLCPDAMS/MS Mẫu phân tích Điều kiện phân tích - Cột: C18 Waters (250 x 4.6 mm, 5 µm) - Pha động: A (H3PO4 1,5 %) B (H3PO4 1,5 %, Mẫu bắp CH3COOH 20 % trong hỗn cải tím hợp CH3CN – H2O (25:75) - Tốc độ dòng: 1.0 mL/min - Nhiệt độ cột: 400C - Detector PDA tại 530 nm - Cột Satisfaction RP C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) - Pha động: A (H2O – CH3OH (9:1)) Mẫu tía B (CH3CN – HCOOH (9:1)) tô đông khô - Detector PDA tại 530 nm - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Nhiệt độ cột: 25oC - Thể tích tiêm mẫu: 25 µL - Cột: Shim – pack CLCODS C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) Trái cây - Pha động: HCOOH nhiệt CH3OH (5:95) đới: quả - Tốc độ dòng: 1mL/phút sơ ri và - Nhiệt độ cột: 250C acai - Thể tích tiêm: 20 µL Detector: PDA và phân tích Điều kiện xử lý mẫu Tài liệu tham khảo Thủy phân bằng HCl ở nhiệt độ 900C trong 2 giờ, lọc sau đó chạy sắc ký [28] Nghiền, hòa tan trong HCl 10 %, lọc sau đó chạy sắc ký [22] Chiết bằng CH3OH có 0,5 % HCl để qua đêm ở 50C, lọc, làm giàu, lọc trước khi chạy sắc ký [27] 10 4 5 HPLCDADESIMS/MS HPLC Quả mọng (berries) Bilberry extract khối phổ 2 lần MS/MS. - Cột: YMC – pack ODS – AM C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) - Pha động: CH3CN – H2O – HCOOH, gradient dung môi - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Nhiệt độ cột: 400C - Thể tích tiêm: 25 µL - Detector: ESI – MS/MS. - Cột: YMC-Pack Pro C18 RS, 250 x 4.6 mm, 5 µm; YMCUltraHT Pro C18 RS, 100 x 3.0 mm, 2 µm. - Pha động: A: H2O – HCOOH (90:10) B: CH3CN – CH3OH – H2O – HCOOH (22,5:22,5:40:10) - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Nhiệt độ cột: 300C - Detector UV-Vis tại bước sóng 535 nm - Thể tích tiêm mẫu: 10 µL Mẫu được chiết bằng CH3OH – HCOOH (97:3) [12] trước khi chạy sắc ký Mẫu được hòa trong CH3OH – H2O (85:15), rung siêu âm, lọc [33] trước khi chạy sắc ký 1.7. Tổng quan về HPLC 1.7.1. Khái niệm chung Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [1]. 1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [1], [2]