Tài liệu Xây dựng phương pháp xác định một số kháng sinh β lactam trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ VÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ VÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh - Bộ môn Hóa phân tích - Trường đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới DS. Lê Xuân Kỳ, các cán bộ Phòng phân tích kiểm nghiệm - Viện công nghệ dược phẩm quốc gia, các thầy cô và cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa phân tích- Trường đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ để tôi có thể tiến hành đề tài với kết quả chính xác, kịp thời. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia Bộ Khoa học và Công nghệ đã tài trợ giúp tôi hoàn thành luận văn trong khuôn khổ đề tài số 105.08-2014.24 theo quyết định số 122/QĐ-HĐQL-NAFOSTED. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận văn đúng thời hạn quy định. Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn tới toàn thể anh chị em đồng nghiệp tại Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ với những khó khăn trong công việc. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày 31 tháng 8 năm 2015 Học viên Dương Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………...1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN…………………………………………………….3 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu……………………………………3 1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng……………………...3 1.1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu…………………………….5 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu………………………………..7 1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)…………………………………7 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ……………………………………………….9 1.3. Một số nghiên cứu về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh có trong nƣớc ở Việt Nam và trên thế giới……………………………………………………….14 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………...18 2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu………………………………...18 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn…………………………………………….18 2.1.2. Máy móc - trang thiết bị…………………………………………..19 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………….20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………......20 2.2.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách……………………………………………………………………….20 2.2.2. Phương pháp chiết tách β-lactam từ nước thải………………….20 2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LCMS/MS……………20 2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng……………………..21 2.2.5. Lấy mẫu, phân tích một số β-lactam trong thực tế………………..21 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu……………………………………………22 i Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………..23 3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời các kháng sinh β-lactam trong nƣớc thải công nghiệp dƣợc…………………………………………23 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ…………………….23 3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu…………………………33 3.2. Thẩm định quy trình phân tích các kháng sinh β-lactam trong các nƣớc thải nhà máy dƣợc phẩm………………………………………………….38 3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống…………………………………………..38 3.2.2. Độ đặc hiệu……………………………………………………......39 3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng………………………..41 3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định………………………………..43 3.2.5. Độ đúng và độ lặp lại…………………………………………….45 3.3. Áp dụng quy trình xây dựng đƣợc để xác định dƣ lƣợng các kháng sinh β-lactam nghiên cứu trong mẫu nƣớc thải từ cơ sở sản xuất dƣợc………...46 Chƣơng 4: BÀN LUẬN……………………………………………………..49 4.1. Về lựa chọn kháng sinh nghiên cứu…………………………………49 4.2. Về phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ……………...49 4.3. Về kết quả thẩm định phƣơng pháp…………………………………51 4.4. Về dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc phẩm……………………………………………………………………….52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A6AP Acid 6-amino penicillanic A7AC Acid 7-aminocephalosporanic AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists) APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển CE Năng lƣợng bắn phá (Collision energy) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử ESI Ion hóa phun điện tử HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) IS Chất chuẩn nội (internal standard) KS Kháng sinh LCMS/MS Sắc ký lỏng khối phổ khối phổ (Liquid chromatography-mass spectrometry) MRM/SRM Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần MS/MS Khối phổ hai lần MW Khối lƣợng phân tử SCAN Chế độ thu tín hiệu toàn phổ SIM Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction) tR Thời gian lƣu Spic Diện tích pic iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các β-lactam nghiên cứu Bảng 1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu Bảng 3.1. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.2. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa Bảng 3.3. Điều kiện khảo sát pha động và kết quả Bảng 3.4. Hiệu suất chiết SPE của các kháng sinh Bảng 3.5. Tổng hợp điều kiện phân tích và xử lý mẫu của các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LCMS/MS Bảng 3.7. Kết quả xác định LOD và LOQ của các kháng sinh Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp Bảng 3.10. Kết quả phân tích xác định nồng độ kháng sinh trong các mẫu thử iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức chung của Penicilin Hình 1.2. Công thức chung của cephalosporin Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Hình 3.1. Phổ đồ của các kháng sinh ở điều kiện nghiên cứu Hình 3.2. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát cột Hình 3.3. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát chƣơng trình pha động Hình 3.4. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát tốc độ dòng pha động Hình 3.5. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát thể tích tiêm Hình 3.6. Độ thu hồi của các 6 kháng sinh β-lactam sử dụng với các dung môi rửa giải khác nhau Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu tự tạo thể tích 100ml (a) và 200ml (b) Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn của các kháng sinh nghiên cứu Hình 3.9. Sắc ký đồ của các kháng sinh phân tích ở nồng độ LOQ v ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng kháng sinh luôn là một vấn đề đƣợc nhiều ngƣời quan tâm và cũng là một thực trạng mà xã hội hiện nay đang phải đối mặt. Có nhiều nguyên nhân gây ra tình trạng trên và một trong những lý do đó là sự tồn dƣ của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trƣờng. Vì chỉ một lƣợng rất nhỏ kháng sinh có mặt trong môi trƣờng sống cũng giúp vi khuẩn sinh ra những gen kháng thuốc. Hƣớng nghiên cứu về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng nhƣ tác động của chúng trong môi trƣờng đƣợc bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20 và rất đƣợc quan tâm tại các nƣớc phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trƣờng nƣớc đã trở nên phổ biến [8], [28]. Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát nồng độ kháng sinh thải ra môi trƣờng tại các cơ sở sản xuất dƣợc phẩm cũng cần đƣợc quan tâm. Hiện cả nƣớc có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dƣợc phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và vitamin… Trong đó, kháng sinh nhóm β-lactam rất đa dạng và có phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang đƣợc chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nƣớc ta. Theo thống kê của Cục quản lý dƣợc, từ tháng 1 năm 2010 đến tháng 4 năm 2015, cả nƣớc có khoảng trên 1000 số đăng ký của các kháng sinh β-lactam với khoảng 50 nhà máy sản xuất [7]. Các chế phẩm kháng sinh β-lactam hiện đang đƣợc sản xuất ở nƣớc ta có nhiều dạng bào chế khác nhau nhƣ: thuốc tiêm, viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống…. Có thể nói, đây là nhóm kháng sinh đƣợc sản xuất với số lƣợng và đa dạng nhất hiện nay ở nƣớc ta. Các nhà máy sản xuất các kháng sinh này đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nƣớc thải 1 sau sản xuất. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dƣ kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chƣa đƣợc quan tâm và chƣa có yêu cầu của cơ quan Nhà nƣớc về giới hạn nồng độ của các kháng sinh trong nƣớc thải của các nhà máy sản xuất này. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam mới có một vài nghiên cứu xác định dƣ lƣợng một số kháng sinh trong nƣớc thải bệnh viện và nƣớc thải từ cơ sở sản xuất dƣợc. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp xác định một số kháng sinh β-lactam trong nƣớc thải nhà máy dƣợc phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu nhƣ sau: 1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định đồng thời dƣ lƣợng một số kháng sinh nhóm β-lactam (06 kháng sinh: amoxicilin, cefaclor, cephalexin, cefadroxil, cefotaxim và cefixim) trong nƣớc thải từ cơ sở sản xuất Dƣợc bằng LCMS/MS ở nồng độ ppb. 2. Ứng dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để đánh giá dƣ lƣợng một số kháng sinh nhóm β-lactam có trong nƣớc thải từ cơ sở sản xuất Dƣợc trong nƣớc. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng Kháng sinh β-lactam gồm 2 nhóm lớn là Penicilin và Cephalosporin. a. Kháng sinh Penicilin:  Công thức chung của Penicilin: Hình 1.1. Công thức chung của Penicilin Penicilin là dẫn chất acyl hóa của acid 6-amino penicillanic (A6AP), cacbon bất đối C(2) có cấu hình S, trong khi C(5), C(6) đều có cấu hình R. Cấu hình này đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính của các Penicilin [9]. b. Kháng sinh Cephalosporin:  Công thức chung của cephalosporin R2 H R1 NH O H S H N R3 O HO O Hình 1.2. Công thức chung của cephalosporin Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), dạng cấu trúc 3 -cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β – lactam để hợp chất có tác dụng sinh học. 3 Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu nhƣ là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [9]. c. Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nghiên cứu: Các kháng sinh β-lactam nghiên cứu đƣợc phân loại dựa trên nguồn gốc và phổ tác dụng của chúng. Đặc điểm của từng nhóm đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các β-lactam nghiên cứu [6], [9], [11] Thế hệ Penicilin Tên đại diện Amoxicilin nhóm III Phổ tác dụng - Nguồn gốc bán tổng hợp. Phổ tác dụng rộng trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) - Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém Penicilin và hầu nhƣ không có tác dụng với các vi khuẩn tiết ra β-penicilinase. - Trên vi khuẩn Gram (-), có tác dụng trên cả vi khuẩn ƣa khí và kị khí nhƣ: Escherichia coli, Enterococci, Salmonella, Shigella Cephalos Cephalexin, - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi porin thế khuẩn Gram (+) nhƣ tụ cầu, liên cầu, phế cầu Cefadroxil hệ I (trừ liên cầu kháng methicillin). - Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) nhƣ E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella. Cephalos Cefaclor - Phổ tác dụng tƣơng tự nhƣ thế hệ I. Tuy nhiên porin thế tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn hệ II tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) (Klebsiella, H. influenza…) mạnh hơn thế hệ I. 4 Cephalos Cefixim, - Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-) porin thế - Thuốc bền vững với β-lactamase và đạt đƣợc Cefotaxim nồng độ diệt khuẩn trong dịch não tủy, tác dụng hệ III trên cả P. aeruginosa. - Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém Penicilin và cephalosporin thế hệ I. 1.1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu Bảng 1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu [5],[9],[14] Tên chất CTCT, CTPT, MW Tính chất vật lí - Bột tinh thể màu trắng 1. Amoxicilin - Khó tan trong nƣớc, alcol, thực tế không tan trong ether, chloroform, dầu CTPT: C16H19N3O5S - Tan trong các dung dịch acid MW: 365,4 hoặc hydroxyd kiềm loãng - Bị phân hủy nhanh ở độ ẩm cao và nhiệt độ trên 37oC - pKa lần lƣợt là 2,4; 7,4 và 9,6 - Bột kết tinh trắng, hơi có 2. Cephalexin mùi lƣu huỳnh - Ít tan trong nƣớc, không tan trong ethanol 96%, ether CTPT: C16H17N3O4S - Tan trong các dung dịch MW: 347,4 kiềm loãng - pKa1 = 5,3 và pKa2 = 7,3 5 - Bột màu trắng hoặc gần nhƣ 3. Cefadroxil trắng. - Khó tan trong nƣớc, rất khó tan trong ethanol 96%. CTPT: C16H17N3O5S - Độ tan trong nƣớc: 0,339 g/l. MW: 363,4 - pKa1 = 3,45; pKa2 = 7,43 4. Cefaclor - Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng - Khó tan trong nƣớc, thực tế không tan trong methanol và dicloromethan CTPT: C15H14ClN3O4S - pKa = 8,03 MW: 367,8 5. Cefotaxim - Bột màu trắng hoặc trắng ngà natri - Dễ tan trong nƣớc, ít tan trong methanol, thực tế không CTPT: C16H16N5NaO7S2 tan trong ether MW: 478,5 - pKa = 3,75 - Bột trắng hoặc gần nhƣ 6. Cefixim trắng. Ít tan trong nƣớc, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế CTPT: C16H15N5O7S2 không tan trong ether, ethyl MW: 453,5 acetat và hexan. - Độ tan trong nƣớc: 0,104 g/l. - pKa1 = 2,92; pKa2 = 3,45 6 1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu 1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó chất phân tích đƣợc chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tƣơng tự nhƣ trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. Tùy theo đặc tính của pha rắn mà có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha đảo hay trao đổi ion. Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bƣớc nhƣ sau: Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích mà lựa chọn cột có lƣợng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau. Lƣợng pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền từ 125 µL đến 20 mL. Qui trình chiết đối với nhằm mục đích làm giàu mẫu gồm 4 giai đoạn: 1. Hoạt hóa cột chiết pha rắn: cho dung môi hoặc dung dịch đệm thích hợp đi qua cột để loại bỏ khí trong cột và chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lƣu giữ chất phân tích trong mẫu. 2. Nạp mẫu: Mẫu đƣợc xử lý sơ bộ trong dung môi thích hợp và cho qua cột. Chất phân tích và một số chất khác đƣợc giữ lại trên cột. Các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh làm ảnh hƣởng đến tƣơng tác của chất phân tích và pha rắn. 3. Loại tạp chất: Sau khi đƣa mẫu qua cột, dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại một số tạp chất đã đƣợc giữ trên pha rắn. Dung môi sử dụng phải đảm bảo loại đƣợc tạp chất mà không kéo theo chất phân tích. 7 4. Rửa giải: Dùng dung môi thích hợp kéo chất phân tích ra khỏi pha rắn. Cần tối ƣu hóa loại dung môi, lƣợng dung môi, pH dung môi rửa giải và tốc độ rửa giải để đảm bảo rửa đƣợc tối đa lƣợng chất phân tích và tối thiểu tạp chất có trên cột. Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của chiết lỏng- lỏng: lƣợng dung môi sử dụng ít, thiết bị và sản phẩm quá trình chiết dễ dàng kết nối GC, HPLC, khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ƣu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy nhiên, có nhƣợc điểm là khó lƣu giữ chất phân cực mạnh, khó xây dựng đƣợc quy trình chiết tối ƣu, lƣợng dung môi đã giảm nhiều nhƣng hãy còn lớn, giá thành của phƣơng pháp còn cao. Hiệu quả của quá trình chiết pha rắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Loại cột chiết sử dụng: mỗi loại cột chiết chỉ phù hợp để chiết những hoạt chất nhất định, tùy thuộc vào loại nguyên liệu tạo pha rắn (là pha thuận, pha đảo, trao đổi ion hay pha không liên kết). - Lƣợng chất tạo pha rắn: ảnh hƣởng trực tiếp đến dung lƣợng của cột chiết pha rắn. Thông thƣờng, lƣợng chất nhồi càng lớn thì dung lƣợng chiết của cột càng lớn, đồng thời yêu cầu lƣợng dung môi rửa giải càng nhiều. - Dung môi rửa giải: loại và số lƣợng dung môi rửa giải sử dụng phải đảm bảo chiết đƣợc hoàn toàn chất phân tích đang đƣợc lƣu giữ trong cột, và hạn chế tối đa các tạp chất. - Lƣợng mẫu phân tích đƣa qua cột chiết: ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu suất của quy trình chiết. Nếu lƣợng mẫu qua cột quá lớn, vƣợt quá dung lƣợng cột sẽ làm giảm hiệu suất chiết và ngƣợc lại. 8 1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ là kĩ thuật phân tích dựa trên việc ghép nối hai hệ thống: sắc ký lỏng và khối phổ. Về cơ bản, có thể coi sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ. a. Sắc ký lỏng hiệu năng cao  Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].  Nguyên tắc Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong dung môi và đƣợc cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lƣợng [1], [2]. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC đƣợc trình bày ở hình 1.3. Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 9 b. Detector khối phổ  Nguyên tắc Khối phổ là kỹ thuật phân tích dựa trên việc ion hóa chất phân tích và đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z) đƣợc tạo thành từ phân tử chất phân tích. Các ion tạo thành này đƣợc tách ra và phát hiện theo trị số m/z, từ đó cung cấp thông tin định tính, xác định cấu trúc và định lƣợng của các chất.  Cấu tạo Cấu tạo của thiết bị khối phổ bao gồm các phần chính: bộ phận nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector và bộ phận xử lý dữ liệu. Mẫu đƣợc đƣa vào qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hóa, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trƣớc khi đến detector. Tất cả quá trình này diễn ra trong điều kiện chân không với áp suất dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa. - Bộ phận nạp mẫu: Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký. Cách chuyển mẫu : mẫu từ đầu ra của LC đi qua bộ giao diện để tạo thành dạng hơi và tách loại dung môi. - Bộ nguồn ion: Chất phân tích sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa. Một số kĩ thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI). Ion hóa phun điện tử (ESI) đƣợc thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu thử trong dung dịch đƣợc đƣa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này đƣợc phun sƣơng dƣới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và đƣợc gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử 10 sinh học có khối lƣợng tới 100 000 Da. Có thể dùng trong ghép nối với sắc ký lỏng hay điện di mao quản. Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) đƣợc thực hiện ở áp suất khí quyển nhờ tác động của một điện cực có điện thế cao; pha động đƣợc phun sƣơng bằng hiệu ứng nhiệt. Các ion hình thành có một điện tích và là ion kiểu (M+H)+ trong chế độ phân cực dƣơng và kiểu (M-H)- trong phân cực âm. Kỹ thuật này chỉ phù hợp cho việc ghép nối khối phổ với sắc ký lỏng. - Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Một số bộ phân tích khối phổ thƣờng dùng: Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) Bộ phân tích này gồm có bốn thanh kim loại song song hình trụ. Chúng đƣợc đặt đối xứng hai bên đƣờng đi của các ion; các cặp đối diện với nhau qua trục đối xứng của các thanh điện cực thì đƣợc nối điện với nhau. Điện thế của hai cặp thanh điện cực là đối nhau. Điện thế này là tổ hợp của một thành phần một chiều và một thành phần xoay chiều. Các tứ cực đóng vai trò nhƣ một bộ lọc khối. Các ion hình thành trong nguồn ion đƣợc truyền đi và tách bằng cách thay đổi thế đặt trên các điện cực. Chỉ những ion có trị số m/z phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này. Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thƣờng là khí argon. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này đƣợc gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thƣờng đƣợc dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần. Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) 11