BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG
THÍCH HỢP NUÔI CẤY NẤM Aspergillus fumigatus
SINH TỔNG HỢP PHYTASE CAO
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ NGỌC ĐIỆP
MSSV: 3083916
LỚP: CNSHTT K34
Cần Thơ, Tháng 05/2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. Dương Thị Hương Giang
Nguyễn Thị Ngọc Điệp
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………..
Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
CẢM TẠ
Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Đại học thì sự cố gắng của bản thân tôi là
chưa đủ, tôi đã nhận được sự ủng hộ và giúp đỡ nhiệt tình của rất nhiều người.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Dương Thị Hương Giang
đã tận tâm hướng dẫn, định hướng cho tôi thực hiện đề tài, truyền đạt kiến thức và tạo
mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua.
Xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bạn Nguyễn Văn Tính đã tận tình hướng dẫn về
chuyên môn, luôn sẵn sàng chia sẽ những kinh nghiệm và đóng góp những ý kiến quý
báo, tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Trân trọng cám ơn bạn Trần Nguyễn Nhật Khoa, anh Tạ Duy Tiên và chị Nguyễn
Thị Xuân Dung, cùng các anh chị em cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Công
nghệ Enzyme đã tận tình giúp đỡ, động viên và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Xin cám ơn các anh, chị quản lý phòng thí nghiệm Thực Phẩm cũng như các
phòng thí nghiệm thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học là những người đã hỗ trợ
trực tiếp trong việc hướng dẫn và cách thức sử dụng trang thiết bị phục vụ cho đề tài.
Tôi rất biết ơn PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp - Cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh
học tiên tiến khóa 34 và tập thể lớp đã quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua những
khó khăn trong thời gian vừa qua.
Ngoài ra, tôi xin ghi nhận và cám ơn những thầy cô Viện NC&PT Công nghệ
Sinh học cùng tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy,
truyền đạt kiến thức chuyên môn và tạo những điều kiện tốt nhất cho sinh viên chúng
tôi được tiếp cận và tham gia nghiên cứu khoa học, từ đó tạo tiền đề vững chắc để đề
tài luận văn tốt nghiệp được tiến hành.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi gửi lời tri ân chân thành và
sâu sắc nhất đến Cha Mẹ và anh chị em trong gia đình đã luôn hết lòng yêu thương,
giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn cũng như khóa học này.
Kính chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cám ơn.
Cần Thơ, ngày 15 tháng 05 năm 2013
Nguyễn Thị Ngọc Điệp
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
TÓM LƢỢC
Phytase là enzyme có khả năng giải phóng phosphorus từ phytate, khiến
phosphorus trở nên dễ hấp thu nên được dùng phổ biến trong thức ăn gia súc.
ần
đây, trong ph ng th nghiệm Công nghệ en yme, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
chủng nấm m i củ Aspergillus fumigatus được xem là nguồn tiềm năng cao trong
việc sản sinh enzyme phytase. Trong nghi n cứu này, việc khảo s t điều kiện nuôi cấy
đ cải thiện s sinh tổng hợp phytase cao từ d ng nấm mốc A. fumigatus T1 m i đ
được tiến hành. Chủng nấm mốc th hiện s sinh tổng hợp enzyme phytase cao nhất
tr n môi trường b n r n ở tuổi bào tử củ ngày thứ nhất và trong môi trường có bổ
sung hàm lượng KH2PO4 thích hợp là 1%, nguồn carbon là glucose v i hàm lượng
0,5%, và nguồn và hàm lượng nitrogen chọn được là malt extract 0,5%. Môi trường
nuôi cấy A. fumig tus s u khi tối ưu hó cho hoạt t nh phyt se c o gấp hơn 3 lần so
v i môi trường b n đầu. Từ kết quả trên, qui trình chung cho quá trình sinh tổng hợp
phytase cao từ A. fumigatus đ được thiết lập.
Từ khóa: Aspergillus fumigatus T1, KH2PO4, malt extract, phytase, phytate, tuổi
bào tử.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
CẢM TẠ ...........................................................................................................................
TÓM LƢỢC ....................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................vi
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... vii
CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................. viii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1. Phytic acid và muối phytate ................................................................................ 3
2.2. Enzyme phytase .................................................................................................... 3
2.2.1. Sơ lược về enzyme phytase ............................................................................... 3
2.2.2. Đặc điểm của phytase........................................................................................ 4
2.2.3. Phân loại và danh pháp ..................................................................................... 4
2.2.4. Cơ chế thủy phân phytate của phytase .............................................................. 6
2.2.5. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ............................................................................ 7
2.2.5.1. pH tối ưu ................................................................................................................. 7
2.2.5.2. Nhiệt độ tối ưu ........................................................................................................ 8
2.2.5.3. Ảnh hưởng của cơ chất ........................................................................................... 8
2.2.6. Ứng dụng của phytase ....................................................................................... 8
2.2.6.1. Trong công nghiệp thức ăn gia súc, thủy sản ......................................................... 9
2.2.6.2. Trong sản xuất thực phẩm ...................................................................................... 9
2.2.6.3. Trong công nghiệp bột giấy và giấy ..................................................................... 10
2.2.6.4. Trong trồng trọt .................................................................................................... 10
2.2.6.5. Trong sản xuất myo-inositol phosphate ............................................................... 10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
2.2.7. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ........................................................... 11
2.2.7.1. Phytase từ thực vật ............................................................................................... 11
2.2.7.2. Phytase từ mô động vật ........................................................................................ 11
2.2.7.3. Phytase từ vi sinh vật ............................................................................................ 11
2.3. Sơ lƣợc về nấm mốc A. fumigatus ..................................................................... 12
2.3.1. Phân loại .......................................................................................................... 12
2.3.2. Đặc điểm cấu tạo hệ sợi và cơ quan sinh sản của A. fumigatus ...................... 12
2.3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của A. fumigatus ............................................................. 14
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ............................ 14
2.3.4.1. Các yếu tố vật lý ................................................................................................... 14
2.3.4.2. Các yếu tố dinh dưỡng.......................................................................................... 15
2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và lượng giống cấy vào ......................... 16
2.4. Các nghiên cứu về phytase từ A. fumigatus trong và ngoài nƣớc .................. 17
2.4.1. Nghiên cứu trong nước.................................................................................... 17
2.4.2. Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................... 17
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................................... 18
3.1.1. Thời gian và địa điểm...................................................................................... 18
3.1.2. Nguyên liệu ..................................................................................................... 18
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ......................................................................... 18
3.1.3.1. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................................. 18
3.1.3.2. Hóa chất ................................................................................................................ 19
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 19
3.2.1. Chuẩn bị mốc giống và môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp phytase ............. 19
3.2.2. Trích ly phytase thô từ sinh khối nấm mốc A. fumigatus ............................... 20
3.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính phytase ........................................................ 20
3.3. Khảo sát điều kiện môi trƣờng nuôi cấy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp
phytase của A. fumigatus vừa phân lập ..................................................................... 23
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi bào tử lên khả năng sinh tổng hợp phytase của
A. fumigatus ................................................................................................................... 23
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phosphorus (KH2PO4) bổ sung lên khả
năng sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................... 23
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung lên khả năng
sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ........................................................................ 24
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng carbon bổ sung lên khả năng
sinh tổng hợp phytase của A. fumigatus ........................................................................ 24
3.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 25
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 26
4.1. Ảnh hƣởng của tuổi bào tử lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A.
fumigatus....................................................................................................................... 26
4.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phosphorus (KH2PO4) bổ sung lên khả năng sinh
tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................................ 27
4.3. Ảnh hƣởng của nguồn và hàm lƣợng nitrogen bổ sung lên khả năng sinh
tổng hợp phytase của A. fumigatus ............................................................................ 29
4.4. Ảnh hƣởng của nguồn và hàm lƣợng carbon bổ sung lên khả năng sinh tổng
hợp phytase của A. fumigatus ..................................................................................... 31
4.5. Qui trình nuôi cấy chủng A. fumigatus sinh phytase cao và thu nhận chế
phẩm phytase thô ......................................................................................................... 32
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 34
5.1. Kết luận ............................................................................................................... 34
5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 35
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ lục 1: Các phƣơng pháp sinh hóa - vi sinh
1. Phương pháp nuôi cấy nấm A. fumigatus để thu sinh khối
2. Các bước chuẩn bị môi trường Agar khoai tây gây giống và giữ giống (PGA Potato Glucose Agar)
3. Phương pháp trữ nấm mốc
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
4. Các bước chuẩn bị môi trường bán rắn nuôi cấy nấm để thu dịch trích enzymes
thô
5. Phương pháp Bradford
Phụ lục 2: Số liệu và kết quả phân tích thống kê
1. Số liệu về xây dựng đường chuẩn BSA (µg/mL)
2. Số liệu về xây dựng đường chuẩn phosphate (KH2PO4) (mM)
3. Kết quả phân tích thống kê các thí nghiệm
Phụ lục 3: Số liệu thô của các thí nghiệm
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Phân loại và danh pháp phytase ......................................................................... 6
Bảng 2. Xây dựng đường chuẩn phosphate ................................................................... 21
Bảng 3. Dãy nồng độ tăng dần của dung dịch BSA chuẩn ................................Phụ lục 1
Bảng 4. Giá trị OD của dung dịch BSA chuẩn ...................................................Phụ lục 2
Bảng 5. Giá trị OD của dung dịch KH2PO4 chuẩn .............................................Phụ lục 2
Bảng 6. Sự ảnh hưởng của tuổi bào tử đến khả năng sinh tổng hợp phytase
của nấm A. fumigatus .........................................................................................Phụ lục 2
Bảng 7. Sự ảnh hưởng của hàm lượng phosphorus (KH2PO4) đến khả năng
sinh tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus .....................................................Phụ lục 2
Bảng 8. Sự ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng nitrogen đến khả năng sinh
tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus ............................................................Phụ lục 2
Bảng 9. Sự ảnh hưởng của nguồn và hàm lượng carbon đến khả năng sinh
tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus .............................................................Phụ lục 2
Bảng 10. Hoạt tính phytase của A. fumigatus theo tuổi bào tử ..........................Phụ lục 2
Bảng 11. Hàm lượng protein trong dịch enzyme thô của A. fumigatus theo
tuổi bào tử ...........................................................................................................Phụ lục 3
Bảng 12. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo hàm lượng
KH2PO4 ...............................................................................................................Phụ lục 3
Bảng 13. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus
theo hàm lượng KH2PO4 ....................................................................................Phụ lục 3
Bảng 14. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo các nguồn và hàm
lượng nitrogen bổ sung .......................................................................................Phụ lục 3
Bảng 15. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus
theo các nguồn và hàm lượng nitrogen bổ sung .................................................Phụ lục 3
Bảng 16. Hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo các nguồn và hàm
lượng carbon bổ sung .........................................................................................Phụ lục 3
Bảng 17. Hàm lượng protein trong dịch trích enzyme thô của A. fumigatus theo các
nguồn và hàm lượng carbon bổ sung..................................................................Phụ lục 3
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Tương tác phytase nhóm Histidine Phosphotase với cơ chất phytate ................ 6
Hình 2. Phản ứng xúc tác của phytase ............................................................................. 7
Hình 3. Khuẩn ty dinh dưỡng (trái) và khuẩn ty sinh sản (phải) của A. fumigatus ....... 13
Hình 4. Cấu tạo cơ quan sinh sản của A. fumigatus ...................................................... 14
Hình 5. Khuẩn lạc của A. fumigatus .............................................................................. 14
Hình 6. Qui trình thu nhận phytase thô từ A. fumigatus ................................................ 20
Hình 7. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo tuổi bào tử (ngày) .. 26
Hình 8. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo hàm lượng KH2PO4
bổ sung ........................................................................................................................... 28
Hình 9. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo nguồn và hàm lượng
nitrogen bổ sung ............................................................................................................ 29
Hình 10. Biểu đồ hoạt tính enzyme phytase của A. fumigatus theo nguồn và hàm lượng
carbon bổ sung ............................................................................................................... 31
Hình 11. Quy trình nuôi cấy và thu nhận phytase thô của A. fumigatus ....................... 33
Hình 12. Biểu đồ đường chuẩn protein (BSA) ...................................................Phụ lục 2
Hình 13. Biểu đồ đường chuẩn phosphate (KH2PO4) ........................................Phụ lục 2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADP
Adenosine Diphosphate
AMP
Adenosine Monophosphate
ATP
Adenosine Triphosphate
BPP
-Propellar Phytase
CP
Cysteine Phosphatase
DNA
Deoxyribonucleic Acid
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic Acid
FDA
Food and Drug Administration
GMP
Guanosine Monophosphate
GTP
Guanosin Triphosphate
HAP
Histidine Acid Phytase
HIV
Human Immunodeficiency Virus
NADPH
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate
NC-IUBMB
Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry
and Molecular Biology
P
Phosphorus
PAP
Purple Acid Phosphatase
PGA
Potato Glucose Agar
RNA
Ribonucleic Acid
TCA
Trichloroacetic Acid
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
viii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Phosphorus là một trong những nguyên tố thiết yếu cho sinh vật, là hợp phần cấu
trúc của nucleic acid (DNA, RNA), màng phospholipid, các hợp chất cao năng (như
ATP, NADPH) và các mô liên kết như xương,... (Jahnke, 2000). Do đó phosphorus
vô cơ cũng như các loại thực vật giàu phosphorus được bổ sung vào thức ăn gia súc để
đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển tốt cho động vật. Điều đáng chú ý là trong
thực vật, phần lớn lượng phosphorus dự trữ tồn tại ở dạng phytic acid và muối phytate
khó hấp thu. Thêm vào đó, phytic acid cũng là chất kháng dưỡng, chúng liên kết chặt
chẽ với các khoáng chất thiết yếu như Ca2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+/3+ dẫn đến việc làm
giảm khả năng hấp thụ các khoáng chất cần thiết này trong cơ thể động vật (Singh,
2008). Do vậy, phần lớn lượng phosphorus hữu cơ trong thực vật cũng như các khoáng
dưỡng không được sử dụng hiệu quả. Muốn chuyển hóa được các hợp chất
phosphorus này phải nhờ hệ enzyme phytase có ở một số động thực vật và vi sinh vật.
Phytase là enzyme có khả năng phá vỡ các liên kết của phức hệ phytate không
tiêu hoá được và giải phóng phosphorus, calcium và các chất dinh dưỡng khác
(Debnath et al., 2005; Cao et al., 2007). Phytase giải phóng phosphorus bằng cách
phân cắt liên kết của các gốc phosphate với inositol. Khi các liên kết này bị phá vỡ,
các gốc phosphate cùng một số dưỡng chất khác như khoáng kim loại, amino acid,
đạm và tinh bột ở dạng muối phytate khó hòa tan sẽ được giải phóng và trở nên dễ hấp
thu. Đối với các loài động vật có cấu tạo dạ dày đơn giản như lợn, gia cầm, thỏ, ngựa,
cá,… khả năng hấp thu phosphorus từ phytate rất thấp vì chúng thiếu phytase trong hệ
tiêu hóa. Kết quả là một lượng lớn phytate trong thức ăn có nguồn gốc thực vật được
thải ra trong phân, có thể làm ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước, đặc biệt là tầng nước
mặt. Đồng thời lượng phosphorus này sẽ là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn gây bệnh
sống trong đất phát triển và phát tán trong nước gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa
(Mullaney et al., 2000). Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách bổ sung phytase
vào thức ăn gia súc để thủy phân các hợp chất phytate, tăng khả năng hấp thu
phosphorus và một số chất dinh dưỡng. Theo Nguyễn Thu Quyên et al. (2011) việc bổ
sung phytase vào khẩu phần ăn cho gà Broiler có ảnh hưởng tích cực đến khả năng
khoáng hóa xương cũng như cải thiện khả năng tiêu hóa calcium, phosphorus của gà
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Broiler. Ngoài ra, các dưỡng chất khác khi tạo phức với phytate cũng trở nên dễ tiêu
hoá hơn, từ đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và giảm ô nhiễm môi trường.
Việt Nam là một nước chăn nuôi nông nghiệp nên nhu cầu về thức ăn gia súc
rất cao. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất phytase để bổ sung vào thức ăn gia súc là
hết sức cần thiết. Phytase được tìm thấy ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên,
vi sinh vật được xem là nguồn sản xuất phytase chính cho việc nghiên cứu và ứng
dụng của enzyme này. Nhiều nghiên cứu cho thấy phytase có ở vi khuẩn, nấm men và
nấm mốc. Trong đó, nấm mốc được xem là nguồn sản xuất phytase dồi dào và phong
phú với nhiều loài trong chi Aspergillus như A. ficuum, A. carbonarius, A. oryzae, A.
niger và A. fumigatus (Shimizu, 1993; Volfova et al., 1994; Liu et al., 1999). So với
phytase từ các loài khác trong chi Aspergillus thì phytase từ A. fumigatus có nhiều đặc
tính nổi trội hơn như tính đặc hiệu với cơ chất rộng, vùng pH tối ưu 2,5 và 5,5, có khả
năng hồi tính cao sau khi biến tính ở nhiệt độ cao (Pasamontes et al., 1997; Wyss et
al., 1998). Với những ưu điểm này, phytase từ A. fumigatus được các nhà khoa học
chú ý và nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở Việt Nam có ít tài liệu
nghiên cứu về phytase từ loài nấm mốc này. Do đó đề tài “Nghiên cứu môi trường
thích hợp nuôi cấy nấm A. fumigatus sinh tổng hợp phytase cao” được thực hiện nhằm
tiếp tục hoàn thiện nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme,
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, với mong muốn sản xuất phytase từ loài nấm mốc
A. fumigatus. Trong nghiên cứu này, sự phát triển của dòng nấm A. fumigatus T1 sinh
tổng hợp phytase sẽ được khảo sát dưới các điều kiện như tuổi bào tử chủng vào, hàm
lượng phosphorus (KH2PO4), nguồn và hàm lượng nitrogen, nguồn và hàm lượng
carbon của môi trường nuôi cấy để tăng năng suất sinh tổng hợp phytase.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp phytase của nấm A. fumigatus và thiết lập được môi trường nuôi cấy thích
hợp nhất để thu nhận hàm lượng phytase cao.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Phytic acid và muối phytate
Phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate) là thành phần dự trữ phosphorus
chính, nguồn inositol và nhiều chất khoáng trong cây. Vì thế nó đóng vai trò quan
trọng đối với động vật cũng như thực vật, con người và vi khuẩn. Trong các loại hạt
dùng làm thực phẩm như hạt đậu, hạt ngũ cốc, và hạt có dầu, phytic acid chiếm 1-5%
trọng lượng của chúng. Thêm vào đó, trong tổng số lượng phosphorus ở các hạt này,
phần lớn phosphorus (75-80%) hiện diện dưới dạng phytic acid (Vohra và
Satyanarayana, 2003; Oh et al., 2004).
Trong tự nhiên, phytic acid tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate nên khi
nói về phytic acid thì thường dùng thuật ngữ phytate. Phytate chứa 14-25%
phosphorus, 12-20% calcium, 1-2% kẽm và sắt. Hỗn hợp muối Ca-Mg của phytic
acid được gọi là phytin). Trong lá mầm của các hạt đậu khô, phytate chứa 99% và
trong phôi là 1% (Ferguson và Bollard, 1976). Reddy et al. (1989) đã phát hiện ra hàm
lượng phytate cao nhất trong số các loại ngũ cốc là ở trong bắp (0,83-2,22%) và giữa
các cây họ đậu là ở trong đậu que (5,92 – 9,15%).
Phytic acid có công thức tổng quát là C6H18O24P6. Do cấu trúc phân tử đặc biệt
nên phytic acid có tác động kháng dưỡng mạnh trong thức ăn có nguồn gốc từ thực vật
(Pallauf và Rimbach, 1997). Khác với các phân tử chứa phosphorus vô cơ khác, phytic
acid là một phân tử có cấu trúc hóa học bền, chứa hàm lượng phosphate cao, mang
điện tích âm trong khoảng pH rộng. Ở điều kiện sinh lý bình thường phytic acid kết
hợp với các khoáng chất thiết yếu như calcium, magnesium, sắt và kẽm tạo phức
phytate-khoáng không hòa tan trong đường ruột ngăn cản sự hấp thu khoáng (Davies,
1982). Phytic acid cũng liên kết với các protein tạo thành phức hợp phytate-protein
làm giảm độ hòa tan của protein, dẫn đến giảm khả năng tiêu hóa protein và gây ức
chế men tiêu hoá (Pallauf và Rimbach, 1997).
2.2. Enzyme phytase
2.2.1. Sơ lƣợc về enzyme phytase
Phytase là một enzyme có thể phân hủy phytic acid và phytate để giải phóng ra
phosphoric acid, inositol, nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và
liposome. Phytase không chỉ có tác dụng phá vỡ phức hợp phytic, tăng khả năng hấp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
thụ phosphorus từ thực vật trong thức ăn, giải phóng một số amino acid, tinh bột,
calcium và các nguyên tố vi lượng khác; mà còn giúp hạn chế lượng phosphorus vô
cơ sử dụng và do đó có thể giúp giảm được chi phí thức ăn.
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) là một enzyme đặc
biệt của lớp phosphatase enzyme xúc tác thủy phân liên kết monoester của phytic
acid
(myo-inositol
1,2,3,4,5,6-hexakisdihydrogenphosphate
hay
myo-inositol
hexakisphosphate) giải phóng orthophosphate vô cơ và các dẫn xuất myo-inositol
chứa ít nhóm phosphate hơn, có thể thành myo-inositol tự do (Vohra và
Satyanarayana, 2003; Oh et al., 2004).
2.2.2. Đặc điểm của phytase
Phytase có trọng lượng phân tử lớn từ 40-500 kDa. Phytase có thể là những
protein đơn phân như phytase của Selenomonas ruminantium (46 kDa) (Yanke et al.,
1998), ở A. niger là 85 kDa (PhyA) (Ullah và Gibson, 1987) và 68 kDa (PhyB)
(Ehrlich et al., 1993); đồng thời, phytase có thể gồm nhiều tiểu đơn vị như ở
Schwanniomyces castellii (490 kDa) (Segueilha et al., 1992).
Cấu trúc của phytase đã được nghiên cứu nhờ kỹ thuật nhiểu xạ tia X (X-ray
crystallography hay X-ray diffraction). Cấu trúc bậc một của phytase từ A. ficcum gồm
594 amino acid trong đó có 37% amino acid không phân cực, 42% phân cực, 11% có
tính acid và 9,5% có tính kiềm (Ullah, 1988; Ullah và Dischinger, 1993). Ullah et al.
(1994) đã chỉ ra rằng cấu trúc bậc hai của phytase có 17,3% dạng -helix, 29% dạng
-sheet, 32,6% dạng turn; trong đó tryptophan và cầu nối disulfide đóng vai trò quan
trọng cho hoạt tính phytase. Các chất có khả năng phân cắt các cầu nối disulfide như
guanidinium hydrochloride hay -mercaptoethanol sẽ làm cho phytase mất hoạt tính
hoàn toàn (Ullah và Mullaney, 1996).
2.2.3. Phân loại và danh pháp
Dựa vào đặc điểm cấu trúc và cơ chế xúc tác, (Lei et al., 2007) đã chia phytase
thành bốn lớp: Histidine Acid Phosphatase (HAP), -Propellar Phytase (BPP),
Cysteine Phosphatase (CP) và Purple Acid Phosphatase (PAP).
Histidine Acid Phosphatase (HAP): các phytase thuộc nhóm này có cơ chế
phản ứng và cấu trúc hoạt điểm giống nhau. Ở đầu N, bắt đầu là trình tự các
amino acid RHGXRXP và kết thúc bằng HD ở đầu C (Wodzinski và Ullah,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
1996). Phytase được biết đến nhiều nhất trong nhóm này là Escherichia coli
phytase và các phytase từ nấm mốc như A. niger, A. fumigatus…
-Propellar Phytase (BPP): phân tử protein chủ yếu gồm -sheet xếp thành
cấu trúc sáu cánh quạt (six-bladed propeller). Tất cả các đặc tính của phytase như
xúc tác, khả năng chịu nhiệt đòi hỏi phải có sự hiện diện của Ca2+ trong môi
trường vì Ca2+ quyết định đến sự bám dính của phytase. Điển hình của nhóm
enzyme này là phytase từ Bacillus sp. (Lei et al., 2007).
Cysteine Phosphatase (CP): có ở một số vi sinh vật sống trong dạ cỏ như vi
khuẩn Selenomonas ruminantium. Phytase của S. ruminantium được nghiên cứu
nhiều nhất trong nhóm CP: hoạt động tốt ở pH 4-5,5 và nhiệt độ từ 50-55°C. Một
số ion kim loại như Cu2+, Zn2+, Hg2+ sẽ ức chế enzyme hoạt động.
Purple Acid Phosphatase (PAP): nhóm enzyme này cần có một hay một vài
ion kim loại như một chất hoạt hóa. PAP được tìm thấy ở lá mầm của cây đậu
nành (Glycine max L. (Merr.)) đang ở giai đoạn nảy mầm (Hegeman và Grabau,
2001).
Theo Ủy Ban Thuật ngữ thuộc Hiệp hội Sinh hóa và Sinh học Phân tử Quốc tế
(Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular
Biology-NC-IUBMB) và Hệ thống thông tin Enzyme (The Comprehensive Enzyme
Information System) dựa trên thứ tự ưu tiên nhóm phosphate bị phân cắt trong cấu trúc
vòng inositol, phytase được phân loại theo Bảng 1.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Bảng 1. Phân loại và danh pháp phytase (Scheer et al., 2011)
E.C. 3.1.3.8
Tên thông
thƣờng
Tên hệ thống
E.C. 3.1.3.26
E.C. 3.1.3.72
4-phytase
5- phytase
6-phytase
alkaline phytase
myo-inositol-
myo-inositol-
myo-inositol-
hexakisphosphate 3-
hexakisphosphate 4-
hexakisphosphate 5-
phosphohydrolase
phosphohydrolase
phosphohydrolase
phytate 4-phosphatase
phytate 5-phosphatase
1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-
1D-myo-inositol 1,2,3,5,6-
1L-myo-inositol 1,2,3,4,6-
pentakisphosphate +
pentakisphosphate +
pentakisphosphate +
phosphate
phosphate
phosphate
Aspergillus niger;
Escherichia coli;
Lilium longiflorum;
Aspergillus awamori;
Aspergillus niger;
Medicago sativa;
Aspergillus ficuum;
Aspergillus fumigatus;
Phaseolus vulgaris; Pisum
Aspergillus fumigatus
Bacillus sp.
sativum
3-phytase
1-phytase;
Các tên khác
phytate 3-phosphatase
Sản phẩm sau
phản ứng
Nguồn gốc
2.2.4. Cơ chế thủy phân phytate của phytase
Hình 1. Tƣơng tác phytase nhóm Histidine Phosphotase với cơ chất phytate
(Lim et al., 2000)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Phytase thủy phân liên kết ester trong phân tử phytic acid và phytate để giải
phóng ra myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và một gốc phosphate. Các phytase
thuộc nhóm histidine phosphatase có trình tự tương đối giống nhau (có RHG- ở đầu N
và -HD ở đầu C).
Ở đầu N (điện tích dương), các gốc amino acid R16, R20, R92, H303 và E304 sẽ
tương tác trực tiếp với các gốc phosphate trong phân tử phytic acid và có vai trò cố
định các gốc phosphate này (Hình 1). Đồng thời gốc amino acid H17 (không có trên
hình) hoạt động như một nhóm thân hạch (nucleophile) trong việc hình thành cầu nối
cộng hóa trị phosphohistidine giữa hoạt điểm của enzyme và cơ chất dưới sự giúp đỡ
của các gốc amino acid R20 và H303 sau đó sẽ cung cấp proton cho điện tích âm -Ocủa gốc -O-PO32- làm giải phóng nhóm -OH. Cuối cùng, gốc aspartate sẽ chuyển một
proton từ nước vào nhóm phosphohistidine và làm giải phóng nhóm phosphate ra khỏi
vòng inositol (Ostanin et al., 1992; Mullaney et al., 2002). Khi phytase thủy phân
phytic acid và muối phytate, các nguyên tố khoáng, protein, amino acid, tinh bột và
liposome cũng được tạo thành (Hình 2).
Hình 2. Phản ứng xúc tác của phytase (Yao et al., 2012)
2.2.5. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
2.2.5.1. pH tối ƣu
Phytase có pH tối ưu là 5. Nhiều nghiên cứu cho thấy đa phần các phytase là
phytase acid có pH tối ưu trong khoảng 4,5-6. Còn pH tối ưu của alkaline phytase là 8
từ những nghiên cứu về phytase từ hạt đậu (Scott, 1991), phấn hoa lily (Baldi et al.,
1988), và cây hương bồ (Hara et al., 1985). Phytase từ vi khuẩn có pH tối ưu trong
khoảng 6,5-7,5, theo Powar và Jagannathan (1982) thì phytase từ Bacillus có pH tối ưu
6-8. Các phytase có nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4-7,5. Tuy nhiên,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
theo Kerovuo (2000) đa số phytase thực vật pH tối ưu trong khoảng pH 4-5,6. Giá trị
pH tối ưu của các phytase nấm men tùy thuộc vào nhiệt độ (Nakamura et al., 2000) và
thường nằm trong khoảng 4-5. Không giống như tất cả các phytase từ nấm khác,
phytase từ A. fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng 4-7,3 (Wyss et al., 1999).
2.2.5.2. Nhiệt độ tối ƣu
Nhiệt độ tối ưu cho phytase nói chung từ 35-77°C. Nhiệt độ tối ưu của phytase từ
thực vật thấp hơn so với phytase vi sinh vật. Nhìn chung các phytase có khả năng chịu
nhiệt cao, đặc biệt trong trường hợp của phytase từ A. fumigatus có độ bền nhiệt rất
cao. Nghiên cứu của Pasamontes et al. (1997) cho thấy phytase từ loài nấm mốc này
có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100°C trong 20 phút mà hoạt tính xúc tác vẫn còn
giữ được 90% so với hoạt tính ban đầu.
2.2.5.3. Ảnh hƣởng của cơ chất
Phytase có phổ cơ chất đặc hiệu rộng bao gồm phytate, adenosine
monophosphate (AMP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine triphosphate (ATP),
guanosine monophosphate (GMP), guanosin triphosphate (GTP), nicotilamide-adenine
dinucleotide phosphate, p-nitrophenyl phosphate, phenyl phosphate, 1-naphthyl
phosphate, 2-naphthyl-phosphate, fructose 1,6-diphosphate, fructose 6-phosphate,
glucose
1-phosphate,
glucose
6-phosphate,
galactose
1-phosphate,
α-
glycerophosphate, β-glycerophosphate, pyridoxalphosphate, o-phospho-l-serine và
pyrophosphate. Trong đó, các phytase có tính đặc hiệu cao với phytate như phytase
acid từ E. coli (Greiner et al., 1993), A. niger, A. terreus (Wyss et al., 1999) và alkaline
phytase từ B. Subtilis (Powar và Jagannathan, 1982), phấn hoa lily (Barrientos et al.,
1994).
Các phytase từ A. fumigatus, E. nidulans và M. thermophia thể hiện sự đặc hiệu
cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A. niger, A. terrus CBS và E.coli có tính đặc
hiệu cao hơn đối với phytic acid (Wyss et al., 1999). Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây
ức chế enzyme. Ullah (1988) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt qua mức 2
nmol/L sẽ gây hiện tượng ức chế.
2.2.6. Ứng dụng của phytase
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Phytase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thức ăn chăn nuôi, thủy
sản, thực phẩm, sản xuất myo-inositol phosphate, công nghiệp giấy và bột giấy. Ngoài
ra enzyme này còn có ứng dụng trong nông nghiệp, làm gia tăng độ phì của đất trồng.
2.2.6.1. Trong công nghiệp thức ăn gia súc, thủy sản
Phosphorus rất cần cho động vật (thiếu phosphorus động vật chán ăn, sụt cân,
giảm sinh sản...) và myo-inositol (thành phần cấu tạo glycerophospholipid, là lipid chủ
yếu của màng sinh học). Vì vậy, phosphorus vô cơ thường được thêm vào thức ăn gia
súc. Việt Nam có số lượng gia súc và gia cầm rất lớn, tại những trang trại nuôi tập
trung, do thiếu phytase nên hằng năm lượng phosphorus được thải ra trong phân vật
nuôi xâm nhập vào môi trường và tích tụ trong đất là khá lớn. Các nhà chăn nuôi vừa
tốn chi phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Bằng cách bổ sung phytase từ vi sinh vật vào
thức ăn gia súc không chỉ làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn, giảm tác dụng
kháng dinh dưỡng của phytic acid mà còn làm giảm ô nhiễm môi trường. Phytase được
bổ sung vào khẩu phần thức ăn của lợn có chứa bắp và đậu tương sẽ chuyển đổi được
khoảng một phần ba lượng phosphate từ dạng không hấp thu sang dạng hấp thu được
(Cromwell et al., 1993). Các thí nghiệm tiếp theo của Cromwell et al. (1995), Yi et al.
(1996) và O'Quinn et al. (1997) cũng cho kết quả tương tự. Bên cạnh đó, phytase được
dùng trong chế biến thức ăn cá để làm giảm lượng phosphorus thải ra môi trường nước
và giảm chi phí bổ sung phosphorus vô cơ vào thức ăn cho cá (Kerovuo, 2000).
Vấn đề sử dụng phytase bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được phê duyệt ở 22
quốc gia. FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm
của Mỹ) đã công nhận phytase là chất không gây độc hại (Wodzinski và Ullah, 1996).
2.2.6.2. Trong sản xuất thực phẩm
Chế biến thực phẩm cho con người cũng là một lĩnh vực ứng dụng của phytase.
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu với hàm lượng phytate cao là các loại nguyên liệu
phổ biến trong chế biến thực phẩm. Phytate không tiêu hoá được trong ruột non ảnh
hưởng tiêu cực đến sự hấp thu của kẽm, calcium, magnesium và sắt. Nó cũng làm
giảm khả năng tiêu hóa của protein và ức chế các enzyme tiêu hóa. Do đó, việc bổ
sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có ý nghĩa lớn (Kerovuo, 2000).
Anno et al. (1985) đã loại phytate từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase từ lúa
mì. Bổ sung phytase của A. niger vào bột mì để tăng hấp thu sắt ở người (Sandberg et
al., 1996), làm bánh mì giàu sắt, phosphorus, protein dễ tiêu vì bánh mì bán ngoài thị
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -