Tài liệu Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện gò dầu, tỉnh tây ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Hạnh MSSV: 1051110011 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh ii Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh iii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang Trang bìa .................................................................................................................. i Lời cam đoan .......................................................................................................... ii Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii Mục lục .................................................................................................................. iv Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... vii Danh sách các bảng ............................................................................................. viii Danh sách các hình ................................................................................................ ix Mở đầu .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2 4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 2 Chương 1. Tổng quan ........................................................................................... 3 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp .... 3 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất .................................................................... 3 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất ............................................................. 3 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất ................................................... 5 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật ....................................... 9 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào ........................................................................ 9 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào .......................................................................... 9 1.2.3. Đặc điểm – tính chất.................................................................................... 10 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ..................................................... 13 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay .................................... 23 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................... 24 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................... 24 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 24 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 24 iv Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập ................................................................................... 24 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ........................................................................................... 24 2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị....................................................................... 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu .............................................................. 25 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu ....................................................................... 26 2.3.3. Phương pháp tăng sinh ................................................................................ 27 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ........................................ 27 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật ............................................................. 28 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn .... 30 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào .......................................................... 31 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 31 2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 31 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn ................................ 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập ........................................................................................ 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh ............................................................. 36 Chương 3. Kết quả và thảo luận ........................................................................ 38 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu .................. 38 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ ........................................................ 40 3.2.1. Kết quả phân lập .......................................................................................... 40 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ .............................................................................. 41 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................... 43 3.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase ................................................... 43 3.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase .................................................. 44 3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ................................................... 46 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase ....................................................... 47 v Đồ án tốt nghiệp 3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase ................................................... 49 3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase .................................................... 49 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh .................................................................................. 51 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. .................................................................. 52 3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .............................................................................. 53 3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 55 3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 57 3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ........ 59 3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ................... 63 Chương 4. Kết luận và đề nghị .......................................................................... 68 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 68 4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 68 Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 69 vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: carboxymethyl cellulose HEC: hydroxyethyl cellulose EG: endoglucanase CBH: exoglucanase CBD: cellulose binding domain Ser: Serine His: Histidine Asp: Acid aspartic TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar vii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập ....................................................................... 24 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập .......................... 40 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập ................. 41 Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập ..... 43 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .... 45 Bảng 3.5. Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập .................................................................................................................. 46 Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập ......... 48 Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 49 Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 50 Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. .................................................................. 52 Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli ............................................................................. 54 Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella ............................................................................ 56 Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio .............................................................................. 58 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus ............................................................................................. 60 Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập........................................................................... 64 Bảng 3.15.A. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ........................................................... 65 Bảng 3.15.B. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ........................................................... 66 viii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật ...................... 3 Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn ............................................................. 6 Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn............................................................................ 7 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase .............................. 14 Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein ........... 15 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease ........................................... 17 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase ........................................... 19 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa ................ 21 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước .............................................................................................................. 22 Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu ................................................................. 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.......................................................................... 31 Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp ............... 32 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar ............................................................................................................ 34 Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar ..................................................................................................... 34 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 35 Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar ... 35 Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase .................. 36 Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 39 Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập ....................... 42 Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102, ĐTT112 trên môi trường Starch Agar .................................................................. 44 Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar ............................................... 46 ix Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase ......................................................... 47 Hình 3.6. Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường Tween Peptone Agar ............................................................................................. 48 Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801 và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin.................................................................. 53 Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli .......................................................... 55 Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501, ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei .................................................................. 57 Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio .......................................................................... 59 Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801 đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua ................................. 61 x Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích đất. Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so với năm 2000. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập. Do đó, để có được mùa vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp quan trọng của các vi sinh vật. Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng. Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất. Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất. Với sự hiện diện thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc xác định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 1 Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập. - Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. 4. Phạm vi nghiên cứu Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh vật tự dưỡng. Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1. Ánh sáng Chất vô cơ SV sản xuất Chất hữu cơ SV tiêu thụ Chất hữu cơ SV phân huỷ Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung cấp cho nhiều cơ thể dạng sống. Nó đem lại hai hiệu quả: - Tăng độ phì của đất. - Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất. Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K... thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất. 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác... Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ. 3 Đồ án tốt nghiệp Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau: • Phân bố theo chiều sâu Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới. Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm. Ở vùng khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn. • Phân bố theo các loại đất Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng,... Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế. Do đó trong đất lúa nước các loại vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản nitrate hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí luôn nhỏ hơn 1. Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu. Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp 4 Đồ án tốt nghiệp đạt tới 4 – 5. Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít. • Phân bố theo cây trồng Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ. Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau. Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitrogen tự do hoặc hội sinh... Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ. 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009). 1.1.3.1. Vi khuẩn Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân) (prokaryote). Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm. Peptidoglycan là chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet 5 Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao. Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính. Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu, hình que và hình xoắn (Hình 1.1). b) a) c) Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c). Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự nhiên. Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất ... Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis, Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium,... 1.1.3.2. Vi nấm Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryote. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi). Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào. Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi, một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces. Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men. Sinh sản vô tính có nhiều 6 Đồ án tốt nghiệp cách: bào tử trần, bào tử kín. Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức khác nhau. Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium, Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium,... Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin,...). 1.1.3.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi, phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ. Kích thước của xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm. Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu của đất. Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất 7 Đồ án tốt nghiệp hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin,...). Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh. Đây là đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan,... Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease, amylase, chitinase, cellulase... Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật. Một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này gọi chung là Actynomycose. Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema, Pseudonocardia, Streptomyces... 1.1.3.4. Tảo Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát triển mạnh ở lớp đất mặt. Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ cho đất. Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do. Bên cạnh đó tảo còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió. 1.1.3.5. Nguyên sinh động vật (protozoa) Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào. Nhưng chính tế bào này là tế bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập. Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống. Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng roi (Flagellata), ... 8 Đồ án tốt nghiệp 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có thể vận chuyển qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: - Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. - Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. - Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). - Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. - Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. - Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác. 9 Đồ án tốt nghiệp Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O Tinh bột + H2O α-amylase R1OH + R2H Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và lipase… 1.2.3. Đặc điểm – tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: - Về bản chất, enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do có trọng lượng phân tử lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào. - Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Kiềm Protein - COO- + H+ Protein - COOH Acid Acid Protein - NH+ + H+ Protein - NH2 Kiềm - Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. - Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110 0C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt 10