VHHCHCTN
BKH&CN
BKH&CN
VHHCHCTN
BKH&CN
VHHCHCTN
Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ
B¸o c¸o tæng kÕt
NhiÖm vô Hîp t¸c quèc tÕ theo nghÞ ®Þnh th−
viÖt nam-hµn quèc
(2003-2006)
“nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh
sinh häc c¸c c©y thuèc d©n téc viÖt nam nh»m
t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao phôc vô
cuéc sèng”
C¬ quan chñ tr×: ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn
ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam
Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS Hoµng Thanh H−¬ng
GS. TS Ch©u V¨n Minh
6392
20/5/2007
Hµ Néi - 2007
Môc lôc
Th«ng tin tãm t¾t vÒ ®Ò tµi
Më ®Çu
PhÇn 1:Tæng quan, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
Ch−¬ng I: YÕu tè sao chÐp nh©n NF-κB vµ c¸c xu h−íng míi
trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th−
I.1. YÕu tè sao chÐp nh©n NF-κB
I.1.1. YÕu tè nh©n NF-κB-mét yÕu tè phiªn m· mÊu chèt trong c¸c bÖnh viªm
m·n tÝnh
I.1.2. YÕu tè nh©n NF-κB
I.2. C¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung
th−
I.2.1. Vai trß cña NF-κB trong c¸c bÖnh viªm
I.2.2. ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi NF-κB
I.2.3. Nh÷ng vÊn ®Ò liªn quan ®Õn ®iÒu trÞ bÖnh
I.2.4. Sö dông c¸c chÊt øc chÕ NF-κB trong c¸c liÖu ph¸p ch÷a bÖnh
Ch−¬ng II: môc tiªu, §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.1. Môc tiªu, ®èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi
II.1.1. Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi
II.1.2. §èi t−îng nghiªn cøu
II.2. C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.2.1. Ph−¬ng ph¸p thu thËp mÉu, gi¸m ®Þnh tªn ph©n loµi
II.2.2. Ph−¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc
vµ nghiªn cøu ho¸ häc
II.2.3. C¸c ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc
II.2.3.1. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-kB
II.2.3.2. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO
II.2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo
II.2.3.4. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng Cyclooxygenases (COX)
II.2.4. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt, x¸c ®Þnh cÊu tróc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh
häc
II.2.5. Ph−¬ng ph¸p x©y dùng c¬ së d÷ liÖu thùc vËt
PhÇn 2: KÕt qu¶ nghiªn cøu
Ch−¬ng III : KÕt qu¶ thu thËp mÉu vµ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu
III.1. KÕt qu¶ thu thËp mÉu
III.2. KÕt qu¶ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu
Chu¬ng IV. kÕt qu¶ sµng läc vµ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh NF-κB
IV.1. Quy tr×nh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB
IV.2.KÕt qu¶ sµng läc ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB
i
1
3
5
5
5
5
5
8
8
9
10
11
13
13
13
13
13
13
13
15
15
15
17
19
19
20
22
22
22
34
38
38
41
Ch−¬ng V: KÕt qu¶ nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng
ho¹t tÝnh sinh häc
V.1 Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y ngò gia
b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr)
V.2. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y tr¹ch
t¶ (Alisma plantago-aquatica)
V.3. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y muèi
hoa tr¾ng (Rhus chinensis)
V.4. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y mãc
diÒu (Caesalpinia decapetala)
V.5. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y cïm
côm r¨ng (Ehretia dentata Courch)
V.6. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y cá lµo
(Chromolaena odorata)
V.7. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y bïm
bôp (Mallotus apelta)
V.8.Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y sau sau
(Liquidambar formosana Hance)
PhÇn 3: KÕt luËn
Danh môc c¸c c«ng tr×nh ®∙ c«ng bè
Tµi liÖu tham kh¶o
ii
48
48
144
184
207
240
270
305
399
405
410
411
Th«ng tin tãm t¾t vÒ ®Ò tµi
1. Tªn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc c¸c c©y
thuèc d©n téc ViÖt Nam nh»m t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao phôc vô cuéc
sèng”.
“A Cooperation on the Conservation of indigenous Biodiversity in Viet Nam &
Their Utilization for the Development of High-value Biotech Product”
2. Thêi gian thùc hiÖn: 01/2003 – 12/.2006
3. C¬ quan thùc hiÖn:
PhÝa ViÖt Nam:
ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn
§Þa chØ: 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi
§iÖn tho¹i: 84-4-8363375; Fax: 84-4-7564390;Email:
[email protected]
PhÝa Hµn Quèc:
Korea Research Institute for Bioscience and Biotechnology (Kribb),
Taejon, Korea.
College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), Taejon,
Korea.
4. C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam
18-Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi
5. Chñ nhiÖm §Ò tµi:
PhÝa ViÖt Nam:
PGS.TS Hoµng Thanh H−¬ng
GS. TS. Ch©u V¨n Minh
ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn
ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam
Tel: 84.4.8363375; Fax: 84.4.7564390; Email:
[email protected]
PhÝa Hµn Quèc:
1. Dr Jung Joon Lee
Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB).
Tel: 042-860-4360; Fax: 042-860-4595; Email: jjlee@mail. kribb.re.kr
2. Prof. Dr. Young Ho Kim
College of harmacy, Chungnam National University, Taejon, Korea
6. Môc tiªu cña ®Ò tµi:
1. Sµng läc, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− theo c¬ chÕ øc chÕ NF-κB mét
sè c©y thuèc ViÖt Nam.
2. TËp trung nghiªn cøu ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc mét sè ®èi t−îng thùc
vËt cã triÓn väng ®−îc lùa chän th«ng qua sµng läc nh»m t¸ch chiÕt, x¸c
®Þnh cÊu tróc c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh, ®Þnh h−íng sö dông cã hiÖu qu¶ nguån
tµi nguyªn thiªn nhiªn cña ViÖt Nam.
1
3. §µo t¹o c¸n bé th«ng qua dù ¸n (TiÕn sü, thùc tËp sinh) ®Ó t¨ng c−êng
n¨ng lùc nghiªn cøu.
7. Danh s¸ch c¸n bé tham gia chÝnh
STT
Hä vµ tªn
Häc hµm,
häc vÞ
C¬ quan c«ng t¸c
1
Lª Mai H−¬ng
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
2
Phan V¨n KiÖm
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
3
Ph¹m Quèc Long
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
4
TrÇn B¹ch D−¬ng
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
5
Vò M¹nh Hïng
TS
Häc viÖn Qu©n Y
6
NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Chi
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
7
NguyÔn H. Toµn Phan
NCS
ViÖn sinh häc NhiÖt ®íi
8
Lª ThÞ Ph−¬ng Quúnh
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
9
L−u V¨n ChÝnh
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
10
Lª Minh Hµ
TS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
11
NguyÔn H¶i §¨ng
Th.S
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
12
NguyÔn Hoµi Nam
NCS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
13
NguyÔn TiÕn §¹t
NCS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
14
NguyÔn Xu©n C−êng
Th.S
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
15
NguyÔn Ph−¬ng Th¶o
CN
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
16
Hoµng Lª TuÊn Anh
NCS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
17
NguyÔn H÷u Tïng
KS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
18
TrÇn Hång Quang
CN
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
19
Hµ ViÖt B¶o
NCS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
20
NguyÔn ThÞ Hång V©n
NCS
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
21
Ph¹m H¶i YÕn
Th.S
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
22
NguyÔn Xu©n NhiÖm
Th.S
ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn
2
Më ®Çu
YÕu tè nh©n kappa B (Nuclear Factor kappa B, viÕt t¾t lµ NF-κB) lÇn ®Çu
tiªn ®−îc t×m ra vµo n¨m 1986 bëi c¸c nhµ khoa häc Mü Sen vµ Baltimore ph¸t
hiÖn ra ®Çu n¨m 1986 vµ ®−îc nhËn d¹ng lµ mét chÊt ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña
gen chuçi nhÑ kappa trong c¸c lympho bµo B ë chuét. Nh÷ng nghiªn cøu tiÕp
theo ®· chØ ra r»ng NF-κB cßn cã mÆt ë nhiÒu tÕ bµo kh¸c nhau trong c¬ thÓ.
Ngay sau khi ph¸t hiÖn ra, c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· tËp trung nghiªn cøu
vÒ c¬ chÕ g©y bÖnh cña NF-κB khi chóng bÞ ho¹t ho¸ vµ ®· chØ ra r»ng chÝnh NFκB, mét yÕu tè phiªn m· cã ë kh¾p n¬i cã tÇm quan träng ®Æc biÖt trong c¸c ®¸p
øng miÔn dÞch vµ viªm. NF-κB bÞ ho¹t ho¸ ®· t¸c ®éng ®Õn c¸c gen dÝch ë vïng
khëi ®Çu cña sù phiªn m·. ChÝnh v× vËy NF-κB nhanh chãng trë thµnh ®èi t−îng
nghiªn cøu lý t−ëng trong c¸c nghiªn cøu thö nghiÖm ®Ó t×m ra c¸c hîp chÊt ch÷a
trÞ ung th− vµ c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh .
Trong khu«n khæ ch−¬ng tr×nh hîp t¸c nghiªn cøu khoa häc vµ c«ng nghÖ
theo NghÞ ®Þnh th− gi÷a ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn víi Tr−êng §¹i
häc Tæng hîp Chung Nam vµ ViÖn Sinh häc vµ C«ng nghÖ Sinh häc Hµn quèc
(2003-2006), chóng t«i ®· tiÕn hµnh sµng läc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh kh¸ng
NF-κB cña 512 mÉu thùc vËt ViÖt Nam. KÕt qu¶ sµng läc ®· ph¸t hiÖn ra 49 loµi
thùc vËt cã ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB ®¸ng quan t©m ®Ó nghiªn cøu s©u vÒ mÆt ho¸
häc, nh»m t×m kiÕm nh÷ng ho¹t chÊt sinh häc tõ nguån tµi nguyªn thiªn nhiªn
phong phó cña ViÖt Nam phôc vô cuéc sèng.
Trong ®Ò tµi nµy, chóng t«i tr×nh bµy kÕt qu¶ gÇn ®©y vÒ nghiªn cøu ho¸
häc, ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB vµ mét sè ho¹t tÝnh sinh häc kh¸c cña 8 loµi thùc vËt
ViÖt Nam, bao gåm:
1. C©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus) thuéc hä Nh©n s©m
(Araliaceae)
2. C©y Tr¹ch t¶ (Alisma
plantago-aquatica) thuéc hä Tr¹ch t¶
(Alismataceae)
3. C©y Mãc diÒu (Caesalpinia decapetala) thuéc hä §Ëu (Fabaceae).
4. C©y Muèi hoa tr¾ng (Rhus chinensis) thuéc hä §µo lén hét
(Anacardiaceae).
5. C©y cïm côm r¨ng ((Ehretia dentanta) thuéc hä D©y gèi (Celastraceae)
6. C©y Cá lµo (Chromolaena odorata) thuéc hä Cóc (Asteraceae)
7. C©y Bïm bôp (Mallotus apelta) thuéc hä ThÇu dÇu (Euphorbiaceae)
8. C©y Sau sau (Liquidambar formosana Hance) thuéc hä Sau sau
(Altingiaceae)
§©y lµ nh÷ng ®èi t−îng thùc vËt ®· ®−îc lùa chän th«ng qua ch−¬ng tr×nh
sµng läc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB trong khu«n khæ ®Ò tµi hîp t¸c
quèc tÕ theo NghÞ ®Þnh th− ViÖt Nam-Hµn Quèc (2003-2006).
3
PhÇn I: tæng quan, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
Ch−¬ng 1. yÕu tè sao chÐp nh©n nf-κB vµ c¸c xu h−íng míi
trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th−
I.1. YÕu tè sao chÐp nh©n NF-kB
I.1.1.YÕu tè nh©n-κB – mét yÕu tè phiªn m∙ mÊu chèt trong c¸c bÖnh viªm
m∙n tÝnh.
Trong c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh nh− hen, viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh viªm
ruét, bÖnh vÈy nÕn, mét sè cytokin tËp hîp c¸c tÕ bµo miÔn dÞch vµ tÕ bµo bÞ viªm
®−îc ho¹t ho¸ ®Õn vÞ trÝ tæn th−¬ng, do ®ã lµm nÆng thªm vµ lµm dai d¼ng tr¹ng
th¸i viªm. C¸c tÕ bµo ®−îc ho¹t ho¸ ®ã s¶n xuÊt ra nhiÒu chÊt trung gian kh¸c cña
qu¸ tr×nh viªm [1].
Nguyªn nh©n g©y ra c¸c bÖnh nµy vÉn lµ ®iÒu bÝ Èn, song ®· biÕt qu¸ tr×nh
bÖnh lµ kÕt qu¶ cña sù t¸c ®éng qua l¹i cña c¸c yÕu tè di truyÒn vµ c¸c yÕu tè m«i
tr−êng. C¸c gen nh− c¸c gen quyÕt ®Þnh sù dÞ øng trong bÖnh hen vµ c¸c gen ®¸p
øng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn trong bÖnh viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh viªm ruét cã thÓ
quyÕt ®Þnh tÝnh dÔ bÞ m¾c cña bÖnh nh©n ®èi víi bÖnh vµ quyÕt ®Þnh møc ®é nÆng
nhÑ cña bÖnh, song c¸c yÕu tè m«i tr−êng, th−êng lµ kh«ng biÕt, cã thÓ quyÕt
®Þnh sù diÔn biÕn cña qu¸ tr×nh bÖnh. Mét khi ®· ®−îc x¸c lËp th× qu¸ tr×nh viªm
cña bÖnh m·n tÝnh h×nh nh− b¾t ®Çu cã ®µ cña nã. Vßng luÈn quÈn nµy cã thÓ bÞ
øc chÕ b»ng liÖu ph¸p glucococticoit hoÆc liÖu ph¸p gi¶m miÔn dÞch, song hiÖn
nay kh«ng cã ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ ch÷a khái ®èi víi bÊt kú bÖnh viªm m·n tÝnh
nµo.
Sù hiÓu biÕt cña chóng ta vÒ c¸c c¬ chÕ ph©n tö mµ qua ®ã c¸c tÝn hiÖu m«i
tr−êng lµm thay ®æi sù biÓu hiÖn gen ®· t¨ng lªn ®¸ng kÓ. Cã c¸c yÕu tè ®Æc hiÖu
di truyÒn ®iÒu tiÕt sù phiªn m· cña c¸c gen ®Ých b»ng c¸ch liªn kÕt víi c¸c phÇn
tö nhËn biÕt ®Æc hiÖu, mµ c¸c phÇn tö nµy th−êng n»m ë vïng khëi ®Çu sù phiªn
m· (5’) h−íng ng−îc chiÒu cña gen [2]. C¸c yÕu tè nµy th−êng lµm t¨ng tèc ®é
phiªn m· cña gen, v× vËy lµm t¨ng sù t¹o thµnh ARN th«ng tin vµ protein. NhiÒu
yÕu tè trong sè c¸c yÕu tè phiªn m· nµy lµ ®Æc hiÖu ®èi víi tÕ bµo vµ cã vai trß
quan träng trong sù biÖt ho¸ tÕ bµo vµ sù ®iÒu hoµ c¸c qu¸ tr×nh tÕ bµo ®Æc hiÖu
nh− qu¸ tr×nh t¨ng sinh. C¸c yÕu tè phiªn m· kh¸c cã ë kh¾p n¬i vµ ho¹t tÝnh cña
chóng cã thÓ bÞ lµm thay ®æi bëi c¸c tÝn hiÖu m«i tr−êng. ChÝnh c¸c yÕu tè phiªn
m· võa nãi nµy cã thÓ cã vai trß then chèt trong c¸c ®¸p øng miÔn dÞch vµ viªm.
Mét yÕu tè phiªn m· cã ë kh¾p n¬i cã tÇm quan träng ®Æc biÖt trong c¸c ®¸p øng
miÔn dÞch vµ viªm lµ yÕu tè nh©n-κB (NF-κB) [3].
I.1.2. YÕu tè nh©n NF-κB
NF-κB lÇn ®Çu tiªn ®· ®−îc nhËn d¹ng lµ mét chÊt ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña
gen chuçi nhÑ kappa trong c¸c lympho bµo B ë chuét [4], song sau ®ã ®· ®−îc
t×m thÊy ë nhiÒu tÕ bµo kh¸c nhau. NhiÒu protein NF-κB kh¸c nhau ®· ®−îc x¸c
®Þnh ®Æc tÝnh. D¹ng ®−îc ho¹t ho¸ cña NF-κB lµ mét dÞ ®ime, th−êng gåm 2
4
protein: mét tiÓu ®¬n vÞ p65 (còng d−îc gäi lµ relA) vµ mét tiÓu ®¬n vÞ p50. C¸c
tiÓu ®¬n vÞ kh¸c nh− rel, relB, v-rel vµ p50 còng cã thÓ lµ thµnh phÇn cña NF-κB
®−îc ho¹t ho¸ vµ cã lÏ lµ c¸c d¹ng kh¸c nhau cña NF-κB cã thÓ ho¹t ho¸ c¸c tËp
hîp kh¸c nhau cña c¸c gen ®Ých. Trong c¸c tÕ bµo kh«ng ®−îc kÝch thÝch, NF-κB
®−îc t×m thÊy trong bµo t−¬ng(tÕ bµo chÊt) vµ nã bÞ liªn kÕt víi IκBα vµ IκBβ mµ
c¸c phÇn tö nµy ng¨n c¶n NF-κB ®i vµo nh©n tÕ bµo. Khi c¸c tÕ bµo ®ã bÞ kÝch
thÝch, th× c¸c kinaza ®Æc hiÖu photphoryl ho¸ IκB lµm cho nã bÞ gi¶m ph©n nhanh
chãng bëi c¸c proteasom [5] (H×nh I.1.2 a ). Sù gi¶i phãng NF-κB tõ IκB dÉn tíi
sù chuyÓn NF-κB vµo nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y nã liªn kÕt víi c¸c ®o¹n tr×nh tù ®Æc
hiÖu trong c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña c¸c gen ®Ých.
Bëi v× gen IκBα (tr−íc ®©y ®−îc gäi lµ MAD-3) cã ®o¹n (tr×nh tù) nhËn
biÕt κB trong vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña gen ®ã, nªn NF-κB kÝch thÝch g©y
ra sù tæng hîp IκBα, mµ phÇn tö nµy ®i vµo nh©n ®Ó liªn kÕt víi NF-κB ®· ®−îc
ho¹t ho¸ vµ vËn chuyÓn NF-κB tíi bµo t−¬ng, nhê vËy kÕt thóc sù ho¹t ho¸ biÓu
hiÖn cña gen. Sù ph©n gi¶i h−íng ®Ých cña IκBα ë chuét dÉn tíi sù ho¹t ho¸ ®−îc
kÐo dµi cña NF-κB ®Ó ®¸p øng l¹i c¸c kÝch thÝch viªm vµ chuét bÞ chÕt do viªm
lan réng. Tr¸i l¹i, sù tæng hîp IκBβ kh«ng bÞ kÝch thÝch ®Ó diÔn ra bëi NF-κB,
cho nªn NF-κB h×nh nh− lµ ®−îc ho¹t ho¸ (®−îc liªn kÕt víi ADN) trong mét
kho¶ng thêi gian dµi h¬n ë c¸c kiÓu tÕ bµo cã IκBβ chiÕm chñ yÕu [6].
H×nh I.1.2a: Sù ho¹t ho¸ NF-κB
Sù ho¹t ho¸ NF-κB bao gåm sù photphoryl ho¸ vµ gi¶m ph©n ph©n gi¶i protein tiÕp sau cña
protein øc chÕ IκB bëi c¸c IκB kinaza ®Æc hiÖu. NF-κB tù do (mét dÞ ®ime gåm P50 vµ p65) sau ®ã
chuyÓn vµo nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y nã liªn kÕt víi c¸c vÞ trÝ κB ë c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña c¸c gen
qui ®Þnh c¸c protein viªm nh− c¸c cytokin, c¸c enzym vµ c¸c ph©n tö dÝnh kÕt. P lµ protein, mARN lµ
ARN th«ng tin.
5
NhiÒu kÝch thÝch g©y ho¹t ho¸ NF-κB, bao gåm c¸c cytokin, c¸c phÇn tö
ho¹t ho¸ protein kinaza C, c¸c virus vµ c¸c chÊt oxy ho¸ [3] (B¶ng I.1.2 a). Cã thÓ
cã nhiÒu con ®−êng truyÒn tÝn hiÖu cã liªn quan, song tÊt c¶ c¸c kÝch thÝch nµy
®Òu t¸c ®éng qua trung gian c¸c protein kinaza mµ c¸c enzym nµy xóc t¸c cho sù
photphoryl ho¸ (vµ nh− vËy lµm gi¶m ph©n) IκB. C¸c kinaza ®Æc hiÖu cña IκB gÇn
®©y ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh [7]. C¸c chÊt chèng oxy ho¸ nh− pyrolidin
dithiocarbamat vµ axetylxystein cã thÓ c¶n trë sù ho¹t ho¸ mét sè kinaza trong
c¸c protein kinaza nµy, ®iÒu ®ã nãi lªn lµ lo¹i chÊt chøa oxy mang ho¹t tÝnh ph¶n
øng cã vai trß trung gian [8].
B¶ng I.1.2 a: C¸c kÝch thÝch ho¹t ho¸ NF-κB
- Virus cóm
- Virus Esptein- Bar
- Cytomegalovirus (virus cù bµo)
- Adenovirus
C¸c kÝch thÝch miÔn dÞch
- Phytohemaglutinin
- C¸c kh¸ng thÓ kh¸ng CD-3( nhê sù
ho¹t ho¸ lympho bµo T)
- Kh¸ng nguyªn
C¸c kÝch thÝch kh¸c
- Lipopolysaccarit
Bøc x¹ tö ngo¹i
C¸c Cytokin
YÕu tè ho¹i tö u α
Interleukin-1β
Interleukin-17
C¸c chÊt ho¹t ho¸ protein kinaza C
C¸c este phorbol
YÕu tè ho¹t ho¸ tiÓu cÇu
C¸c chÊt oxy ho¸
Hidro peoxyt
- Ozon
C¸c virus
- Virus trong niªm m¹c mòi
NF-κB ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña nhiÒu gen tham gia vµo c¸c ®¸p øng miÔn
dÞch vµ viªm. Song ®ã kh«ng ph¶i lµ yÕu tè phiªn m· duy nhÊt tham gia vµo sù
®iÒu tiÕt c¸c gen nµy vµ nã th−êng ho¹t ®éng kÕt hîp víi c¸c yÕu tè phiªn m·
kh¸c nh− protein ho¹t ho¸ 1 (AP-1) vµ yÕu tè nh©n cña interleukin-6, mµ c¸c yÕu
tè nµy còng tham gia vµo sù ®iÒu tiÕt c¸c gen cña qu¸ tr×nh viªm vµ c¸c gen tham
gia vµo miÔn dÞch.
NF-κB t¸c ®éng lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c cytokin, c¸c chemokin cã lîi cho
qu¸ tr×nh viªm (c¸c cytokin ho¸ øng ®éng thu hót c¸c tÕ bµo viªm vµo c¸c vÞ trÝ
viªm), lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c enzym g©y s¶n sinh c¸c chÊt trung gian cña qu¸
tr×nh viªm, lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c thô thÓ miÔn dÞch, còng nh− c¸c phÇn tö dÝnh
kÕt cã vai trß mÊu chèt trong sù tËp hîp ban ®Çu c¸c b¹ch cÇu ®Õn c¸c vÞ trÝ viªm
(B¶ng I.1.2b).
B¶ng I.1.2b: C¸c protein bÞ ®iÒu tiÕt bëi NF-κB
C¸c cytokin cã lîi cho qu¸ tr×nh viªm
C¸c enzym viªm
YÕu tè ho¹i tö u α
Nit¬ monooxyt sythetaza cã thÓ bÞ
Interleukin-1β
c¶m øng t¹o thµnh
Interleukin-2
Xyclo oxygenaza-2 cã thÓ bÞ c¶m
Interleukin-6
øng t¹o thµnh
YÕu tè kÝch thÝch quÇn thÓ ®¹i thùc
5- Lipoxygenaza
bµo tÕ bµo h¹t
Phospholipaza A2 trong dung dÞch
6
YÕu tè kÝch thÝch quÇn thÓ tÕ bµo bµo t−¬ng
h¹t
C¸c ph©n tö dÝnh kÕt
C¸c chemokin
Ph©n tö dÝnh kÕt gian bµo 1
Interleukin-8
Ph©n tö dÝnh kÕt tÕ bµo-m¹ch m¸u 2
Protein viªm ®¹i thùc bµo 1α
E-selectin
Protein ho¸ øng ®éng ®¹i thùc bµo
C¸c thô thÓ
1.
- Thô thÓ interleukin-2 (chuçi α)
Gro-α, -β vµ -γ
- Thô thÓ tÕ bµo T (chuçi β)
Eotaxin
Do vËy sù ho¹t ho¸ NF-κB dÉn tíi sù t¨ng mét c¸ch phèi hîp sù biÓu hiÖn
cña nhiÒu gen mµ s¶n phÈm cña c¸c gen ®ã lµm trung gian cho c¸c ®¸p øng viªm
vµ miÔn dÞch. VÝ dô, sù kÝch thÝch mét c¸ch phèi hîp sù biÓu hiÖn cña c¸c gen qui
®Þnh E-selectin, interleukin-8 vµ yÕu tè ho¹i tö u α (TNF-α), dÉn tíi sù tËp hîp vµ
ho¹t ho¸ c¸c b¹ch cÇu trung tÝnh.
C¸c s¶n phÈm cña c¸c gen ®−îc ®iÒu tiÕt bëi NF-κB còng g©y ho¹t ho¸ NFκB. C¶ hai cytokin cã lîi cho viªm interleukin-1β vµ TNF-α ®Òu g©y ho¹t ho¸
NF-κB vµ ®−îc ho¹t ho¸ bëi NF-κB. KiÓu chu tr×nh ®iÒu tiÕt tÝch cùc nµy cã thÓ
lµm t¨ng sù duy tr× dµi l©u c¸c ®¸p øng viªm côc bé (H×nh I.1.2b).
H×nh I.1.2b: NF-κB lµ mét yÕu tè ®iÒu tiÕt viªm
NF-κB cã thÓ ®−îc ho¹t ho¸ bëi nhiÒu tÝn hiÖu viªm kh¸c nhau, dÉn tíi sù biÓu hiÖn phèi hîp cña
c¸c gen qui ®Þnh nhiÒu cytokin, chemokin, c¸c enzym vµ c¸c tÕ bµo dÝnh kÕt. C¸c cytokin interleukin-1β
vµ yÕu tè ho¹i tö u α (TNF-α ), c¶ hai yÕu tè nµy ®Òu g©y ho¹t ho¸ NF-κB vµ ®−îc lµm t¨ng lªn bëi NF-
κB. mARN chØ ARN th«ng tin.
7
I. 2. C¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung
th−
I. 2.1. Vai trß cña NF-κB trong c¸c bÖnh viªm
NF-κB lµm t¨ng sù biÓu hiÖn cña c¸c gen qui ®Þnh nhiÒu cytokin, c¸c
enzym vµ c¸c ph©n tö dÝnh kÕt trong c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh. Mét gen nh− vËy lµ
gen qui ®Þnh nit¬ monooxyt (NO) synthaza cã thÓ bÞ c¶m øng sinh ra [9], mµ sù
biÓu hiÖn cña nã ®−îc t¨ng lªn ë c¸c tÕ bµo biÓu m« ®−êng h« hÊp vµ bëi c¸c ®¹i
thùc bµo ë c¸c bÖnh nh©n hen, ë c¸c tÕ bµo biÓu m« ®¹i trµng cña c¸c bÖnh nh©n
bÞ viªm loÐt ®¹i trµng vµ ë c¸c tÕ bµo mµng ho¹t dÞch cña c¸c khíp bÞ viªm. Sù
biÓu hiÖn t¨ng lªn nµy ®−îc ph¶n ¸nh b»ng sù t¨ng l−îng nit¬ monooxyt trong h¬i
thë ra cña c¸c bÖnh nh©n hen [10] vµ ë ®¹i trµng cña c¸c bÖnh nh©n bÞ viªm loÐt
®¹i trµng ho¹t ®éng [11], còng nh− bëi nång ®é nitrit (NO2-) t¨ng trong n−íc tiÓu
cña bÖnh nh©n bÞ viªm khíp d¹ng thÊp. Xyclooxygenaza-2 -mét enzym kh¸c cã
thÓ bÞ c¶m øng sinh ra ®−îc ®iÒu tiÕt bëi NF-κB - lµ enzym g©y ra sù s¶n xuÊt
t¨ng prostagla®in vµ thromboxan trong c¸c bÖnh viªm [12].
Trong tÊt c¶ c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh, c¸c ph©n tö dÝnh kÕt tËp hîp c¸c tÕ
bµo viªm nh− c¸c b¹ch cÇu trung tÝnh, b¹ch cÇu −a eosin vµ c¸c lympho bµo T tõ
hÖ tuÇn hoµn ®Õn vÞ trÝ viªm. NF-κB ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña nhiÒu gen m· ho¸
c¸c ph©n tö dÝnh kÕt, nh− ph©n tö dÝnh kÕt gian baß 1, ph©n tö dÝnh kÕt tÕ bµo
m¹ch m¸u 1 vµ E-selectin.
Sù s¶n xuÊt interleukin-1β, TNF-α, interleukin-6, yÕu tè kÝch thÝch tËp hîp
®¹i thùc bµo tÕ bµo h¹t vµ nhiÒu cytokin ho¸ øng ®éng (c¸c chemokin) ®−îc lµm
t¨ng lªn ë bÖnh nh©n hen, viªn khíp d¹ng thÊp, vÈy nÕn vµ viªm ruét. TÊt c¶ c¸c
cytokin nµy ®Òu cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh viªm. Interleukin-1β vµ
TNF-α cã thÓ ¶nh h−ëng ®Õn møc ®é nÆng nhÑ cña bÖnh, cã thÓ lµ do sù ho¹t ho¸
kÐo dµi NF-κB. ViÖc ®iÒu trÞ bÖnh nh©n viªm khíp d¹ng thÊp b»ng c¸c kh¸ng thÓ
kh¸ng TNF-α cã thÓ khèng chÕ ®−îc bÖnh khã ch÷a nµy.
C¸c nhiÔm virus, nh− virus trong niªm m¹c mòi vµ virus cóm, g©y c¸c c¬n
cÊp trÇm träng thªm cña bÖnh hen b»ng c¸ch kh¬i mµo mét ®¸p øng viªm kÐo
dµi. G©y nhiÔm thùc nghiÖm virus trong niªm m¹c mòi lµm ho¹t ho¸ NF-κB vµ
kÝch thÝch sù chÕ tiÕt interleukin-6 ë c¸c tÕ bµo biÓu m« cña mòi. Trong c¸c bÖnh
viªm kh¸c, c¸c virus cã thÓ ho¹t ho¸ NF-κB th«ng qua c¸c c¬ chÕ cã sù s¶n sinh
c¸c chÊt trung gian chøa oxy cã kh¶ n¨ng ph¶n øng hoÆc cã sù ho¹t ho¸ c¸c
protein kinaza dÉn tíi sù phosphoryl ho¸ IκB. Stress oxy hãa còng cã thÓ lµm sù
viªm nÆng thªm. VÝ dô, ë c¸c ®éng vËt, sù hÝt oz«n g©y ra sù viªm ®−êng h« hÊp
d−íi vµ kÝch thÝch c¸c gen viªm bÞ kiÓm so¸t bëi NF-κB.
Cã t−¬ng ®èi Ýt ph−¬ng ph¸p ®o trùc tiÕp sù ho¹t ho¸ NF-κB ë c¸c tÕ bµo
viªm hoÆc ë c¸c m« bÞ viªm. ViÖc cho c¸c b¹ch cÇu ®¬n nh©n to trong m¸u ngo¹i
biªn, c¸c tÕ bµo biÓu m« hoÆc m« phæi cña ng−êi tiÕp xóc víi c¸c cytokin cã lîi
cho qu¸ tr×nh viªm, nh− interleukin-1β vµ TNF-α hoÆc víi c¸c chÊt oxy ho¸, dÉn
tíi ho¹t ho¸ râ rµng NF-κB. T−¬ng tù, ë ®éng vËt, sù ho¹t ho¸ c¸c lympho bµo T
8
b»ng c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng CD-3 dÉn tíi sù ho¹t ho¸ râ rµng NF-κB [13]. NF-κB
còng cã thÓ ®−îc ho¹t ho¸ ë c¸c ®¹i thùc bµo trong ®êm, ë c¸c tÕ bµo biÓu m« vµ
c¸c ®¹i thùc bµo trong bÖnh phÈm sinh thiÕt phÕ qu¶n tõ c¸c bÖnh nh©n hen còng
nh− trong c¸c tÕ bµo mµng ho¹t dÞch vµ c¸c tÕ bµo néi m« ë khíp cña c¸c bÖnh
nh©n viªm khíp d¹ng thÊp [14].
MÆc dï cã nhiÒu ®iÓm t−¬ng tù trong c¸c ®¸p øng viªm ë c¸c bÖnh nh©n
viªm khíp, hen, viªm ruét vµ c¸c bÖnh viªm kh¸c, song vÉn cã nh÷ng kh¸c nhau
quan träng ë kiÓu tÕ bµo viªm cã liªn quan vµ c¸c chÊt trung gian cña qu¸ tr×nh
viªm. C¸c kh¸c nhau nµy cã thÓ liªn quan víi sù chÕ tiÕt c¸c cytokin ®Æc hiÖu,
nh− interleukin-5, mµ yÕu tè nµy ë bÖnh nh©n hen th× thóc ®Èy viªm kiÓu b¹ch
cÇu −a eosin. NF-κB nªn ®−îc xem lµ mét c¬ chÕ lµm t¨ng vµ kÐo dµi tr¹ng th¸i
viªm, mµ cã thÓ lµm trÇm träng thªm qu¸ tr×nh viªm ®Æc hiÖu cho bÖnh, th«ng
qua sù ho¹t ho¸ phèi hîp cña nhiÒu gen cã quan hÖ ®Õn viªm. Nh− vËy, sù cã mÆt
chØ mét m×nh interleukin-5 sÏ dÉn tíi sù tÝch luü t−¬ng ®èi Ýt b¹ch cÇu −a eosin ë
m«, nh−ng t¸c ®éng cña cytokin cã thÓ ®−îc lµm t¨ng lªn b»ng c¸ch tiªm t¹i chç
chemokin eotaxin ®Æc hiÖu víi b¹ch cÇu −a eosin; sù phiªn m· c¸c gen qui ®Þnh
c¶ interleukin-5 vµ eotaxin cã lÏ bÞ ¶nh h−ëng bëi NF-κB [15].
I. 2.2. ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi NF-κB
C¬ chÕ ph©n tö ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi sù viªm m·n tÝnh vÉn
cßn ch−a hiÓu ®−îc râ, song ngµy cµng cã nhiÒu thªm b»ng chøng lµ chóng øc
chÕ t¸c dông cña c¸c yÕu tè phiªn m· nh− AP-1 vµ NF-κB. Trong bµo t−¬ng, c¸c
glucococticoit ho¹t ho¸ c¸c thô thÓ glucococticoit mµ sau ®ã c¸c glucococticoit
chuyÓn vËn tíi nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y chóng liªn kÕt thµnh c¸c ®ång ®ime víi c¸c
ph©n tö ®¸p øng glucococticoit ë c¸c gen ®Ých ®¸p øng l¹i steroit, dÉn tíi sù phiªn
m· t¨ng. Tuy nhiªn, c¸c glucococticoit lµm gi¶m sù phiªn m· cña c¸c gen tham
gia vµo qu¸ tr×nh viªm vµ c¸c gen nµy kh«ng cã c¸c phÇn tö ®¸p øng
glucococticoit cã thÓ nhËn d¹ng trong c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña chóng,
cho thÊy r»ng ph¶i cã mét c¬ chÕ kh¸c nµo ®ã dµn xÕp ¶nh h−ëng øc chÕ cña c¸c
hocm«n. Cã thÓ cã sù t−¬ng t¸c protein-protein trùc tiÕp gi÷a thô thÓ
glucococticoit vµ AP-1 vµ gi÷a thô thÓ nµy víi NF-κB [16]. Nh− vËy, c¸c
glucococticoit ho¹t ho¸ c¸c thô thÓ glucococticoit, mµ sau ®ã chóng liªn kÕt víi
NF-κB ®· ®−îc ho¹t ho¸ vµ ng¨n c¶n NF-κB liªn kÕt víi c¸c vÞ trÝ κB trªn c¸c gen
cã vai trß trong qu¸ tr×nh viªm (H×nh I.2.2a). T−¬ng t¸c nµy cã thÓ x¶y ra trong
bµo t−¬ng hoÆc nh©n tÕ bµo.
C¸c glucococticoit còng lµm t¨ng sù phiªn m· cña gen ®èi víi IκBα, bëi
vËy lµm t¨ng sù t¹o thµnh protein nµy; protein nµy liªn kÕt víi NF-κB ®· ®−îc
ho¹t ho¸ trong nh©n tÕ bµo. Protein IκBα cã lÏ kÝch thÝch g©y sù ph©n ly cña NFκB tõ c¸c vÞ trÝ κB trªn c¸c gen ®Ých vµ lµm cho NF-κB chuyÓn dÞch tíi bµo t−¬ng
(H×nh I.2.2a). C¬ chÕ nµy ®· ®−îc quan s¸t thÊy ë c¸c tÕ bµo T vµ c¸c b¹ch cÇu
®¬n nh©n to nh−ng nã còng cã thÓ xÈy ra ë tÊt c¶ c¸c kiÓu tÕ bµo. C¸c
9
glucococticoit lµ c¸c chÊt øc chÕ m¹nh sù ho¹t ho¸ NF-κB, ®iÒu nµy cã thÓ lý gi¶i
®a sè c¸c t¸c dông chèng viªm [17].
H×nh I.2.2a: S¬ ®å t¸c dông cña c¸c glucococticoit lªn sù ho¹t ho¸ NF-κB
Sù ho¹t ho¸ NF-κB, vÝ dô nh− bëi c¸c cytokin, bÞ c¶n trë bëi c¸c glucococticoit. C¸c phøc hîp
glucococticoit-thô thÓ liªn kÕt víi tiÓu ®¬n vÞ p65 cña NF-κB vµ hîp thÓ nµy ng¨n c¶n sù ho¹t ho¸ NF-κB
cña c¸c gen øng víi qu¸ tr×nh viªm. Sù tæng hîp IκBα ®−îc kÝch thÝch bëi sù liªn kÕt cña c¸c phøc hîp
glucococticoit-glucococticoit-thô thÓ vµo phÇn tö ®¸p øng glucococticoit trong vïng khëi ®Çu sù phiªn m·
cña gen IκBα . DÊu X mµu ®á chØ qu¸ tr×nh bÞ ng¨n c¶n, vµ mARN chØ ARN th«ng tin.
I. 2.3. Nh÷ng vÊn ®Ò cã liªn quan ®Õn ®iÒu trÞ bÖnh
NF-κB ®−îc ho¹t ho¸ bëi nhiÒu yÕu tè (nhiÔm virus, c¸c chÊt oxy ho¸ vµ
c¸c kh¸ng nguyªn) lµm t¨ng ®¸p øng viªm. Sù ho¹t ho¸ nµy vÒ phÇn nã l¹i dÉn tíi
sù biÓu hiÖn phèi hîp cña nhiÒu gen m· ho¸ c¸c protein (nh− c¸c cytokin, c¸c
chemokin, c¸c ph©n tö dÝnh kÕt vµ c¸c enzym) tham gia vµo sù tæng hîp chÊt
trung gian vµ kÐo dµi thªm ®¸p øng viªm. V× vËy, NF-κB lµ mét ®Ých hiÓn nhiªn
cho c¸c kiÓu ®iÒu trÞ chèng viªm míi. C¸c glucococticoit lµ c¸c chÊt øc chÕ h÷u
hiÖu NF-κB, nh−ng chóng còng cã t¸c dông phô tíi néi tiÕt vµ chuyÓn ho¸ khi
®−îc sö dông theo kiÓu ®iÒu trÞ toµn th©n. C¸c t¸c dông phô nµy kh«ng thÓ x¶y ra
®èi víi chÊt øc chÕ NF-κB ®Æc hiÖu h¬n. C¸c chÊt chèng oxy ho¸ øc chÕ sù ho¹t
ho¸ cña NF-κB lµ c¸c hîp chÊt cßn ch−a ®−îc nghiªn cøu réng r·i. Bëi v× c¸c
chÊt chèng oxy ho¸ s½n cã hiÖn nay nh− c¸c vitamin C, E vµ axetylxystein lµ
t−¬ng ®èi yÕu, nªn cÇn cã c¸c chÊt chèng oxy ho¸ m¹nh h¬n, cã t¸c dông l©u bÒn
h¬n. Aspirin vµ natri salixilat còng øc chÕ sù ho¹t ho¸ cña NF-κB, mÆc dï chØ ë
nång ®é t−¬ng ®èi cao, vµ c¸c muèi cña vµng còng øc chÕ ®−îc sù liªn kÕt NF-κB
vµo ADN [18], ®iÒu nµy cho thÊy r»ng t¸c dông chèng viªm cña c¸c lo¹i thuèc
nµy, Ýt nhÊt, mét phÇn cã thÓ qui cho sù øc chÕ NF-κB.
10
Mét sè chÊt øc chÕ NF-κB cã trong tù nhiªn ®· ®−îc t×m ra nh− gliotoxyn
lÊy tõ Asper gillus lµ mét chÊt øc chÕ m¹nh t−¬ng ®èi ®Æc hiÖu. Cytokin chèng
viªm interleukin-10 còng øc chÕ t¸c dông cña NF-κB th«ng qua t¸c dông lªn
IκBα. C¸c ph¸t hiÖn b−íc ®Çu cho thÊy r»ng interleukin-10 cã t¸c dông chèng
viªm ë c¸c bÖnh nh©n viªm ruét. Sù chuyÓn gen IκBα qua trung gian a®enovirus
®· ®−îc th«ng b¸o lµ øc chÕ ®−îc sù ho¹t ho¸ c¸c tÕ bµo néi m«. HiÖn nay c¸c
IκB kinaza ®Æc hiÖu ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh, nªn cã lÏ lµ cã thÓ nhËn d¹ng c¸c
chÊt øc chÕ chän läc b»ng c¸c th− viÖn sµng läc c¸c hîp chÊt ho¸ häc.
Cã thÓ lµ kh«ng kh«n ngoan nÕu ng¨n chÆn sù ho¹t ho¸ NF-κB trong mét
thêi gian dµi, bëi v× yÕu tè nµy cã vai trß quyÕt ®Þnh trong ®¸p øng miÔn dÞch nh−
vËy vµ c¸c ®¸p øng b¶o vÖ kh¸c. Sù ph¸ vì cã chñ ®Ých (hoÆc lo¹i bá) cÊu phÇn
p65 cña NF-κB lµ viÖc lµm dÉn tíi tö vong bëi v× sÏ xuÊt hiÖn c¸c bÊt th−êng vÒ
ph¸t triÓn kÌm theo [19], cßn nÕu thiÕu cÊu phÇn p50 sÏ dÉn tíi c¸c thiÕu hôt miÔn
dÞch vµ t¨ng kh¶ n¨ng dÔ bÞ nhiÔm trïng [20]. Bëi v× NF-κB th−êng ho¹t ®éng kÕt
hîp víi c¸c yÕu tè phiªn m· kh¸c nªn cã thÓ ®¹t ®−îc sù c¶n trë chän läc h¬n ë
c¸c kiÓu tÕ bµo cô thÓ hoÆc c¶n trë mét tËp hîp cã giíi h¹n c¸c gen b»ng c¸ch t¹o
ra c¸c hîp chÊt øc chÕ c¸c t−¬ng t¸c hiÖp ®ång cña nhiÒu yÕu tè phiªn m·.
I.2.4. Sö dông c¸c chÊt øc chÕ Nf-kB trong c¸c liÖu ph¸p ch÷a bÖnh
Mét sè hîp chÊt cã t¸c dông øc chÕ Nf-kB ®· ®−îc øng dông trong mét sè
liÖu ph¸p trÞ bÖnh ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng sau:
Hîp chÊt
Tµi liÖu tham kh¶o
ABR-25757 (oxo-quinoline-3-carboxamide)
2-(1-adamantylamino)-6-methylpyridine
(AdAMP)
2-(4-Amino-3-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazole
1-b-D-Arabinofuranosyl-cytosine (ara-C))
Anthralin
Azidothymidine (AZT)
Baicalein
Bleomycin
Bryostatin-1
Bucillamine metabolite SA 981
Camptothecin
Celecoxib
Ciprofibrate
Cisplatin
Cycloprodigiosin
Dacarbazine
Daio-Orengedeokuto
11
Carlsten et al, 2004
Lasek et al, 2002
Brantley et al, 2005
Strum et al, 1994
Schmidt et al, 1996
Kurata, 1994
Chou et al, 2003
Ishii & Takada, 2002
Do et al, 2004
Distler et al, 2004
Piret & Piette, 1996
Kim et al, 2004
Li et al, 1996
Nie et al, 1998
Teshima et al, 2004
Lev et al, 2003
Cho et al, 2004
Daunomycin
Daunorubicin
Diazoxide
Diclofenac
5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid
Doxorubicin
Epinephrine
Etoposide
Flavone-8-acetic acid
Haloperidol
Imiquimod
Isochamaejasmin
Kunbi-Boshin-Hangam-Tang
Lithium
Methamphetamine
Mitoxantrone
Morphine
Nipradilol
Norepinephrine
Nystatin
Oltipraz
Phenobarbital
Proteasome inhibitors
Protocatechuic acid
SN38 (metabolite of CPT-11)
Tamoxifen
Taxol (Paclitaxel)
Vinblastine
Vincristine
WR1065
Das & White, 1997; Hellin et al, 1998
Wang et al, 1996
Eliseev et al, 2004
Cho et al, 2005
Ching et al, 1999
Das & White, 1997
Lymperopouos et al, 2006
Bessho et al, 1994
Ching et al, 1999
Post et al, 1998
Schon & Schon, 2006
Tian et al, 2005
Koo et al, 2001
Nemeth et al, 2001
Asanuma & Cadet, 1998
Boland et al, 2000
Yin et al, 2006
Ando et al, 2005
Minneman et al, 2000
Ogawa et al, 2005
Nho & O'Dwyer, 2004
Li et al, 1996
Dolcet et al, 2006
Zhou-Stache et al, 2002
Kishida et al, 2004
Ferlini et al, 1999
Hwang & Ding, 1995
Rosette & Karin, 1995
Das & White, 1997
Grdina et al, 2002
12
Ch−¬ng II: môc tiªu, §èi t−îng vµ Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.1. Môc tiªu, ®èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi
II.1.1. Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi
- TiÕn hµnh sµng läc, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ NF-κB mét sè c©y thuèc cæ
truyÒn cña ViÖt Nam. Trªn c¬ së c¸c kÕt qu¶ vÒ sµng läc ho¹t tÝnh øc chÕ NF-κB
lùa chän mét sè ®èi t−îng thùc vËt ®Ó tËp trung nghiªn cøu ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh
sinh häc.
- T¸ch chiÕt vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh tõ mét sè ®èi t−îng
thùc vËt ®· ®−îc lùa chän th«ng qua sµng läc ho¹t tÝnh, nh»m ®Þnh h−íng sö dông
cã hiÖu qu¶ nguån tµi nguyªn thiªn nhiªn cña ViÖt nam.
- §µo t¹o c¸c c¸n bé nghiªn cøu (TiÕn sÜ, thùc tËp sinh) nh»m t¨ng c−êng
n¨ng lùc nghiªn cøu cña ViÖn.
II.1.2. §èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi
Trong thêi gian thùc hiÖn dù ¸n (2003-2006) ®Ò tµi ®· tiÕn hµnh thu h¸i
c¸c mÉu thùc vËt thµnh nhiÒu ®ît ®Ó tiÖn cho viÖc gi¸m ®Þnh tªn khoa häc vµ ®Þnh
loµi. §Ó x©y dùng c¬ së d÷ liÖu thùc vËt chóng t«i ®· thu thËp c¸c th«ng tin khoa
häc cña c¸c mÉu thùc vËt vµ c¸c th«ng tin kÌm theo bao gåm: VÞ trÝ lÊy mÉu, thêi
gian, m« t¶ mÉu, ¶nh chôp mÉu, tiªu b¶n mÉu…®Ó sö dông trong viÖc t¹o tiªu b¶n
mÉu vµ x©y dùng file l−u tr÷ th«ng tin vÒ tõng mÉu thùc vËt. Lµm tiªu b¶n mÉu vµ
l−u tr÷ tiªu b¶n mÉu ®−îc l−u tr÷ t¹i ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn.
H×nh ¶nh vµ c¸c th«ng tin chi tiÕt kÌm theo cña c¸c mÉu thùc vËt ®−îc tr×nh bµy
trong c¬ së d÷ liÖu x©y dùng riªng cho ®Ò tµi.
Qua nghiªn cøu c¸c tµi liÖu trong vµ ngoµi n−íc, ®ång thêi kÕt hîp víi
kinh nghiÖm y häc cæ truyÒn trong n−íc. §Ò tµi ®· chän lùa ®−îc h¬n 512 mÉu
thùc vËt ë kh¾p mäi miÒn ViÖt Nam vµ tiÕn hµnh thu h¸i theo c¸c ®ît kh¸c nhau.
II.2. C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu.
I.2.1. Ph−¬ng ph¸p thu thËp mÉu, gi¸m ®Þnh tªn ph©n lo¹i
§Ò tµi ®· tiÕn hµnh 5 ®ît thu lÊy mÉu t¹i c¸c ®Þa ®iÓm ph©n bè thùc vËt ë
c¸c tØnh phÝa B¾c ViÖt Nam vµ mét sè mÉu thùc vËt ë c¸c d¶i miÒn Trung vµ Nam
ViÖt Nam. Sè mÉu thu ®−îc tËp trung ë 147 hä (512 loµi thùc vËt), c¸c ®Þa ®iÓm
thu mÉu ®· ®−îc ghi l¹i trªn b¶n ®å theo c«ng nghÖ GIS.
C¸c mÉu thùc vËt thu ®−îc ®−îc gi¸m ®Þnh tªn ph©n loµi theo c¸c tiªu
chuÈn ph©n lo¹i thùc vËt.
I.2.2. Ph−¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh sinh
häc vµ nghiªn cøu ho¸ häc
C¸c mÉu thùc vËt thu thËp ®−îc ®Òu ®−îc xö lý s¬ bé ®Ó æn ®Þnh ho¹t chÊt.
Sau ®ã tiÕn hµnh chiÕt mÉu víi MeOH, t¹o dÞch chiÕt th«. C¸c mÉu ®Òu ®−îc
chiÕt theo qui tr×nh thèng nhÊt ®−îc x©y dùng trong khu«n khæ ®Ò tµi nµy.
a.Xö lý mÉu thùc vËt
MÉu thùc vËt sau khi thu vÒ ®−îc tiÕn hµnh b¶o qu¶n, t¹o tiªu b¶n theo quy
tr×nh thèng nhÊt sau:
13
- Chôp ¶nh n¬i lÊy mÉu, chôp ¶nh mÉu.
- Röa s¹ch ®Ó lo¹i t¹p bÈn.
- T¹o tiªu b¶n mÉu.
- LËp danh s¸ch mÉu thùc vËt:
Ký hiÖu mÉu = VN + H(Korea) + sè thø tù lÊy mÉu.
VÝ dô: MÉu c©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr) thu
t¹i L¹ng S¬n, mÉu sè thø tù 62 trong ®ît lÊy mÉu. §−îc ký hiÖu lµ VNH-62.
C¸c tiªu b¶n mÉu ®−îc l−u gi÷ trong phßng l−u gi÷ mÉu cña ViÖn Hîp
chÊt thiªn nhiªn ®Ó ®¶m b¶o mÉu kh«ng bÞ háng vµ mÊt tiªu b¶n, tiÖn cho viÖc tra
cøu vµ t×m th«ng tin sau nµy.
b. T¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh.
Do yªu cÇu cña ph−¬ng ph¸p sµng läc ho¹t tÝnh nªn viÖc chuÈn bÞ c¸c mÉu
thùc vËt ®Ó tiÕn hµnh sµng läc cÇn cã mét sù thèng nhÊt trong qu¸ tr×nh chuÈn bÞ
mÉu. Qua tham kh¶o vµ nghiªn cøu c¸c quy tr×nh chiÕt mÉu ®Ó sµng läc ho¹t tÝnh
sinh häc cña phÝa Hµn quèc chóng t«i ®· x©y dùng quy tr×nh chiÕt c¸c mÉu thùc
vËt phôc vô cho ®Ò tµi nh− sau:
B−íc 1: ChuÈn bÞ mÉu: C¸c mÉu thùc vËt ®−îc sÊy kh« hoÆc ph¬i kh«.
B−íc 2: C©n l−îng mÉu thu ®−îc vµ xay mÉu (Tuú theo lo¹i mÉu thùc vËt:
l¸, th©n hoÆc rÔ sö dông c¸c thiÕt bÞ xay vµ nghiÒn mÉu kh¸c nhau).
B−íc 3: MÉu thùc vËt ®−îc tiÕn hµnh chiÕt 3 lÇn b»ng MeOH trªn thiÕt bÞ
chiÕt siªu ©m (Ultrasonic 2010, 950W) ë nhiÖt ®é 40-50oC, thêi gian chiÕt mçi
lÇn tèi thiÓu 60 phót.
B−íc 4: DÞch chiÕt cña 3 lÇn chiÕt ®−îc läc qua giÊy läc (Whatman,
d=240nm, No 1) gép l¹i vµ tiÕn hµnh cÊt lo¹i dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ë nhiÖt
®é d−íi 50oC thu ®−îc dÞch c« MeOH.
C¸ch ®¸nh sè ký hiÖu mÉu th«: Ký hiÖu mÉu th« = Ký hiÖu mÉu+ ký hiÖu
dung m«i. Trong ®ã: Dung m«i MeOH (Ký hiÖu 00); Dung m«i n-Hexan (01);
Dung m«i Clorofom (Ký hiÖu 02); Dung m«i Butanol (Ký hiÖu 03)…
VÝ dô:
MÉu c©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr) thu t¹i
L¹ng s¬n, mÉu sè 62 trong ®ît lÊy mÉu. §−îc ký hiÖu lµ VNH-62.00.
B−íc5: C©n dÞch chiÕt vµ tÝnh l−îng cÆn dÞch chiÕt phÇn tr¨m hiÖu suÊt.
B−íc 6: B¶o qu¶n mÉu trong c¸c lä ®ùng cÆn dÞch chiÕt (theo tiªu chuÈn
b¶o qu¶n mÉu) ®Ó phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh vµ l−u tr÷ l©u dµi..
14
II.2.3. C¸c ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc
II.2.3.1. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-kB (Nuclear Factor kappa B
assay)
C¸c thö nghiÖm ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB ®−îc tiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p
SEAP ASSAY trªn dßng tÕ bµo chuÈn RAW264 t¹i Phßng Nghiªn cøu ung th−,
ViÖn Sinh häc vµ C«ng nghÖ sinh häc Hµn Quèc (KRIBB).
II.2.3.2.Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO (Monoamine oxidase assay)
Monoamine oxidase (MAO) lµ mét enzyme mµng ty l¹p thÓ ngoµi.
Monoamine oxidase xóc t¸c cho qu¸ tr×nh «xi ho¸ ®Ò amin c¸c dÉn truyÒn thÇn
kinh nh− catecholamine, serotonin… vµ lµ nguyªn nh©n chÝnh g©y ra c¸c bÖnh
trÇm uÊt, ham muèn tù tö. Monoamine oxidase tån t¹i d−íi hai d¹ng: MAO-A vµ
MAO-B do sù kh¸c biÖt trong ph−¬ng thøc lùa chän c¸c c¬ chÊt mµ nã xóc t¸c,
®é nh¹y c¶m øc chÕ vµ trËt tù c¸c amine trong cÊu tróc ph©n tö. MAO-A ®Ò
amine ho¸ chñ yÕu c¸c serotonin, norepinephrine, trong khi MAO-B l¹i «xi ho¸
β-phenylenthylamine vµ benzylamine. C¶ hai enzyme nµy ®Òu tån t¹i trong vá
n·o ng−êi, ®Æc biÖt lµ vá n·o tr−íc. Cho ®Õn nay, cÊu tróc kh«ng gian 3 chiÒu cña
c¸c ph©n tö MAO vÉn ch−a ®−îc lµm s¸ng tá hoµn toµn.
Tõ nh÷ng n¨m 1950, thÕ hÖ ®Çu tiªn c¸c chÊt øc chÕ MAO ®· ®−îc ®−a
vµo thö nghiÖm ®Ó ch÷a trÞ c¸c bÖnh trÇm c¶m rÊt tèt, tèt h¬n nh÷ng ch÷a trÇm
c¶m th−êng dïng thuéc hä tricyclit.
Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ng−êi ta ®Æc biÖt chó ý ®Õn MAO bëi hai lý do:
+ Mét lµ, ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn ra ®éc tè thÇn kinh 1-methyl-4-phenyl
1,2,3,6-tetrahydro-pyridine (MDTP) lµ nguyªn nh©n g©y ra c¸i chÕt cña c¸c n¬
ron thÇn kinh g©y tiÕt Dopamin vµ lµm gi¶m héi chøng Parkinson ë ng−êi.
+ Hai lµ, c¸c chÊt øc chÕ MAO kh«ng g©y ra t¸c ®éng phô nh− t¨ng huyÕt
¸p, rèi lo¹n nhÞp tim nh− c¸c ®iÒu trÞ thÇn kinh kh¸c.
Vµi n¨m trë l¹i ®©y, c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· quan t©m rÊt nhiÒu
®Õn c¸c chÊt øc chÕ MAO cã nguån gèc thiªn nhiªn biÓn do kh¶ n¨ng ch÷a trÞ
bÖnh trÇm c¶m, còng nh− ®éc tè thÊp cña chóng.
• Nguyªn liÖu
C¸c hîp chÊt s¹ch ph©n lËp ®−îc tõ c¸c thùc vËt trong khu«n khæ ®Ò tµi
- Chuét nh¾t tr¾ng (Male, ICR, 25-30 g/con)
- Dung dÞch ®−êng
- Dung dÞch ®Öm KH2PO4 (pH = 7.4 )
- Dung dÞch ®Öm NaH2PO4(pH = 7.4)
- Dung dÞch ZnSO4 10%
- Dung dÞch KOH 1N
- Dung m«i dimethylsulfoside
- Dung dÞch kynuramine (c¬ chÊt )
- M¸y ly t©m (Simazu 5400 vßng/phót)
- M¸y ®o mËt ®é quang ( HITACHI-F 3000)
15
- Tñ gi÷ nhiÖt (Hitachin,1200C).
• Ph−¬ng ph¸p tiÕn hµnh vµ ®äc kÕt qu¶
B−íc 1: ChuÈn bÞ Enzyme Monoamine oxidase MAO tõ n·o chuét tr¾ng.
Chuét nh¾t tr¾ng (male, ICR, 25-30 g/con) do Trung t©m ®éng vËt thùc
nghiÖm Samyook (Suwon, Korea) cung cÊp. C¸c ph©n ®o¹n ty l¹p thÓ tõ n·o
chuét ®−îc ®iÒu chÕ theo ph−¬ng ph¸p cña Naoi vµ ®−îc m« t¶ theo s¬ ®å H×nh
II.2.4a.
8.8 g n·o chuét trong 20 ml
dung dÞch ®−êng 0.25 M
10 ml dung dÞch ®Öm 10
mM KH2PO4 (pH = 7.4 )
§ång ho¸ 1200 vßng/ phót trong vßng 5 phót
400C
DÞch ®ång nhÊt
Ly t©m 16000 vßng/phót trong 20 phót, 400C
§ãng viªn 1,5 g
T¹o huyÒn phï trong 11.5 ml dung dÞch ®Öm
10 mM NaH2PO4(pH=7.4)
Enzyme
H×nh II.2.4.a: S¬ ®å ®iÒu chÕ MAO th« tõ n∙o chuét
B−íc 2: Thö ho¹t tÝnh kh¸ng MAO in vitro
Ho¹t tÝnh kh¸ng MAO in vitro ®−îc tiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p Kraml vµ
Naoi cã c¶i biªn lùa chän ph¶n øng vµ m« h×nh chuyÓn ho¸ Kynuramine thµnh 4hydroxy quinoline («xy ho¸ ®Ò amine kynuramine thµnh 4-hydroxy quinoline cã
ph¸t huúnh quang).
C¸c mÉu cÇn thö nghiÖm ë ®©y lµ c¸c mÉu thùc vËt vµ c¸c hîp chÊt s¹ch ®·
®−îc ph©n lËp, ®−îc pha trong dung m«i dimethylsulfoside (DMSO) theo tû lÖ
nång ®é 250 µg/ml. Nång ®é cña 4-hydroxy quinoline ®−îc x¸c ®Þnh b»ng mËt
®é quang vµ ®−îc ®o trªn m¸y HITACHI-F 3000 ë c¸c b−íc sãng 380 nm (ph¸t
x¹) vµ 315 nm (kÝch thÝch). Hçn hîp ph¶n øng gåm 75µl dung dÞch ®Öm photphat
0.2 M (pH=7.4) 5 µl enzyme, 2 µg dung dÞch chÊt øc chÕ(c¸c mÉu thö) vµ 20 µl
dung dÞch kynuramine (c¬ chÊt). L¾c nhÑ hçn hîp ph¶n øng vµ tiÕn hµnh ph¶n
øng trong 30 phót ë nhiÖt ®é 37 0C. Dõng ph¶n øng b»ng c¸ch bæ sung 25 µl dung
dÞch ZnSO4 10% vµ 5 µl dung dÞch KOH 1N. Sau ®ã ly t©m hçn hîp ph¶n øng ë
3000 vßng/ phót trong 5 phót, bæ sung thªm 140 µl dung dÞch NaOH 1M cho
tr¹ng th¸i ph¸t huúnh quang cña 4- hydroxy quinoline æn ®Þnh. C−êng ®é huúnh
quang ®−îc ®o ë b−íc sãng 380 nm (ph¸t x¹) vµ 315 nm (kÝch thÝch). C¸c b−íc
tiÕn hµnh thö nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë h×nh II.2.4b.
16
73 ml dung dÞch ®Öm 0.2 M KHPO4 (pH=7.4)
5µl enryme MAO 2µl mÉu thö
20 µl dung dÞch kynuramine 500 µM
L¾c, ®−a vµo tñ Êm 370C
Gi÷ trong tñ Êm 370 C trong vßng 30 phót
Thªm 25 µl ZnSO4 10% vµ 5µl d2 1N NaOH
Ly t©m 3000 vßng/phót trong 5 phót.
Thªm 140 µl d2 1N NaOH
PhÇn dÞch trong
§o nång ®é 4-hydroxy quinoline b»ng m¸y HITACHI F3000 (λph¸t x¹ =380 nm λkÝchthÝch =315 nm)
H×nh II.2.4b: Thö nghiÖm ho¹t tÝnh kh¸ng MAO cña c¸c hîp chÊt s¹ch thu
®−îc
B−íc 3: Xö lý sè liÖu thu ®−îc
C«ng thøc tÝnh phÇn tr¨m gi¸ trÞ øc chÕ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO
Acontr -Asamp
Tû lÖ øc chÕ (%) =
x100%
Acontr -Ablank
Trong ®ã: Acontr - C−êng ®é huúnh quang mÉu kiÓm tra (kh«ng cã mÉu
thö).
Asamp - C−êng ®é huúnh quang mÉu thö.
Ablank - C−êng ®é huúnh quang mÉu tr¾ng (kh«ng cã mÉu thö,
kh«ng cã enzyme).
II.2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo (Cytotoxic activity
assay).
• Nguyªn liÖu:
- Dßng tÕ bµo
Dßng KB (Human epidemoid carcinoma - ung th− biÓu m«) tõ phßng thÝ
nghiÖm Bioassay tr−êng §¹i häc D−îc Illinois- USA.
Dßng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung th− mµng tö cung).
Dßng RD (Rhabdosarcoma-Ung th− mµng tim ) tõ ViÖn VSDT Trung
−¬ng.
- M«i tr−êng nu«i cÊy tÕ bµo: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) hoÆc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Cã bæ
sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin-Streptomycin
sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf
Serum).
17