Tài liệu Nghiên cứu quy trình chế biến và phân lập vi sinh vật hiện diện trong cá sặc (trichogaster trichopterus & trichogaster microlepis) lên men chua, xương mềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus và Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG CÁ SẶC (Trichogaster trichopterus và Trichogaster microlepis) LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp PGS. TS. Nguyễn Văn Thành 2015 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là cải thiện quy trình chế biến, phân lập vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm. Từ đó xác định nguyên nhân làm mềm xương cá và nghiên cứu bổ sung nguồn vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng ổn định, đảm bảo an toàn thực phẩm, không phụ thuộc nhiều vào điều kiện tự nhiên và có thể ứng dụng vào sản xuất, giải thích hiện tượng trên cơ sở khoa học phục vụ cho sản xuất, nghiên cứu và giảng dạy. Với mục tiêu đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình chế biến và phân lập vi sinh vật hiện diện trong cá sặc lên men chua, xương mềm” đã tiến hành khảo sát các quy trình chế biến hiện đang được áp dụng, từ đó xây dựng quy trình chung và xác định các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm trong từng công đoạn để xây dựng quy trình chế biến với các thông số tối ưu; xác định yếu tố làm mềm xương cá trong quá trình lên men; phân lập và định danh các dòng vi sinh vật dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử; nghiên cứu cải tiến quy trình chế biến, khả năng bảo quản sản phẩm ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả thí nghiệm cho thấy sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm là dạng sản phẩm lên men lactic có màu vàng nâu sáng; thơm mùi mắm; các vị chua, mặn, ngọt hài hòa; cấu trúc cơ thịt và xương mềm mại; mật số vi khuẩn lactic 1,7-2,1.107 cfu/g; pH 4,1-4,5; acid lactic 2,0-3,0%; protein 10,0-11,3% trong đó acid amin 0,5-0,7%, NH3 0,07-0,09%; chất béo 1,5-2,3%; muối 6,06,7%. Quy trình chế biến được thực hiện như sau: nguyên liệu cá sặc tươi được cắt bỏ vây, đầu nội tạng, để vẩy (2,5 giờ); ngâm nước (16 giờ); chà vẩy, rửa sạch (0,5 giờ); để ráo (6 giờ). Tiến hành phối trộn (tính trên lượng cá đã làm sạch) 1% ethanol, 10% muối, 15% đường, 10% (gừng, tỏi, ớt) và 5% thính. Sau đó, hổn hợp được cho vào hủ, đậy kín và ủ lên men 30 ngày. Tác nhân chính làm cho xương cá mềm đi chính là do acid lactic sinh ra trong quá trình lên men hòa tan calci trong xương ra môi trường ngoài. Calci bị hòa tan trong điều kiện tiếp xúc với môi trường acid hữu cơ có pH 4,0. Sau 72 giờ tiếp xúc, khoảng 40-60% lượng calci ban đầu bị hòa tan và làm cho xương cá trở nên mềm dẻo hơn. Kết quả phân lập và giải trình tự gene xác định được bốn dòng vi khuẩn và hai dòng nấm men hiện diện trong sản phẩm. Bốn dòng vi khuẩn được xác định là Pediococcus acidilactici (L1), Lactobacillus farciminis (L2, L3) và Staphylococcus hominis (L4) có đặc điểm: khuẩn lạc màu trắng hoặc trắng sữa, i kích thước khoảng 1-2 mm; tế bào Gram dương, hình que, hình cầu đôi hoặc cầu đơn, catalase và oxidase âm tính, amylase dương tính. Trong đó ba dòng vi khuẩn L1, L2, L3 là vi khuẩn lactic và cả ba dòng này đều có khả năng sinh enzyme protease, phát triển mạnh trên môi trường có nguồn carbohydrate chính được bổ sung vào sản phẩm là tinh bột và saccharose. Dòng L4 không phải là dòng vi khuẩn lactic và cũng không có khả năng sinh enzyme protease. Hai dòng nấm men M5 và M6 được xác định là nấm men Candida glabrata có đặc điểm: oxidase âm tính; amylase và catalase dương tính; chỉ có dòng M5 dương tính với protease. Cả 2 dòng này phát triển mạnh trong môi trường có nguồn carbohydrate là saccharose và manitol, phát triển yếu trong môi trường có glucose. Dòng M6 phát triển mạnh trong môi trường có tinh bột, ngược lại dòng M5 phát triển yếu trong môi trường này. Pediococcus acidilactici (ở mật số 108 và 109 cfu/g trong hỗn hợp trước khi lên men) được xác định là dòng vi khuẩn có khả năng cải thiện chất lượng sản phẩm về mùi, vị, giảm lượng NH3 sinh ra, đồng thời rút ngắn được 5-10 ngày lên men. Sản phẩm bảo quản được tối đa 30 ngày ở nhiệt độ 28-32oC và 60 ngày ở nhiệt độ 5oC-10oC mà chất lượng sản phẩm vẫn ổn định, đạt yêu cầu về các chỉ tiêu hóa học và vi sinh. Từ khóa: lên men chua, Trichogaster trichopterus, Trichogaster microlepis, vi khuẩn lactic, xương mềm ii ABSTRACT Aims of the study were improving the procedure of sour fermented fish and isolating the bacteria in this fermented product. These data helped to determine the causes of soft bone fish and to optimize the processing line based on the stable quality of products, the ensuring of food security, the independing on environmental conditions during fermentation, its application to manufactures, the ability of elucidating the scientific problems related to manufacturing, studying and teaching. Therefore, the research focused on “Studying on the processing procedure and isolating bacteria of sour fermented soft bone fish (Trichogaster trichopterus and Trichogaster microlepis)”. In this study, the current procedures were surveyed. Based on these data, the general procedure was set up and then determined the criteria on the quality product. In addition, factors affecting the quality of product in each processing stage were determined to establish the procedure with optimal parameters. Besides, the reasons leading to soft bone fish in the fermentation process were studied. Isolation and determination of lactic acid bacteria based on the phenotypic and biochemical characteristics; genetic engineering (DNA sequencing) were also performed. Basically, this study helped improve the processing line and its preservation ability at different temperature. The results showed that sour fermented soft bone fish was lactic fermentation product concerned as bright yellowish brown; the harmonious combination of sour, salty, sweet taste and typical flavor; flexible muscle texture and soft bone. The final product had 1.7÷2.1 x 107 cfu/g lactic acid bacteria; pH = 4.1÷4.5; 2.0-3.0% lactic acid; 10.0÷11.3% protein (0.5÷0.7% nitrogen of amino acid, 0.07÷0.09% nitrogen of ammoniac); 1.5÷2.3% lipid; 6.0÷6.7% NaCl. The procedure of this product was performed as follows: removing fin, head and internal organs of fish, still keeping scab fish (2.5 hours); soaking (16 hours); removing scales, crushing scab fish and cleaning (0.5 hours); drying naturally at room temperature (6 hours). These materials were mixed with 1% ethanol; 10% NaCl; 15% sugar (appied on the treated materials). Then, the mixture was compressed tightly into the container and fermented for 30 days. Fish bone was soft mainly because of lactic acid production during fermentation. Lactic acid reacted to calcium of fish bone and then dissolved calcium into solution. This reaction only happened on organic acid solution at pH 4.0. After 72 hours, about 40-60% of calcium of fish bone was dissolved and the fish bone turned soft. iii The isolation and DNA sequencing results indicated that four strains of bacteria and two strains of yeast presented in this fermented product. Four isolated strains of bacteria were Pediococcus acidilactici (L1), Lactobacillus farciminis (L2, L3) and Staphylococcus hominis (L4). The colonies of these strains had white or milk-white color, about 1-2mm in dimension, Gram positive, bacillus, diplococcus or monococcus, catalase-negative, oxidasenegative and amylase-positive. Among them, L1, L2, L3 were lactic acid bacteria. All of three strains could secrete protease and strongly develop on carbohydrate medium as starch, saccharose. L4 was not lactic acid bacteria and could not produce protease. Candida glabrata determined in two strains of yeast (M5 and M6) were oxidase-negative, amylase-positive, catalase-positive. The only strain M5 was protease-positive. Both strain M5 and M6 developed strongly on saccharose and manitol medium, vice versa on glucose. Also, M6 strongly developed on starch medium, but M5 was weaker. Pediococcus acidilactici (inoculated at 108 and 109 cfu/g into the mixture before fermentation) could improve the quality of product on flavor, taste; decrease the production of NH3 in sour fermented fish; and shorten 5-10 fermentation days. At 28-32oC, the maximum preservation of sour fermented soft bone fish was 30 days and 60 days at 5-10oC, the quality of product still remained stable and met the requirement of chemical and microbial parameters of the product. Key words: lactic acid bacteria, soft bone, sour fermented fish, Trichogaster microlepis and Trichogaster trichopterus. iv LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, PGS.TS Nguyễn Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Ban Giám hiệu, Ban Giám đốc, Thầy, Cô và cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học-Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện. Ban Giám hiệu, Khoa Công nghệ - Thủy sản và quý đồng nghiệp trường Cao đẳng Kinh tế- Kỹ thuật Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ động viên tôi để tôi vừa hoàn thành tốt luận án vừa đảm bảo thực hiện tốt các công tác được giao. PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn, TS. Nguyễn Đắc Khoa, Khoa Sau Đại học, Phòng Quản lý Khoa học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành thủ tục học tập và bảo vệ luận án. Thầy, Cô và cán bộ Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Hội đồng bảo vệ luận án và cán bộ phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quý báu để luận án được hoàn chỉnh. Ths. Lê Mỹ Hồng, Ths. Dương Thị Phượng Liên, TS. Trần Chí Nhân, Ths. Lương Uyên Uyên, Ths. Trần Diễm Phượng, Ks. Giảng Thanh Nhường, Ths. Nguyễn Thị Mai Khanh, Ths. Nguyễn Thị Quế Thanh, Ks. Bùi Thị Hậu, Ks. Trần Minh Phúc, Ks. Nguyễn Ngọc Thạnh, Ks. Nguyễn Thị Thúy Duy, Ks. Trần Ngọc Huệ, Ks. Trần Văn Tiên, Ks. Nguyễn Như Ngọc, Ks. Nguyễn Hoàng Nghĩa và Ks. Trần Trà My đã luôn giúp đỡ, động viên, đóng góp ý kiến trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án này. Gia đình Dì Hai Huệ, Dì Thúy đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian đi khảo sát cũng như trong quá trình nghiên cứu sản phẩm tại địa phương. Xin gửi đến Ba Mẹ, anh chị em lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc vì luôn dành những gì tốt đẹp nhất cho tôi, để tôi ngày một trưởng thành hơn và có được cuộc sống tốt đẹp như hôm nay. Chồng và con tôi – nguồn động viên giúp đỡ tôi về mọi mặt, là hậu phương vững chắc giúp tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất để hoàn thành luận án. Cần Thơ, ngày 20 tháng 6 năm 2015 Nghiên cứu sinh Đỗ Thị Tuyết Nhung v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của Thầy hướng dẫn và bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình hay luận án nào trước đây. Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Đỗ Thị Tuyết Nhung vi MỤC LỤC Tóm tắt ................................................................................................................ i Abstract ............................................................................................................. iii Lời cảm ơn ......................................................................................................... v Lời cam đoan .................................................................................................... vi Mục lục ............................................................................................................ vii Danh sách bảng .................................................................................................. x Danh sách hình................................................................................................ xiii Danh mục các từ viết tắt ................................................................................. xiv CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................... 3 1.3 Giới hạn của đề tài ....................................................................................... 3 1.4 Điểm mới và ý nghĩa của luận án ................................................................ 3 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 5 2.1 Nguyên liệu dùng trong chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm ................................................................................................................... 5 2.1.1 Nguyên liệu cá sặc .................................................................................... 5 2.1.2 Một số nguyên vật liệu khác trong chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm............................................................................................. 13 2.2 Khái quát về sản phẩm cá lên men ............................................................ 14 2.2.1 Khái niệm ................................................................................................ 14 2.2.2 Phân loại ................................................................................................. 15 2.2.3 Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm cá lên men ........................................ 18 2.3 Quá trình lên men lactic ............................................................................. 20 2.3.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men lactic .......................................... 20 2.3.2 Các giai đoạn hoạt động của vi sinh vật trong lên men lactic ................ 21 2.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men latic ............................ 22 2.4 Vi khuẩn lên men sinh acid lactic (vi khuẩn lactic) .................................. 24 2.4.1 Đặc điểm ................................................................................................. 24 2.4.2 Phân loại LAB ........................................................................................ 25 2.4.3 Sinh tổng hợp của vi khuẩn lactic ........................................................... 31 2.4.4 Vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm mắm cá sặc lên men chua, xương mềm ................................................................................................................. 38 vii 2.5 Giống vi sinh vật bổ sung vào sản phẩm lên men ..................................... 46 2.6 Các kết quả nghiên cứu có liên quan ......................................................... 47 2.6.1 Các kết quả nghiên cứu trong nước ........................................................ 47 2.6.2 Các kết quả nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 48 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 53 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 53 3.1.1 Địa điểm – Thời gian .............................................................................. 53 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị...................................................................................... 53 3.1.3 Nguyên vật liệu ....................................................................................... 54 3.1.4 Hóa chất .................................................................................................. 54 3.2 Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 55 3.2.1 Nội dung 1. Khảo sát một số quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm............................................................................................. 55 3.2.2 Nội dung 2. Cải tiến quy trình chế biến cá sặc lên men chua , xương mềm ................................................................................................................. 55 3.2.3 Nội dung 3. Phân lập và định danh các dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm .................................................... 60 3.2.4 Nội dung 4. Khảo sát các yếu tố tác động lên quá trình làm mềm xương cá trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm ...................................... 61 3.2.5 Nội dung 5. Nghiên cứu bổ sung các dòng vi khuẩn lactic được phân lập trong chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm ............................ 64 3.2.6 Nội dung 6. Khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm ............................... 66 3.3 Phương pháp phân tích .............................................................................. 67 3.3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa học............................................ 67 3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về vi sinh vật ................................... 68 3.3.3 Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm ............................................ 70 3.4 Phương pháp bố trí và phân tích kết quả thí nghiệm ................................. 70 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ....................................................... 71 4.1 Kết quả khảo sát một số quy trình chế biến sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm ...................................................................................................... 71 4.1.1 Quy trình chế biến................................................................................... 71 4.1.2 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa học .............................................. 73 4.1.3 Kết quả đánh giá cảm quan ..................................................................... 75 4.1.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm ...................................... 78 4.2 Kết quả cải tiến quy trình chế biến cá sặc lên men chua, xương mềm ...... 80 viii 4.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến chất lượng sản phẩm .......................................................................................................... 80 4.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol, muối, đường phối trộn đến chất lượng sản phẩm ................................................................................. 86 4.3 Kết quả phân lập vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm ............................. 95 4.3.1 Đặc điểm về hình thái ............................................................................. 95 4.3.2 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của các dòng vi sinh vật phân lập ................................................................................................................. 98 4.3.3 Nhận diện 6 dòng vi sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................... 106 4.4 Kết quả khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm mềm xương cá trong quá trình lên men ........................................................................................... 115 4.4.1 Kết quả xác định yếu tố làm mềm xương cá ........................................ 115 4.4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm và pH của dung dịch ngâm đến mức độ mềm của xương cá ..................................................................... 118 4.5 Kết quả nghiên cứu bổ sung giống vi khuẩn lactic L1, L2, L3 vào sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm .................................................................. 121 4.5.1 Sự thay đổi mật số vi sinh vật trong quá trình lên men ........................ 121 4.5.2 Sự thay đổi về thành phần hóa học trong sản phẩm ............................. 124 4.6 Kết quả khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm ....................................... 130 4.6.1 Kết quả khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm khi bảo quản sản phẩm ở điều kiện nhiệt độ phòng (28-32oC)............................................................... 130 4.6.2 Kết quả khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ lạnh ........... 132 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................... 135 5.1 Kết luận .................................................................................................... 135 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 136 PHỤ LỤC………………………………………………………..................xviii ix DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Thành phần hóa học cơ bản của cá phi lê 2.2 Đặc điểm của một số LAB 25 2.3 Hóa chất xử lý và vị trí cắt trên DNA 29 2.4 Đặc điểm của một số sản phẩm cá lên men 48 3.1 Tổ hợp các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm 2.1 56 3.2 Tổ hợp nghiệm thức phối chế ethanol, muối, đường trong thí nghiệm 2.2 59 3.3 Tổ hợp nghiệm thức trong thí nghiệm 4.2 63 3.4 Tổ hợp nghiệm thức trong thí nghiệm 5 64 3.5 Mã hóa các mẫu thí nghiệm trong nội dung thí nghiệm 5 65 4.1 Điểm khác biệt trong một số công đoạn chế biến ở hai quy trình 72 4.2 So sánh thành phần hóa học của sản phẩm ở quy trình 1 và 2 với một số sản phẩm của Thái Lan 74 4.3 Các thuộc tính cảm quan của sản phẩm cá sặc lên men chua xương mềm 75 4.4 Mật số vi sinh vật (cfu/g) hiện diện trên sản phẩm mắm cá sặc thông thường và các sản phẩm chế biến từ quy trình 1 và quy trình 2 78 4.5 Mật số vi sinh vật, pH, nhiệt độ cá nguyên liệu sau xử lý 80 4.6 Tỷ lệ nitơ amin/nitơ tổng, nitơ amoniac/nitơ tổng, pH của sản phẩm 80 4.7 Mật số vi sinh vật trên nguyên liệu cá sặc trước khi xử lý, (cfu/g) 81 4.8 Ảnh hưởng của cách xử lý đến mật số vi sinh vật trên nguyên liệu cá sặc sau xử lý, (cfu/g) 81 4.9 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến mật số vi sinh vật, pH, nhiệt độ nguyên liệu cá 82 4.10 Ảnh hưởng của cách xử lý đến sự chuyển hóa nitơ amin/nitơ tổng và nitơ NH3/nitơ tổng, pH của nguyên liệu và sản phẩm 82 4.11 Ảnh hưởng của cách xử lý cá đến điểm đánh giá cảm quan sản phẩm 83 4.12 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường xử lý cá đến điểm đánh giá cảm quan sản phẩm Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự chuyển hóa nitơ amin/nitơ tổng và nitơ NH3/nitơ tổng, pH của sản phẩm 83 4.13 x 7 83 4.14 Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến sự chuyển hóa nitơ amin/nitơ tổng và nitơ NH3/nitơ tổng, pH của sản phẩm 84 4.15 Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến chất lượng cảm quan của sản phẩm 84 4.16 Một số ưu nhược điểm của cách xử lý, điều kiện môi trường, thời gian xử lý cá đến chất lượng sản phẩm 84 4.17 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường, cách xử lý và tổng thời gian xử lý cá đến giá trị cảm quan sản phẩm 85 4.18 Ảnh hưởng của nồng độ ehanol sử dụng đến khả năng hình thành sản phẩm và một số tính chất cảm quan của sản phẩm 90 4.19 Ảnh hưởng của nồng độ muối sử dụng đến khả năng hình thành sản phẩm và một số tính chất cảm quan của sản phẩm 90 4.20 Ảnh hưởng của nồng độ đường sử dụng đến khả năng hình thành sản phẩm và một số tính chất cảm quan của sản phẩm 90 4.21 Ảnh hưởng của ethanol, muối, đường đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và pH của sản phẩm 91 4.22 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol, muối, đường và thời gian lên men đến giá trị pH, hàm lượng calci và điểm cảm quan của sản phẩm 92 4.23 Giá trị trung bình tổng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm 93 4.24 Bảng tổng hợp một số đặc tính sinh hóa của 6 dòng vi sinh vật phân lập 101 4.25 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của 6 dòng vi sinh vật phân lập 102 4.26 Trình tự đoạn gen 16S rRNA của 4 dòng vi khuẩn L1, L2, L3, L4 và gen 28S rRNA của 2 dòng nấm men M5, M6 107 4.27 Bảng tổng hợp kết quả xác định tên loài của 6 dòng vi sinh vật phân lập 108 4.28 Mật số trung bình của các dòng vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm theo thời gian lên men, cfu/g 111 4.29 Bảng tổng hợp một số đặc điểm sinh hóa của các dòng vi sinh vật phân lập 114 4.30 Giá trị pH, hàm lượng acid, hàm lượng calci có trong xương cá, dung dịch trước và sau khi ngâm 115 4.31 Thành phần xương cá 116 4.32 Hàm lượng acid lactic và acid acetic sinh ra khi cho các dòng vi khuẩn L1, L2, L3 tăng sinh trong môi trường MRS broth sau 48 giờ 118 xi 4.33 Hàm lượng calci trong xương cá và trong dung dịch acid acetic, acid lactic sau ngâm 118 4.34 Sự thay đổi nồng độ calci trong xương cá theo pH của môi trường và thời gian ngâm, % 118 4.35 Sự thay đổi hàm lượng calci trong môi trường ngâm theo pH và thời gian ngâm, mg/l 120 4.36 Mật số vi khuẩn lactic và vi sinh vật tổng số trong mẫu thí nghiệm sau 20 ngày lên men, log cfu/g 123 4.37 Trung bình tổng điểm đánh giá cảm quan của sản phẩm theo thời gian lên men 128 4.38 Kết quả phân tích thống kê các chỉ tiêu hóa học, cảm quan của các mẫu được bổ sung vi khuẩn lactic, mẫu lên men tự nhiên ở ngày thứ 20 (ĐC20) và ngày thứ 30 (ĐC30) 129 4.39 Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm theo thời gian bảo quản 130 4.40 So sánh thời gian bảo quản sản phẩm mắm chua cá sặc, xương mềm với một số sản phẩm cá lên men ở Đông Nam Á 131 4.41 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến một số chỉ tiêu hóa học và cảm quan của sản phẩm 132 4.42 Kết quả kiểm tra vi sinh vật trên sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm bảo quản 60 ngày 133 4.43 Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm 134 xii DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Hình cá sặc bướm 5 2.2 Hình cá sặc điệp 6 2.3 Bộ xương của cá 8 2.4 Sơ đồ biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết 11 2.5 Sơ đồ biến đổi pH của động vật thủy sản sau khi chết 12 2.6 Sơ đồ quy trình sản xuất một số sản phẩm cá lên men truyền thống thuộc nhóm 2 17 2.7 Sự phát triển của vi khuẩn lactic và sự sản sinh acid trong quá trình lên men 21 2.8 Ảnh hưởng của ethanol đến sự phát triển của vi sinh vật 23 2.9 Sơ đồ cây hình thái của vi khuẩn Lactic Gram dương hiếu khí và kỵ khí trong nhánh G+C thấp 27 2.10 Sơ đồ thực hiện bước 1 và 2 theo phương pháp Sanger 30 2.11 Sơ đồ thực hiện bước 3 và 4 theo phương pháp Sanger 30 2.12 Mẫu kết quả giải trình tự gen tự động 31 2.13 Lộ trình Glycolysis 33 2.14 Lộ trình 6-PG/PK 34 2.15 A. Lộ trình tagartose-6-phosphate 2.16 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào Pediococcus acidilactici 39 2.17 Hình dạng tế bào Staphylococcus hominis 42 2.18 Cây phát sinh loài biểu diễn mối quan hệ tiến hóa giữa Candida và các loài Saccharomyces 45 2.19 Biểu diễn mối liên quan giữa sự chuyển đổi hình thái và sự biểu hiện gen làm tăng tính độc của nấm men 45 2.20 Sơ đồ biểu diễn sự thay đổi về mùi vị, thành phần hóa học và vi sinh vật trong sản phẩm Sikhae theo thời gian lên men 50 4.1 Sơ đồ quy trình 1 71 4.1 Sơ đồ quy trình 2 72 4.3 Sơ đồ quy trình chung trong chế biến cá sặc lên men chua, xương mềm 73 4.4 Thuộc tính cảm quan của sản phẩm quy trình 1 và quy trình 2 được đánh giá theo phương pháp QDA 76 4.5 Sản phẩm cá sặc lên men, xương mềm chế biến theo quy 77 xiii B. Lộ trình Leloir 35 trình 1 4.6 Sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm chế biến theo quy trình 2 77 4.7 Mắm cá sặc mặn (chợ An Hòa, Cần Thơ) 77 4.8 Sự biến đổi pH trên nguyên liệu cá theo cách xử lý, điều kiện môi trường và thời gian xử lý 82 4.9 Sự tương quan giữa các thuộc tính cảm quan sản phẩm với lượng muối, đường sử dụng ở nhóm sản phẩm không có phối trộn ethanol 86 4.10 Sự tương quan giữa các thuộc tính cảm quan sản phẩm với lượng muối, đường sử dụng ở nhóm sản phẩm có phối trộn 3% ethanol 87 4.11 Sự tương quan giữa các thuộc tính cảm quan sản phẩm với lượng muối, đường sử dụng ở nhóm sản phẩm có phối trộn 6% ethanol 88 4.12 Sự tương quan giữa các thuộc tính cảm quan sản phẩm với lượng ethanol, đường sử dụng ở nhóm sản phẩm có phối trộn 10% muối 89 4.13 Sơ đồ quy trình chế biến cá sặc lên men chua, xương mềm đề nghị 94 4.14 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của dòng L1 95 4.15 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của dòng L2 96 4.16 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của dòng L3 96 4.17 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của dòng L4 97 4.18 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào dòng nấm men M5 97 4.19 Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của dòng M6 98 4.20 Hình tế bào bốn dòng vi khuẩn L1, L2, L3, L4 được nhuộm Gram 99 4.21 Khả năng sinh enzyme oxidase của 6 dòng vi sinh vật 99 4.22 Khả năng sinh enzyme catalase của 6 dòng vi sinh 100 4.23 Khả năng sinh enzyme protease của 6 dòng vi sinh vật 100 4.24 Khả năng sinh amylase của 6 dòng vi sinh vật 101 4.25 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng L1 102 4.26 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng L2 103 4.27 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng L3 103 4.28 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng L4 104 4.29 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng M5 104 xiv 4.30 Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của dòng M6 105 4.31 Phổ điện di của gen 16S rRNA của 4 dòng vi khuẩn L1, L3, L2, L4 và gen 28S rRNA của 2 dòng nấm men M5, M6 106 4.32 Cây phả hệ mô tả mối tương quan di truyền giữa 6 dòng vi sinh vật tuyển chọn 110 4.33 Hình chụp X quang xương sau khi ngâm trong dung dịch 118 4.34 Xương cá sau ngâm 72 giờ ở điều kiện môi trường pH 4 120 4.35 Xương cá sau ngâm 72 giờ ở điều kiện môi trường pH 5 120 4.36 Sự thay đổi mật số vi khuẩn lactic trong mẫu đối chứng và mẫu có bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 121 4.37 Sự thay đổi mật số vi khuẩn lactic trong mẫu được bỏ sung dòng L2 và dòng L3 theo thời gian lên men 121 4.38 Sự thay đổi mật số vi sinh vật tổng số trong mẫu đối chứng và mẫu có bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 122 4.39 Sự thay đổi mật số vi sinh vật tổng số trong mẫu có bổ sung dòng L2 và dòng L3 theo thời gian lên men 122 4.40 Sự thay đổi pH của mẫu đối chứng và mẫu được bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 124 4.41 Sự thay đổi pH của mẫu được bổ sung dòng L2 và dòng L3 theo thời gian lên men 124 4.42 Sự thay đổi hàm lượng acid lactic của mẫu đối chứng và mẫu được bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 125 4.43 Sự thay đổi hàm lượng acid lactic của mẫu được bổ sung dòng L2 và L3 theo thời gian lên men 125 4.44 Sự thay đổi hàm lượng calci của mẫu đối chứng và mẫu được bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 126 4.45 Sự thay đổi hàm lượng calci ở mẫu được bổ sung dòng L2 và dòng L3 theo thời gian lên men 126 4.46 Sự thay đổi hàm lượng NH3 của mẫu đối chứng và mẫu được bổ sung dòng L1 theo thời gian lên men 127 4.47 Sự thay đổi hàm lượng NH3 của mẫu được bổ sung dòng L2 và L3 theo thời gian lên men 127 4.48 Đánh giá sự thay đổi cảm quan sản phẩm trong quá trình bảo quản theo phương pháp QDA 131 4.49 Hình sản phẩm cá sặc lên men chua, xương mềm sau 60 ngày bảo quản ở nhiệt độ 5oC 134 xv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Cụm từ Viết tắt Adenosine triphosphate ATP Aerococcus Aeroc. Baird Parker BP Brilliant Green Bile Lactose BGBL Carnobacterium Carnob. Colony forming unit cfu de Man Rogosa and Sharsp MRS Deoxynucleotide- triphosphate dNTP Deoxyribonucleic acid DNA Dideoxynucleoside triphosphate ddNTP Dihydroacetonephosphate DHAP Enterococcus Enteroc. Escherichia coli E. coli Fluid Thioglycolate FT Fructose-1,6-diphosphate FDP Glyceraldehyde-3-phosphate GAP Lactic acid bacteria LAB Lactobacillus Lactob. Lactococcus Lactoc. Lactose-Sulfite LS Leuconostoc Leuc. Luria-Bertani LB Messenger Ribonucleic acid Mrna Mûller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin MKTTn NAD+-dependent lactate dehydrogenase nLDH Nicotinamide adenine dinucleotide NADH Oenococcus Oenoc. xvi Pediococcus Pedioc. Peptidase Pep Plate count agar (môi trường) PCA (môi trường) Polymerase chain reaction PCR Principal Component Analysis PCA (đánh giá cảm quan) Proline Pro Pulsed field gel electrophoresis PFGE Quantitative Descriptive Analysis QDA Random amplified polymorphic DNA RAPD Rappaport Vassiliadis Soy RVS Repetitive sequence- based PCR REP-PCR Ribonucleic acid RNA Ribosomal ribonucleic acid rRNA Staphylococcus hominis subp. novobiosepticus SHN Streptococcus Streptoc. Sulfite Cycloserine SC Tetragenococcus Tetragenoc. Transfer Deoxyribonucleic acid-PCR tDNA-PCR Tryptic Soy Agar TSA Trypton-Bile-Glucuronic TBX Vagococcus Vagoc. Vi khuẩn VK Violet Red Bile VRB Vi sinh vật VSV Voges Proskauer VP Xylose Lysine Deoxycholate XLD 6-phosphogluconase/phosphoketolase 6-PG/PK xvii CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong các loại sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới. Hiện nay, các sản phẩm lên men truyền thống đã không còn được sản xuất hoàn toàn theo phương pháp thủ công nữa. Cùng với sự phát triển của xã hội, công nghệ sản xuất các sản phẩm truyền thống cũng được cải tiến và hoàn thiện dần để đáp ứng không chỉ về chất lượng mà còn đáp ứng cả về số lượng cho người tiêu dùng. Do đó, các thế hệ chúng ta hiểu biết và phát huy các sản phẩm này không chỉ là điều cần thiết mà còn là trách nhiệm trong việc gìn giữ và phát huy các truyền thống lâu đời của quê hương, của dân tộc (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2004). Không nằm ngoài những đặc điểm ấy, cá lên men là một trong những sản phẩm lên men truyền thống lâu đời và rất đặc trưng ở các quốc gia Đông Nam Á, Châu Phi. Cá lên men có vai trò quan trọng trong bữa ăn của người dân nhất là người dân nghèo do có giá thành rẻ lại cung cấp thêm acid amin được thủy phân từ protein cá và có hương vị độc đáo (Hall, 2011). Ở nước ta sản phẩm cá lên men được gọi là “mắm”. Hầu hết những sản phẩm mắm lên men từ cá nhất là sản phẩm lên men từ các loại cá nhỏ như cá sặc, cá trèn,…các loại mắm này thường được dùng chủ yếu để nấu lấy hương vị như nấu lẩu, kho, chưng,… ít khi được dùng phổ biến để “ăn sống” (không qua nấu) vì thịt ít, xương nhiều và cứng, thời gian sản xuất ra thành phẩm khá dài (từ vài tháng trở lên). “Cá sặc lên men chua, xương mềm” (hay còn gọi là mắm tiêu xương; mắm chua cá sặc, xương mềm) cũng là dạng sản phẩm cá lên men lactic. Nét đặc trưng của sản phẩm này là cá vẫn giữ được hình dạng nguyên vẹn nhưng xương rất mềm tạo cảm giác như không có xương khi ăn; mùi vị thơm ngon, hài hòa hơn các sản phẩm mắm thông thường khác nên không cần phối chế lại trước khi ăn và rất thích hợp dùng “ăn sống”, đặc biệt hơn là thời gian lên men ngắn khoảng 30 ngày. Tuy nhiên, bí quyết làm sản phẩm này đang dần thất truyền, đồng thời có nhiều yếu tố tác động lên sản phẩm chưa được nghiên cứu và xác định rõ ràng dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định. Đến thời điểm hiện nay chưa có công trình khoa học nào công bố những vấn đề có liên quan đến sản phẩm mắm cá sặc lên men chua, xương mềm. Do đó, đề tài “Nghiên cứu quy trình chế biến và phân lập vi sinh vật hiện diện trong cá sặc lên men chua, xương mềm” được thực hiện vì những lý do như sau: 1