Tài liệu Nghiên cứu thu nhận coenzyme q10 từ chủng agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp (tt)

MỞ ĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những loại coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở cả prokaryote và eukaryote. CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể. CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp... Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như Agrobacterium tumefaciens, Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans… A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp..Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp”  Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10. - Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10. - Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng.  Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10. - Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10. - Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.  Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng dưới dạng viên nang.  Những đóng góp mới của luận án - Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao. 1 - Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng hợp CoQ10 cao. - Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng dưới dạng viên nang.  Bố cục của luận án - Luận án được trình bày trong 123 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu (32 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (20 trang), kết quả và thảo luận (58 trang với 11 bảng, 50 hình), kết luận và kiến nghị 1 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (9 trang với 4 tài liệu tiếng Việt và 107 tài liệu tiếng Anh). CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10 1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10 1.2.1. Tổng hợp hóa học 1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật 1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.3. CON ĐƯỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT 1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS 1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon 1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ 1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng 1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 1.4.5. Ảnh hưởng của pH 1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan 1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 1.5.1. Lên men gián đoạn 1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) 1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10 1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10 1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10 1.7. CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 1.7.1. Đột biến chủng 1.7.2. Chủng tái tổ hợp 1.8. VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10 1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10 2 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Các mẫu nốt sần cây hoa hồng được thu thập từ Tây Tựu và Mê Linh, Hà Nội. Chủng A. tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu tách dòng và biểu hiện: Mồi xuôi (DpsF): 5’-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3’; Mồi ngược (DpsR): 5’-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3’. Mồi xuôi (DxsF): 5’-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3’; Mồi ngược (DxsR): 5’-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3’; Cặp mồi 16 S được sử dụng trong giải trình tự: Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’; Mồi ngược 1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’. Các plasmid được sử dụng trong nghiên cứu: pJet1.2/Blunt (Thermo Scientific, Mỹ), pCAMBIA1301 (Viện Công nghệ Sinh học, VAST.) 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp CoQ10 theo Islam (2010). - Nuôi cấy chìm chủng A. tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp Coenzyme Q10. - Tách chiết DNA tổng số, DNA plasmid từ vi khuẩn, khuếch đại gen dps, dxs, 16S bằng kỹ thuật sốc nhiệt, biến nạp DNA plasmid vào E. Coli bằng sốc nhiệt,...theo Sambrook và Russel (2001). - Phương pháp biến nạp plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. - Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens theo Ranadive (2011). - Xác định hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp Craven. - Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 bằng HPLC. - Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - CoQ10 theo Fir (2009). - Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của CoQ10 theo Fir (2009), Hisa và đồng tác giả (2014). - Phương pháp đều chế viên nang cứng chứa CoQ10. - Phương pháp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 bằng quy hoạch bậc hai theo Box – Behnken. 3 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 Kết quả từ 13 mẫu nốt sần khác nhau thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh và Tây Tựu - Hà Nội đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc MacConkey, bao gồm 5 chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, 7 chủng từ nốt sần hoa hồng huyện Mê Linh. Từ kết quả trên, để chứng minh các vi khuẩn phân lập được là A. tumefaciens, các chủng phân lập được tiến hành sàng lọc dựa theo một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử. . Kết quả từ 12 chủng phân lập đã sàng lọc được 4 chủng là A. tumefaciens. Từ các chủng phân lập trên và 3 chủng chuẩn A. tumefaciens tiến hành tuyển chọn thông qua khả năng sinh tổng hợp CoQ10. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn TT4 có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (13 mg/l) sau 96 giờ nuôi cấy so với các chủng khác. Từ các kết quả phân tích về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử chủng vi khuẩn phân lập TT4 được định danh là A. tumfaciens TT4. Chủng này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tăng cường sự sinh tổng hợp CoQ10. 3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4 DNA tổng số đã tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4 được dùng làm khuôn để khuếch đại hai đoạn gen dps và dxs mã hóa hai enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp CoQ10 là decaprenyl diphosphate synthase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate A synthase. B dps M dxs Kb Kb - 3,0 - 2,0 1077 bp  - 1,2 M 2100 bp  - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5 - 0,2 - 0,5 Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A. tumefaciens TT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) 4 Kết quả phổ điện di sản phẩm PCR cho thấy xuất hiện một băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.7A) và một băng kích thước khoảng 2,1 kb (hình 3.7B) khi sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R tương ứng. Kích thước của các sản phẩm PCR thu được là hoàn toàn phù hợp với kích thước của hai đoạn gen đích cần khuếch đại. Từ kết quả này cho thấy hai đoạn gen dps và dxs đã được khuếch đại từ khuôn DNA tổng số của chủng A. tumefaciens TT4 bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA). Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ hợp. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 10 và 7 khuẩn lạc trên môi trường LB thạch chứa ampicilin (100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps và dxs. Plasmid đã được tách chiết từ những khuẩn lạc và được sử dụng cho sàng lọc sơ bộ để chọn ra một dòng tương ứng với mỗi gen để nghiên cứu tiếp theo. Trước tiên, plasmid được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps và dxs tương ứng. Kết quả cho thấy đều xuất hiện băng sản phẩm PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích thước của gen dps (hình 3.8A) và dxs (hình 3.8B). Kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA plasmid tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số của chủng A. tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.8). Kết quả nhận được chứng tỏ hai dòng được lựa chọn mang gen đích tương ứng là dps và dxs. Tuy nhiên, để chắc chắn hơn DNA plasmid của hai dòng này tiếp tục được xử lý bẳng các enzyme hạn chế thích hợp. A C3 TT4 M B Kb C6 TT4 M Kb - 3,0 - 2,0 1077 bp  - 1,2 2100 bp  - 0,5 - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,2 - 0,5 - 0,2 Hình 3.8. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 5 Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào đầu 5’ của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào cặp mồi DxsF/R. Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai clone 3 và 6 đều văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps khoảng 1077 bp (hình 3.9A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.9B). Từ các kết quả thu được có thể khẳng định rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai gen đích tương ứng là dps và dxs. A 1 2 M B 3 4 Kb Kb - 3,0 - 2,0  1077 bp  M  2100 bp  - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 1,2 - 0,5 - 0,5 - 0,2 - 0,2 Hình 3.10. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng hai plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự. Trình tự nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps và dxs đã được xác định. Kết quả cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng hợp một protein nguyên vẹn. 3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử dụng làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A. tumefaciens. Hai gen dps và dxs sẽ được đưa độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301 để tạo ra các cấu trúc biểu hiện pCAM-dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs. 3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai gen dps và dxs thu được đã được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme 6 cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.12A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI (hình 3.12B). Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.12B). 1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC M 1 2 3 4 5 6 7 8 + - Kb M Kb - 3,0 - 2,0 - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 1,2 - 0,5 - 0,5 - 0,2 - 0,2 B A Hình 3.13. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 1 A 2 ĐC M 1 Kb 2 M Kb B - 3,0 - 2,0 - 3,0 - 2,0 - 1,2 - 1,2 - 0,5 - 0,5 Hình 3.14. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 7 Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.14A) và xử lý bằng cặp enzyme BamHI/SalI (hình 3.14B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 3.14B). Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng. 3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 3.15A). Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb. Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC M1 RE/9 Kb A B - 3,0 - 2,0 - 1,2 1077 bp  - 0,5 1077 bp  M2 Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 Hình 3.15. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2). 8 3.2.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens EHA 105 khả biến bằng phương pháp xung điện. Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin (100µg/ml). Tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp pCAM-dps, pCAMdxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM (hình 3.16). Kết quả cho thấy chủng tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 tăng lên 1,34 và 1,38 lần so với đối chứng. Khi kết hợp cả hai gen dps và dxs tạo chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens lên 1,80 lần so với đối chứng. Do đó các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dpsdxs được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. CoQ10 (mg/l) 20 15 10 5 0 pCAM pCAM-dps pCAM-dxs pCAM-dps-dxs Hình 3.16. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAMdps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A. tumefaciens pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình 3.17). Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so với dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 20.0 18.0 CoQ10 (mg/L) 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 1 2 3 8 10 11 12 14 15 20 pCAM Các dòng tái tổ hợp Hình 3.17. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs 9 3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 . Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens trên môi trường với các loại đường khác nhau. Kết quả cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (16 mg/L) và nồng độ đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất. Cũng tương tự như thế khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens. Kết quả cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn nitơ là cao ngô (CSL) cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (26,68 mg/L) và nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất. CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10% Nồng độ sucrose (w/v) Nguồn cacbon (đƣờng) Hình 3.20 Hình 3.19 30 60 50 CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 25 20 15 10 5 40 30 20 10 0 0 0.5% Nguồn nitơ 1% 2% 3% 4% 5% Nồng độ CSL (w/v) Hình 3.21 Hình 3.22 Ảnh hưởng của nguồn cacbon (hình 3.19), nồng độ sucrose (hình 3.20 ), nguồn nitơ (hình 3.21), nồng độ CSL(hình 3.22) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 10 3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đầu môi trƣờng Kết quả hình 3.23 cho thấy, với pH đầu là 8,0 hàm lượng CoQ10 thu được là cao nhất đạt 68,8 mg/L, vì vậy pH đầu là 8,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống Kết quả hình 3.24 cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt khi OD = 0,8, cao gấp 1,6 lần (tăng 50 mg/L) so với OD = 0,05. 3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Kết quả hình 3.25 cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens DPXS12 là 28oC. Vì vậy cứu nhiệt độ 28oC được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian Từ kết quả hình 3.26 cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng CoQ10 được sinh tổng hợp cũng tăng. Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96 giờ đến 144 giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% (tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men. Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men. 80 120 60 CoQ10 (mg/L) CoQ10 (mg/L) 70 50 40 30 20 100 80 60 40 20 10 0 0 6.0 6.5 7.0 pH 7.5 8.0 0.05 0.1 Hình 3.23 140 CoQ10 (mg/l) 120 CoQ10 (mg/L) 100 80 60 40 20 0 20 25 28 30 Nhiệt độ (độ C) 0.4 0.8 OD giống 1.2 1.6 2.0 Hình 3.24 140 120 100 80 60 40 20 0 0 37 0.2 24 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) Hình 3.25 Hình 3.26 Ảnh hưởng của pH đầu môi trường (hình 3.23), OD giống (hình 3.24), nhiệt độ nuôi cấy (hình 3.25), thời gian (hình 3.26) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 11 3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS 3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) . Kết quả được thể hiện trên bảng 3.3. Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau: Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 0,32.X1X3 + 3,66.X2X3 – 2,78.X12 – 75,27.X22 – 81,98.X32 Bảng 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được TN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Nồng độ sucrose (%) 2,5 2,5 7,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5,0 2,5 7,5 2,5 7,5 5,0 5,0 5,0 5.0 5.0 Nồng độ cao ngô (%) 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 0,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1.0 Nhiệt độ (oC) 28 28 28 28 24 24 32 32 24 24 32 32 28 28 28 28 28 Hàm lượng CoQ10 (mg/l) 82,885 78,048 90,872 107,285 93,571 85,433 93,571 109,518 78,912 101,791 95,831 105,901 127,177 124,478 126,506 126,58 125,35 Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện lên men tối ưu nhất: nồng độ sucrose 5 %, nồng độ bột cao ngô 1 % và nhiệt độ 28oC. Khi đó, hàm lượng CoQ10 đạt được 127,18 mg/l. 12 3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 3.5.1. Đánh giá các phƣơng pháp phá vỡ tế bào Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được phá vỡ bằng bốn phương pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl theo mô tả của Tian, xử lý bằng ethanol theo mô tả của Ranadive và xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria kết hợp với các bước tách chiết. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.29. . Kết quả cho thấy phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol cho hiệu quả thu nhận CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng (hình 3.29). 0.60 COQ10 (mg/g) 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 Siêu âm HCl EtOH Enzyme Phƣơng pháp xử lý tế bào Hình 3.29.Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào 3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol 3.5.2.1. Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 được chiết xuất tăng lên khi tỷ lệ ethanol/sinh khối tăng (hình 3.30). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu được với các tỷ lệ chiết khác nhau cho thấy tỷ lệ 10:1 cao hơn 1,32 lần (tương đương 24,3%) so với tỷ lệ 5:1, trong khi đó hàm lượng CoQ10 thu được ở tỷ lệ 15:1 chỉ cao hơn so với tỷ lệ 10:1 là 1,08 lần. Từ kết quả thu được tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sẽ được sử dụng để tách chiết CoQ10 trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.5.2.2. Xác định thời gian đồng hóa Kết quả hình 3.31 cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi thời gian đồng hóa tăng và đạt cao nhất ở thời gian 3 phút. Tuy nhiên khi thời gian đồng hóa tăng tiếp thì hiệu quả thu hồi CoQ10 lại giảm. Sự giảm này có thể là do tác động của sóng siêu âm trong thời gian dài đã làm phá hủy cấu trúc của CoQ10. 3.5.2.3. Xác định nhiệt độ xử lý 13 Kết quả hình 3.32 cho thấy khi nhiệt độ ủ tăng lên thì hàm lượng CoQ10 thu được cũng tăng (1,15 và 1,17 lần ở 37 oC và 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC. Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 37oC là phù hợp để thực hiện xử lý tế bào bằng ethanol. 5:1 10:1 15:1 Tỷ lệ ethanol/sinh khối (ml/g) 1 1 0.8 0.8 CoQ10 (mg/g) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 CoQ10 (mg/g) CoQ10 (mg/g) Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ sinh khối A. tumefaciens đã được xác lập và mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối vi khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 45oC. 0.6 0.4 0.2 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 5 10 Thời gian (phút) 15 25 37 60 Nhiệt độ (oC) Hình 3.32 Hình 3.30 Hình 3.31 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối (hình 3.30), thời gian đồng hóa (hình 3.31), nhiệt độ xử lý (hình 3.32) đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 3.5.3.1. Đánh giá so sánh độ sạch của dịch chiết Coenzyme Q10 CoQ10 thu được theo quy trình trên được phân tích và định lượng trên hệ thống HPLC với các điều kiện sắc ký như sau: Pha động A: Metanol 100%, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua màng lọc 0.45 μm. Pha động B: Ethanol 100%, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua màng lọc 0.45 μm. Cột C18 kích thước 250 mm x 4 mm nhồi hạt với kích thước 5μm. Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis tại bước sóng 275 nm. Kết quả được thể hiện trên hình 3.33A, 3.33B A B Hình 3.33. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B) 14 Kết quả cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại của CoQ10 (275 nm), chỉ thấy xuất hiện một số đỉnh phụ rất nhỏ so với đỉnh chính CoQ10 trên phổ sắc ký HPLC. So sánh với phổ CoQ10 chuẩn của hãng Sigma có thể thấy rằng dịch chiết CoQ10 là tương đối sạch khi so sánh ở bước sóng 275 nm. Tuy nhiên, trong dịch chiết còn có thể có chứa các hợp chất khác không hấp thụ cực đại tại bước sóng 275 nm. Do đó để đánh giá độ sạch, dịch chiết được phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm và so sánh với CoQ10 chuẩn. Kết quả cho thấy phổ hấp phụ của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn đều xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 275 nm, đây chính là đỉnh CoQ10. Khi so sánh phổ hấp thụ này so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tôi thấy hoàn toàn tương tự. Tuy nhiên, ngoài đỉnh chính (bước sóng 247 – 309) thì cường độ hấp thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với CoQ10 chuẩn (hình 3.34), điều đó chứng tỏ trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10 tách chiết cao hơn 2,59 lần so với CoQ10 chuẩn. 3.0 L1 S Cường độ hấp thụ 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Hình 3.24. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn 3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng dung môi Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh sạch CoQ10 là ethanol:hexane theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả so sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ 15 phổ hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết và 1,62 lần so với 2 lần chiết (hình 3.35). Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3 lần chiết sạch hơn so với 1 và 2 lần chiết. 3.0 L2 3.0 L3 2.0 2.5 Cường độ hấp thụ Cường độ hấp thụ 2.5 L1 1.5 1.0 0.5 0.0 L1 L3 S 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Bước sóng (nm) Hình 3.35 Hình 3.36 Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau (hình 3.35). So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (hình 3.36) Tiến hành phân tích phổ hấp thụ của dịch tinh sạch và so sánh với phổ hấp thụ CoQ10 chuẩn. Kết quả phổ hấp thụ ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3 lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương đương như cường độ hấp thụ của dịch CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối với dịch chiết 3 lần chiết) so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống 1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả thu được cho thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch hơn đặc biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương pháp này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10. 3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc gel qua cột silica Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch sử dụng sắc ký cột silica gel. Kết quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 109 – 800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm đi khoảng 24 % trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.37). 16 3.0 L3 S E Cường độ hấp thụ 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Bước sóng (nm) Hình 3.36. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ của dịch tinh sạch chỉ còn cao hơn là 1,46 lần và thấp hơn nhiều so với dịch CoQ10 chiết 1 lần (2,59) và dịch chiết 3 lần chiết (1,91). 3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp Dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp luận án đã xây dựng quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp như hình 3.38. Thuyết minh quy trình: Lên men: A. tumefaciens tái tổ hợp được nuôi cấy chìm ở 28oC, pH đầu 8, cấp giống OD 0.8, thời gian lên men 96 giờ. Ly tâm: Sinh khối được thu từ dịch lên men bằng cách ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút. Phá vỡ tế bào: Sinh khối được đồng hóa trong ethanol bằng siêu âm trong 3 phút, tỷ lệ sinh khối với ethanol là 10:1 (ml/g) ủ ở 37oC trong 3 giờ. Tách chiết CoQ10: Tiến hành ly tâm thu dịch tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, bổ sung n-hexan theo tỷ lệ 1:1 (v/v), chiết thu pha trên. Quá trình tách chiết được lặp lại 3 lần. Cô đặc: Sau khi chiết lấy pha trên tiến hành cô đặc chân không với áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC. Tinh sạch: CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung môi ethanol:hexane và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô đặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần). Sau đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạch bằng cột silica với dung môi ethanol làm 17 pha động và được cân bằng 10 lần thể tích cột. Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ dung môi rửa giải là ethanol. Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phân đoạn chứa CoQ10. Cô đặc: Sau khi thu lấy phân đoạn chứa CoQ10 tiến hành cô đặc chân không với áp suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC. A. tumefaciens tái tổ hợp Lên men (28oC, pH đầu 8, cấp giống OD giống 0.8, thời gian 96 giờ Ly tâm thu sinh khối Ethanol 100% Phá vỡ tế bào Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g, đồng hóa 3 phút, ủ 37o trong 3 giờ n –hexan tỷ lệ 1:1 Ly tâm thu dịch Tách chiết n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v) Cô đặc chân không Tinh sạch Chiết bằng ethanol:hexane, cô đặc, tinh sạch bằng cột silica Cô đặc chân không Chế phẩmCoQ10 Hình 3.3. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 18 3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 Nghiên cứu đặc tính cho thấy CoQ10 CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9, bị phá hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang (hình 3.39, 3.40, 3.41). 120 120 100 Độ bền tương đối (%) Độ bền tương đối (%) 100 80 60 40 20 4oC 25oC 37oC 24h 48h 72h 96h 120h 60 40 20 60oC 0 0h 80 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 0 144h 0h 24h Thời gian (giờ) 48h 72h 96h 120h Thời gian (giờ) Hình 3.39 Hình 3.40 Độ bền tương đối (%) 120 100 80 60 40 20 Che tối Chiếu sáng Leon Chiếu sáng mặt trời 0 0h 24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian (giờ) Hình 3.41 Ảnh hưởng của nhiệt độ(hình 3.39), pH (hình 3.40), ánh sáng (hình 3.41) đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens tái tổ hợp. 3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác định thông qua việc làm giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của Coenzyme Q10 tăng khi nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần. Dựa trên kết quả tính toán, tại nồng độ 0,18 mM Coenzyme Q10 có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH (EC50 = 0,18 mM). 3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ của CoQ10 Ảnh hưởng của CoQ10 đến tế bào ung thư được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào còn sống sau khi xử lý với CoQ10. Kết quả hình 3.44 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng ít đến sự sinh trưởng của cả hai dòng tế bào ung thư ở nồng độ dưới 20 µM sau 72 giờ 19 xử lý. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn 40 và 80 µM, CoQ10 đã có sự ảnh hưởng rõ rệt lên cả hai dòng tế bào ung thư. Đối với tế bào Hep-2C, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 35,1 và 27,1%; ở nồng độ 80 µM là 29,4 và 14,7% tương ứng. Đối với dòng tế bào FL, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 50,8 và 26,1% tương ứng; 100% tế bào bị chết ở nồng độ 80 µM sau 48 giờ xử lý. Kết quả nghiên cứu trên dòng tế bào thận thỏ bình thường RK13 cho thấy tế bào sinh trưởng hoàn toàn bình thường ở các nồng độ khảo sát. Số lượng tế bào/ giếng A 700000 Con trol 5 uM 10 u M 20 u M 40 u M 80 u M 600000 500000 20 µM 0 µM 80 µM 400000 300000 200000 100000 0 0h 24h 48h Thời gian (giờ) Số lượng tế bào/ giếng B 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 Control 0 µM 0h C Số lượng tế bào/ giếng 300000 Con trol 5 uM 10 uM 20 µM 20 uM 72h 40 uM 80 µM 24h 48h Thời gian (giờ) 5 uM 80 uM 10 u M 20 u M 72h 40 u M 80 u M 250000 0 µM 20 µM 0h 24h 48h Thời gian (giờ) 80 µM 200000 150000 100000 50000 0 72h Hình 3.44. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10 3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG 3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin 20