Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng mpcr để xác định phân týp của hiv 1 ở hà nội viêng chăn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y SA NGOUAN KA VANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH PHÂN TÝP CỦA HIV-1 Ở HÀ NỘI VÀ VIÊNG CHĂN (2007-2011) LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y SA NGOUAN KA VANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH PHÂN TÝP CỦA HIV-1 Ở HÀ NỘI VÀ VIÊNG CHĂN (2007-2011) Chuyên ngành: VI SINH Y HỌC Mã số: 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn 2. GS. TS. Lê Bách Quang HÀ NỘI - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này đã sử dụng một phần số liệu trong đề tài nghiên cứu cấp Bộ Quốc phòng có tên: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠ SỞ NGUỒN GEN VÀ NGUỒN CHỦNG CÁC MẦM BỆNH PHỤC VỤ KIỂM SOÁT CÁC TÁC NHÂN SINH HỌC”. Kết quả đề tài là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên tham gia. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng một phần số liệu để bảo vệ luận án tiến sĩ. Các kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác ngoài nhóm nghiên cứu. Tác giả SA NGOUAN KA VANH LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng Nhà nước, Bộ quốc phòng, các bộ các ngành có liên quan của hai nước iệt - ào trực tiếp là phòng T y viên Quốc phòng Đại sứ quán nước CHDCND Lào tại nước CHXHCN Việt Nam đã tin tưởng và cử tôi sang Việt Nam học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy - Ban giám đốc Học viện Quân y, Bệnh viện quân y 103, Phòng Sau đại học, Bộ môn - Khoa Vi sinh y học, Trung tâm Y - Dược học Quân sự, Phòng xét nghiệm sinh học phân tử - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn và GS.TS. ê Bách Quang nh ng người thầy có nhiều kiến thức dày dặn kinh nghiệm đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn chỉ bảo giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện đề tài và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng biết ơn các thầy cô trong và ngoài Học viện đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và đóng góp nh ng ý kiến quý báu cho tôi hoàn thiện luận án và chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi về vật chất, tình thần trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các bệnh viện trung tâm phòng chống điều trị HI IDS và nh ng người trong đối tượng nghiên cứu ở khu vực Hà ội - iệt am và iêng Ch n - ào đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi lấy mẫu bệnh ph m để hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Đại tá Thiều Minh Hùng Hệ trưởng Hệ Quốc tế và tập thể cán bộ nhân viên Hệ Quốc tế đã tạo điều kiện giúp đỡ về nơi n chỗ ở và động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi vô cùng biết ơn đại gia đình bên nội và ngoại đặc biệt là vợ các con đã hết lòng ủng hộ động viên tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và là động lực giúp tôi vượt qua nh ng khó kh n để hoàn thiện luận án. Tác giả luận án SA NGOUAN KA VANH MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang ời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................01 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN……..............................................................…04 1.1. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên toàn cầu…..........................................04 . . . Tình hình HI IDS ở châu Á..................…....................................05 1.1.2. Tình hình nhiễm HI ở iệt am...................................................05 . .3. Tình hình nhiễm HI ở ào..............................................................06 1.2. Nguồn gốc, xuất xứ của HIV.................................................................... .07 1.3. Cấu trúc HIV..............................................................................................11 .3. . Đặc điểm cấu trúc của virus HI .......................................................11 .3. . Sự xâm nhập và quá trình nhân lên của HI trong tế bào chủ thể....14 1.4. Vài nét lịch sử phân loài HIV...................................................................16 1.4.1. Các phân týp HIV.............................................................................17 . . . hân bố các phân t p HI - tại các khu vực trên toàn cầu...............18 . .3. Đồng nhiễm bội nhiễm và các dạng tái tổ hợp của HI -1...............19 1.5. Đ c i m phân t p HIV-1 ở một số khu vực...........................................20 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở châu Phi................................................20 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở châu Âu................................................21 . .3. Đặc điểm phân t p HI - ở châu Mỹ...............................................21 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở Trung Đông..........................................22 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở Liên Bang Nga.....................................22 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở châu Úc.................................................22 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở châu Á..................................................23 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở iệt am ...........................................24 . . . Đặc điểm phân t p HI - ở Lào.....................................................24 1.6. Một số kỹ thuật xác ịnh phân t p HIV-1...............................................25 . . . hát hiện kháng thể peptide đặc hiệu HI -1......................................25 . . . Kỹ thuật Heteroduplex Mobility ssay (HM )...............................25 . .3. Kỹ thuật giải trình tự gen (Sequencing).............................................26 . . . Kỹ thuật multiplex CR hay m CR ( CR đa mồi)...........................27 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........30 2.1. Đối tƣợng....................................................................................................30 . . . Địa điểm lấy mẫu máu ở khu vực Hà ội (K H ) - Viêt Nam...30 . . . Địa điểm lấy mẫu máu ở khu vực iêng Ch n (K C) - Lào.....30 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu..................................................................32 . . . Các sinh ph m hoá chất chính..........................................................32 . . . Các máy và thiết bị chính.................................................................33 . .3. Các mồi d ng trong nghiên cứu........................................................33 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................36 .3. . Thiết kế nghiên cứu..........................................................................36 .3. . Tách chiết acid nucleic (R hoặc D ).......................................38 .3.3. Tham khảo quy trình của tác giả Fumihiro ( 00 )..........................40 .3. . Quy trình thực hiện m CR...............................................................50 2.4. Các bƣớc tối ƣu chu trình nhiệt và các thành phần của phản ứng PCR và mPCR...................................................................................53 . . . Tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp.............................................. 3 . . . Tối ưu hóa thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi...................................59 . .3. Tối ưu hóa nồng độ MgCl2................................................................60 2.5. Xác ịnh kích thƣớc sản phẩm PCR........................................................62 2.6. Ch y ki m tra quy trình sau khi tối ƣu và áp dụng...............................62 2.7. Giải trình tự gen ối chiếu kết quả với kỹ thuật mPCR........................63 . . . Tinh sạch sản ph m CR ................................................................63 . . . Bước chạy phản ứng CR gắn BigDye.......................................65 . .3. Bước 3 tinh sạch sản ph m CR gắn BigDye..................................66 . . . Bước biến tính HiDi Formamid...................................................66 2.8. Địa i m và thời gian nghiên cứu........................................................66 . . . Địa điểm nghiên cứu.................................................................... . . .Thời gian nghiên cứu ......................................................................66 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ...............................................................................67 3.1. Tối ƣu hóa qui trình mPCR xác ịnh phân t p HIV-1 phù hợp ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn.......................................................67 3. . . Kết quả tách D ..............................................................................67 3. . . Kết quả lựa chọn quy trình phản ứng CR........................................68 3. .3. Kết quả tối ưu hoá quy trình m CR xác định phân t p HI -1..........70 3. . . Kết quả kiểm tra quy trình tối ưu.................................................77 3. . . Quy trình xác định phân t p HI - trên các đối tượng nhiễm ở Khu vực Hà ội và khu vực iêng Ch n........................................ 3.2. Kết quả xác ịnh phân t p HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn..84 3. . . Kết quả xác định phân t p HI - khu vực H và C bằng m CR. 3. . . Kết quả giải trình tự gen đối chiếu với kết quả kỹ thuật m CR........87 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN..........................................................................100 4.1. Tối ƣu hóa quy trình mPCR xác ịnh phân t p HIV-1 trên các ối tƣợng nhiễm ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn.............................100 . . . ựa chọn phương pháp tách D và R ....................................100 . . . ựa chọn kỹ thuật xác định phân t p HI -1...................................101 . .3. ựa chọn quy trình phản ứng multiplex CR.............................. 102 . . . Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp..........................................103 . . . Kết quả tìm thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi............................. 04 . . . Kết quả tối ưu hoá nồng độ MgCl2.............................................105 . . . Kiểm tra qui trình tối ưu.................................................................106 4.2. Ứng dụng quy trình mPCR xác ịnh phân t p HIV-1 trên các ối tƣợng ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn...............................................110 KẾT LUẬN.................................................................................................117 DANH MỤC CÁC C NG TR NH C NG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Từ viết tắt Từ gốc tiếng Anh viết ầy ủ/nghĩa tiếng Việt AIDS Aquired Immune Deficiency Syndrome/ Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải bp Base pair/cặp bazơ BLAST Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm trình tự tương đồng CD4 Cluster of Differentiation 4 CDC Centers for Disease Control and Prevention/Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh cDNA Complementary DNA chuỗi D bổ sung CHAS Centre for HIV/AIDS/STI Trung tâm phòng chống HI IDS và các bệnh lây truyền qua đường tình dục quốc gia ào CRF- cpx Circulating recombinant form – Complex Tái tổ hợp phức tạp CRFs Circulating recombinant forms Tái tổ hợp lưu hành DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotit triphosphate/ Edit Editorial EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay/Thử nghiệm miễn dịch xít deoxyribonucleic gắn enzym Env Envelop vỏ GMD Gái mại dâm GC Guanine - Cytosine gag group specific antigen/ Kháng nguyên đặc hiệu nhóm gp Glycoprotein irus gây suy giảm miễn dịch ở người HIV Human Immunodeficiency Virus Invi Invitrogen Kda Kilodalton KVHN Khu vực Hà ội KVVC Khu vực iêng Ch n MOH Ministry of Health Bộ Y tế mPCR Multiplex olymerase Chain Reaction hản ứng CR đa mồi NC ghiên cứu NCMT Nghiện chích ma túy OD Optical Density Mật độ quang học PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cell Tế bào bạch cầu máu ngoại vi đơn nhân RNA Acid ribonucleic/ xít ribonucleic RT Reverse Transcriptase/ Enzyme phiên mã ngược TBE Tris Borat EDTA Tm Melting Temperature/ Nhiệt độ nóng chảy tMRCA Time of most recent common ancestor Ước tính thời gian xuất hiện nguồn gốc gần nhất. irus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ SIV Simian Immunodeficiency Virus URF Unique recombinant form Tái tổ hợp duy nhất UNAIDS United Nation Program on HIV and AIDS Prevention Chương trình hỗ trợ và phòng ngừa HI IDS của iên hợp quốc V Volt / Vôn WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Tóm tắt đại dịch HIV/AIDS toàn cầu n m 0 1.2. Nguồn gốc, xuất xứ, phân loài của HIV …………………………….04 ………………….……………..09 2.1. Nh ng ký hiệu cho các đối tương nghiên cứu theo khu vực...............................31 2.2. Thành phần phản ứng PCR1 của tác giả Fumihiro………………………….. 0 2.3. Thành phần phản ứng PCR 2.1 của tác giả Fumihiro.......................................51 2.4. Thành phần phản ứng PCR 2.2 của tác giả Fumihiro......................................52 2.5. Thành phần của phản ứng PCR1 tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp.......… 2.6. Thành phần của phản ứng PCR 2.1 tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp…...55 2.7. Thành phần của phản ứng PCR 2.2 tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp…...57 2.8. Thành phần của phản ứng PCR 2.2 tối ưu hóa thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi.......................................................................................................59 2.9. Thành phần của phản ứng PCR 2.2 tối ưu hóa nồng độ MgCl2……...………. 61 3.1. So sánh nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách từ Buffycoat và khối tế bào máu……………………………………………………………………67 3. . Kết quả CR . trước khi tối ưu quy trình..............................................68 3.3: Kết quả CR . trước khi tối ưu quy trình.............................................. 3. . Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp của CR . ống dãy a..............71 3. . Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp của CR . ống dãy b..............72 3. . Kết quả nhiệt độ gắn mồi thích hợp của CR . ống dãy a.....................73 3. . Kết quả nhiệt độ gắn mồi thích hợp của CR . ống dãy b...................74 3. . Kết quả tối ưu thời gian gắn mồi trong phản ứng m CR......................... 3. . Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2................................................................76 3. 0. Kết quả CR . sau khi tối ưu quy trình................................................77 Bảng Tên bảng Trang 3.11. Kết quả PCR2.2 sau khi tối ưu quy trình.......................................................78 3.12. Thành phần của phản ứng PCR1....................................................................80 3.13. Thành phần của phản ứng PCR2.0 đã tối ưu..................................................81 3.14. Thành phần phản ứng của PCR 2.1 đã tối ưu..................................................82 3.15. Thành phần phản ứng của PCR 2.2 đã tối ưu.................................................83 3.16. Kết quả xác định phân týp HIV-1 bằng mPCR..............................................87 3.17. Kết quả đối chiếu phân týp HIV-1 của 10 mẫu mPCR có kết quả phân t p E...........................................................................................96 3.18. Kết quả đối chiếu phân týp HIV-1 của 05 mẫu mPCR có kết quả khác phân t p E.....................................................................................................97 3.19. Kết quả xác định phân týp HIV-1 bằng mPCR theo khu vực nghiên nghiên cứu……………………………............................................................97 3.20. Tỷ lệ phân bố phân týp HIV-1 trên các nhóm nghiên cứu ............................98 3.21. Tỷ lệ phân bố phân týp HIV-1 trên các nhóm nghiên cứu ở khu vực Hà Nội và Viêng Ch n........................................................................................99 4.1. Một số kết quả nghiên cứu phân týp HIV-1 bằng mPCR.........................111 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Bi u ồ Tên bi u ồ Trang . . Tình hình HI IDS tử vong do AIDS qua các n m tại iêt am………….06 . . Tình hình HI IDS tử vong do AIDS qua các n m tại Lào...........................07 1.3. Nh ng virus thuộc họ Retroviridae có thể gây bệnh cho vật chủ……….........08 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ ồ Tên sơ ồ Trang 1.1. Cấu trúc gen của HIV- ………………………………………………............13 2.1. Các bước tiến hành xác định phân týp HIV- 1...................... .............................37 2.2. Mồi dùng cho các vòng PCR và kích thước sản ph m........................................40 .3. ị trí các cặp mồi bắt cập tương ứng với đoạn cấu trúc gen gp41......................41 2.4. Các bước giải trình tự gen....................................................................................63 3.1.Tóm tắt qui trình m CR xác định phân t p HI -1 trên các đối tượng tượng nhiễm ở khu vực Hà Nội - Viêng Ch n……………………………79 DANH MỤC CÁC H NH Hình Tên hình Trang 1.1. Con người sinh hoạt có thể tiếp xúc với Retrovirus. .....................................10 1.2. Cấu trúc phân tử của virus HIV ……………………………………………14 1.3. HIV sử dụng đồng thụ thể và chu kỳ nhân lên của nó………….…................16 2.1. Thang chu n đo kích thước sản ph m D A............................................36 3.1. Ảnh điện di sản ph m CR . trước khi tối ưu quy trình …………………...68 3.2. Ảnh điện di sản ph m CR . trước khi tối ưu quy trình………..…………..69 3.3. Ảnh điện di kết quả PCR2.1 tối ưu nhiệt độ gắn mồi của ống dãy a………… 0 3.4. Ảnh điện di kết quả PCR2.1 tối ưu nhiệt độ gắn mồi ống dãy b …………71 3.5. Ảnh điện di kết quả PCR2.2 tối ưu nhiệt độ gắn mồi ống dãy a …………72 3.6. Ảnh điện di kết quả PCR 2.2 tối ưu nhiệt độ gắn mồi của ống dãy b .........73 3.7. Ảnh điện di kết quả CR tối ưu hoá thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi …....74 3.8. Ảnh điện di kết quả PCR tối ưu nồng độ MgCl2 ...........................................76 3.9. Ảnh điện di kết quả PCR 2.1 sau khi tối ưu…...……………………………..77 Hình Tên hình Trang 3. 0. Ảnh điện di kết quả CR . sau khi tối ưu ……………………………78 3.11. Ảnh điện di kết quả các mẫu đại diện cho khu vực Hà ội.......................84 3. . Ảnh điện di kết quả các mẫu đại diện cho khu vực iêng Ch n...............85 3. 3. Ảnh điện di các mẫu đại diện cho phân t p: E B C và B hoặc D trên gel agarose 1%....................................................................................86 3. . Ảnh kết quả giải trình tự v ng gen gp mẫu H 0 ….………………88 3. . Ảnh phân tích bằng công cụ iral Genotyping mẫu H 3.1 . Ảnh kết quả giải trình tự v ng gen gp 0 ....................89 mẫu C 0 ..............................90 3. . Ảnh phân tích bằng công cụ iral Genotyping mẫu C 0 ………........91 3. . Ảnh kết quả giải trình tự v ng gen gp mẫu C 33..............................92 3. . Ảnh phân tích bằng công cụ iral Genotyping mẫu C 33....................93 3. 0. Ảnh kết quả giải trình tự v ng gen gp mẫu CB0 .…………………94 3. . Ảnh phân tích bằng công cụ iral Genotyping mẫu CB0 ………........95 1 ĐẶT VẤN ĐỀ HIV (Human Immunodeficiency V y y Sy AIDS (Acquired Immuno V, ố T S y ố giai 4 ủ ố ố , y , V ữ ụ y trên ồ N ữ S UNAIDS/WHO trên 30 tri và thuố o ng 76 tri q it V/ [143]. D S ặc tr , V i b nhi 30 y V q tâm lớn toàn c u. V ồ 2 V-1 và HIV-2, y , ò ốq ố ự T yP V-1 có ặ G phân týp (Sub - y - R V-1 ồ (non - M, non - O , 4 :M M P P O ỉ y , 10 V-1 ớ ỉ í y y , ặ M ớ ,O O P M N P í y ồ : ừ ,N [16], [65], [114], [115], í T yT , y V-2 S ặ N w N [132], p n nay, theo n AIDS [139], [140], [141], [142], x t hi y q ố M Kỳ [95]; 1981 N , B, , G; , E, , G, ,J , J, K K ặ ớ 2 [28], [122]. M ố ớ P A4, A5 [50], [120], [128], [145] B [113] L ò 1, B’ 1, 2 2, 3, ặ B-Thái [120], [138], [139]; 51 ể x [34]. Đ ặ ố ồ y y , E ủ ớ, ò Đ N Á ồ í ; y, ừ í y y B T P ủ ì q ữ y y ụ Bắ Mỹ, T y  , í B ữ ằ q y; y L , E ữ ố í q ứ ì ụ [55], ố , V-1 ự ự quan ự , ố S q q [68], [113], [130], [148] Vì kh í V-1 thích nghi lây tr y B ừ ỗ ,k q , í , ò , ể í ừ í ặ y x ể ELISA p týp HIV ặ Mobility Assay (HMA), ỹ kỹ V-1, kỹ thu t Heteroduplex yP R multiplex PCR (mPCR), ồ kỹ ỗ thu t gi i trình tự gen (Sequencing), và phân tích loài (phylogenetic), V3 ủ x týp ủ cao. Kỹ ứ , trong í x ò ì yy , y í V-1 ứ ỹ ự ể V-1 T y x mPCR ớ ể ố ể , ự 3 , , í, ặ ỹ í ớ ủ V L ò N L ể ự y, ỹ ự . Vì v y : “Nghiên cứu ứng dụng multiplex PCR để xác định phân týp của HIV-1 ở Hà Nội - Viêng Chăn (2007- 2011) ” ớ ụ : 1. Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn. 2. Xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 trên các đối tượng ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn bằng kỹ thuật multiplex PCR.