Tài liệu Sàng lọc vi khuẩn bacillus có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi (pangasianodon hypophthalmus)

i ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 HƯƠNG 1. 1.1 1.2 1.3 1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM .............................. 5 1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản .............................................................5 1.1.2 Tình hình nuôi trồng cá tra ..................................................................5 TỔNG QUAN VỀ CÁC BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÁ TRA ................ 6 1.2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra ...............................................................6 1.2.2 Bệnh trắng gan, trắng mang ..............................................................10 1.2.3 Bệnh xuất huyết trên cá tra ................................................................12 VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ................................................... 12 1.3.1 Hệ thống phân loại ............................................................................12 1.3.2 Đặc điểm sinh hóa .............................................................................13 1.3.3 Con đường xâm nhiễm của Edwardsiella ictaluri ............................14 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 14 1.5 1.4.1 Định nghĩa probiotic ..........................................................................15 1.4.2 Cơ chế tác động của probiotic trong nuôi trồng thủy sản .................16 VI KHUẨN BACILLUS ................................................................................. 19 1.5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus ......................................................19 1.5.2 Dinh dưỡng và phát triển ...................................................................20 1.5.3 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản .............................20 HƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU.................... 21 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................... 22 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 22 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................22 2.2.2 Chủng vi khuẩn thử nghiệm ..............................................................22 2.2.3 Cá tra dùng để thử nghiệm ................................................................22 2.2.4 Môi trường - hóa chất ........................................................................22 ii 2.2.5 2.3 Thiết bị - dụng cụ ..............................................................................22 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 24 2.3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm ................................................................24 2.3.2 Phân lập Bacillus ...............................................................................25 2.3.3 Thử đối kháng với Edwardsiella ictaluri ..........................................26 2.3.4 Thử khả năng sinh enzym ngoại bào .................................................28 2.3.5 Khảo sát khả năng chịu muối môi trường nuôi và pH môi trường nuôi ...........................................................................................................29 2.3.6 Thử khả năng chịu đựng acid dạ dày ................................................30 2.3.7 Thử khả năng chịu muối mật .............................................................30 2.3.8 Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng kháng sinh (MIC) .....................31 2.3.9 Đánh giá tính an toàn của các chủng Bacillus tiềm năng với vật chủ ...........................................................................................................32 2.3.10 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus spp. lên cá tra bột ...........................................................................................................33 2.3.11 Thí nghiệm đánh giá mật độ gây nhiễm thích hợp của chủng Edwardsiella ictaluri lên cá tra bột ...........................................................................33 2.3.12 Thí nghiệm khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra bột) ở qui mô phòng thí nghiệm của Bacillus với Edwardsiella ictaluri ...................................................34 2.3.13 Xây dựng đường tương quan giữa giá trị OD và mật độ tế bào vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................................................................................35 2.3.14 Xác định liều gây chết trung bình - LD50 ........................................36 2.3.15 Thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra giống) ở quy mô phòng thí nghiệm của vi khuẩn Bacillus với Edwardsiella ictaluri ...................37 2.3.16 Xử lý kết quả .....................................................................................39 2.3.17 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự .............................39 HƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 44 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP BACILLUS ............................................................... 45 3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG ..................................................................... 47 3.2.1 Phương pháp cấy vạch vuông góc .....................................................47 iii 3.2.2 Phương pháp đổ thạch hai lớp ...........................................................49 3.2.3 Kết quả xác định phần trăm ức chế của dịch lên men của 3 chủng Bacillus spp. với Edwardsiella ictaluri. ....................................................................51 3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO..... 52 3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI VÀ PH MÔI TRƯỜNG NUÔI ....................................................................................................... 52 3.5 3.6 3.7 3.4.1 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối môi trường nuôi ...............52 3.4.2 Kết quả khả năng chịu pH môi trường nuôi ......................................52 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU ACID DẠ DÀY................ 53 3.5.1 Thử nghiệm khả chịu pH = 2.............................................................53 3.5.2 Kết quả khả năng chịu pH = 3 ...........................................................53 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI MẬT ..................... 55 3.6.1 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 0,5% ..........................55 3.6.2 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 1% .............................55 3.6.3 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 2% .............................56 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG NHẠY/ KHÁNG VỚI KHÁNG SINH 57 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS TIỀM NĂNG VỚI VẬT CHỦ ............................................... 58 3.8.1 Kết quả đánh giá khả năng dung huyết .............................................58 3.8.2 Kết quả thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus spp. lên cá tra bột 3.9 59 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ GÂY NGHIỄM THÍCH HỢP CỦA CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI LÊN CÁ TRA BỘT .................................. 60 3.10 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢ NĂNG BẢO VỆ VẬT CHỦ (CÁ TRA BỘT) Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA BACILLUS VỚI EDWARDSIELLA ICTALURI ................................................................................... 61 3.11 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA GIÁ TRỊ OD VÀ MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI .............................. 62 iv 3.12 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LIỀU GÂY CHẾT TRUNG BÌNH – LD50 CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI LÊN CÁ TRA GIỐNG ............................................. 62 3.13 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢ NĂNG BẢO VỆ VẬT CHỦ (CÁ TRA BỘT) Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA BACILLUS VỚI EDWARDSIELLA ICTALURI ................................................................................................................. 63 3.14 kẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ........................................................................................................................ 66 3.14.1 Kết quả hiệu chỉnh trình tự ...............................................................66 3.14.2 Kết quả so sánh trình tự trên cơ sở dữ liệu GenBank .......................66 3.15 TỒNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 68 HƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 70 4.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 71 4.2 ĐỀ NGHỊ........................................................................................................ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 72 PHỤ LỤC 1 ............................................................................................................... 79 PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................... 81 PHỤ LỤC 3 ............................................................................................................... 84 PHỤ LỤC 4 ............................................................................................................... 86 DANH M C CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của E. ictaluri (Holt và cs., 1994)............................... 13 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR ........................................................................ 42 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR................................................................ 42 Bảng 3.1 Kết quả phân lập ........................................................................................ 45 Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ................ 47 Bảng 3.3 Kết quả đường kính vòng kháng................................................................ 49 Bảng 3.4 Tỉ lệ phần trăm ức chế ............................................................................... 51 Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào .............................. 52 Bảng 3.6 Thử nghiệm khả năng chịu muối ở các nồng độ khác nhau ...................... 52 Bảng 3.7 Thử nghiệm khả năng chịu pH ở các nồng độ khác nhau ......................... 52 Bảng 3.8 Phần trăm sống sót của chủng thử nghiệm trong môi trường pH = 2 ....... 53 Bảng 3.9 Tỉ lệ phần trăm vi khuẩn sống sót trong môi trường pH= 3 (đơn vị: CFU/ mL) ............................................................................................................................ 54 Bảng 3.10 Phần trăm sống sót của các chủng thử nghiệm trong môi trường có nồng độ muối mật 0,5% ( đơn vị: %) ................................................................................. 55 Bảng 3.11 Phần trăm sống sót của các chủng thử nghiệm trong môi trường thử muối mật nồng độ 1% (đơn vị: %) ..................................................................................... 56 Bảng 3.12 Phần trăm sống sót của các chủng trong môi trường muối mật có nồng độ 2 % ( đơn vị: %) ........................................................................................................ 56 Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm MIC (µg/ml)............................................................ 57 Bảng 3.14 Kết quả khả năng gây dung huyết ........................................................... 58 Bảng 3.15 Tỷ lệ sống của cá tra bột sau 48 h bổ sung Bacillus spp. ........................ 59 Bảng 3.16 Kết quả khảo sát LD50 trên cá tra bột sau 48 h bổ sung E. ictaluri ......... 60 Bảng 3.17 Tỷ lệ sống (%) của cá tra bột sau 48 h ở thí nghiệm ............................... 61 Bảng 3.18 Giá trị OD610 và mật độ tế bào (log (N/ mL) ........................................... 62 Bảng 3.19 Kết quả LD50 ............................................................................................ 63 Bảng 3.20 Tỉ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm với E. ictaluri ............................... 64 Bảng 3.21 Kết quả hiệu chỉnh trình tự ...................................................................... 66 Bảng 3.22 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của chủng Bacillus Q16 và Bacillus Q111 ............................................................................................................................ 67 Bảng 3.23 Kết quả thử nghiệm sinh hóa ................................................................... 67 Bảng 3.24 Bảng kết quả tổng hợp ............................................................................. 68 Bảng 0.1Bảng một số test sinh hóa phân biệt với Bacillus subtilis .......................... 89 DANH M SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm ................................................................................. 24 Sơ đồ 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ cá tra giống trong điều kiện gây nhiễm Edwardsiella ictaluri của chủng Bacillus Q16 và Bacillus Q111 ...... 38 Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết DNA của vi khuẩn Bacillus ..................................... 41 DANH M C BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Khả năng đối kháng của Bacillus spp. theo thời gian đối với chủng E. ictaluri ...................................................................................................................... 50 Biểu đồ 3.2 Phần trăm ức chế .................................................................................. 51 Biểu đồ 3.3 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở pH = 2 ...................... 53 Biểu đồ 3.4 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở pH = 3 ...................... 54 Biểu đồ 3.5 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ muối mật 0,5% theo thời gian .................................................................................. 55 Biểu đồ 3.6 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ muối mật 1% theo thời gian ..................................................................................... 56 Biểu đồ 3.7 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ muối mật 2% theo thời gian ..................................................................................... 57 Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ sống của cá tra bột sau 48 h bổ sung Bacillus spp. ...................... 59 Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ chết dồn của cá tra bột sau 48 h bổ sung E. ictaluri ................... 60 Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ sống của cá tra bột sau 48h ở thí nghiệm ................................... 61 Biểu đồ 3.11 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ..................................................................................... 62 NH CÁC H NH Hình 1.1 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Biểu hiện đặc trưng của bệnh gan thận mủ (B) .................................................................................................. 8 Hình 1.2 Cá bệnh (trên), cá khỏe (dưới) ................................................................... 10 Hình 1.3 Cá tra bị xuất huyết bụng ........................................................................... 12 Hình 1.4 Hình nhuộm Gram vi khuẩn E. ictaluri (A), hình khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn E. ictaluri trên môi trường thạch máu (B) ................................................. 13 Hình 2.1 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc.................................................... 27 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử nghiệm lên cá tra bột .............................................................................................................. 33 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá mật độ gây nhiễm thích hợp của chủng Edwardsiella ictaluri lên cá tra bột ........................................................................... 34 Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. lên cá tra bột .............................................................................................................................. 35 Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus Q16 và Bacillus Q111 trên môi trường NA sau 24 h nuôi cấy ............................................................................................................. 47 Hình 3.2 Nhuộm Gram Bacillus Q16 và Bacillus Q111............................................... 47 Hình 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ................ 49 Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng chịu pH = 3 của chủng Q16..................................... 54 Hình 0.1Hình chạy điện di trên gel agarose và chụp hình bằng máy Bio-rad .......... 81 Hình 0.2 Kết quả thử CMC ....................................................................................... 81 Hình 0.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn khảo sát lên tỉ lệ sống của cá........... 81 Hình 0.4 Cá khi bị bệnh gan thận mủ ....................................................................... 82 Hình 0.5 Kết quả thử khả năng sinh β-D-glucosidase .............................................. 82 Hình 0.6 Đông khô thu sinh khối Bacillus Q16 và Bacillus Q111 .............................. 83 Hình 0.7 Trình tự 16S rDNA sau khi hiệu chỉnh của chủng Bacillus Q16 ................ 84 Hình 0.8 Trình tự 16S rDNA sau khi hiệu chỉnh của chủng Bacillus Q111 ............... 85 DANH M C CHỮ VIẾT TẮT 16S rDNA 16S rRNA ANOVA BLAST BOD bp CFU CMC cs. ddNTP DNA ĐBS FAO h LD50 NTTS OD PTN rRNA subunit ribosomal deoxyribonucleic acid subunit ribosomal ribonucleic acid One-way analysis of variance Basic Local Alignment Search Tool Biochemical Oxygen Demand base pair Colony Forming Unit Carboxymethyl cellulose Cộng sự dideoxynucleotide triphosphate Deoxyribo Nucleotide Triphosphate Đồng bằng sông Cửu Long Food and Agriculture Organization of the United Nations Giờ Lethal Dose 50% Nuôi trồng thủy sản Optical Density Phòng thí nghiệm ribosomal ribonucleic acid VSV WHO Vi sinh vật World Health Organization Mẫu 11. Thông tin kết quả nghiên cứu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Đơn vị: Trường ĐH ở TPHCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Sàng lọc vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) Mã số: - Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Văn Minh Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Mở TPHCM - Thời gian thực hiện: 11/ 2007 - 4/ 2013 - 2. Mục tiêu: phân lập và sàng lọc vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic và kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri dùng cho cá tra nuôi. 3. Tính mới và sáng tạo: - Hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Q16 và Q111 vừa có khả năng làm probiotic vừa có khả năng kiểm soát sinh học E. ictaluri. - Kết quả của đề tài là tiền đề để sản xuất chế phẩm probiotic dùng kiểm soát E. ictaluri trong nuôi trồng cá tra, sản phẩm ở Việt Nam chưa có. 4. Kết quả nghiên cứu: - Hai chủng Bacillus (Q16, Q111) có khả năng ứng dụng cao làm probiotic cho cá tra nuôi được lựa chọn từ 28 chủng Bacillus phân lập được từ mẫu nước, bùn ao nuôi cá tra và phân trùn quế. Chúng được sàng lọc 7 hoạt tính probiotic: kháng E. ictaluri, sinh enzyme tiêu hóa (protease, amylase, cellulase), phát triển mạnh ở nồng độ muối từ 0,1 – 1%, sống được ở pH từ 6 – 8, chịu pH thấp và muối mật và không có khả năng sinh enzyme hemolysin, nhạy cảm với 8 loại kháng sinh thuộc 3 nhóm tác động. Hai chủng Bacillus (Q16, Q111) được định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA và kết quả cho thấy chúng tương đồng với loài Bacillus subtilis. - Chủng B. subtilis Q16 và B. subtilis Q111 đều cho thấy khả năng bảo vệ vật chủ khỏi tác nhân gây bệnh E. ictaluri trong thử nghiệm với cá tra nuôi ở bể composite. 5. Sản phẩm: - Chủng vi khuẩn B. subtilis Q16 và B. subtilis Q111 có khả năng làm probiotic và kiểm soát E. ictaluri. - Đào tạo được 04 cử nhân công nghệ sinh học. - Một bài báo cáo “Khả năng kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ ao nuôi cá tra” tại hội nghị hội nghị khoa học công nghệ quốc tế ISCE2013”. Bài cũng được chấp nhận đăng trên tạp chí Khoa học và Công nghệ. - Một bài báo cáo poster “Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Bacillus spp. có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus)” tại hội nghị “Công nghệ sinh học toàn quốc, khu vực phía Nam lần III” ngày 22/11/2013 do Sở Khoa học và Công nghệ TP. HCM, Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM, Viện Pasteur TP. HCM tổ chức. 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: - Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất chế phẩm phục vụ nuôi trồng thuỷ sản. Ngày 21 ơ quan chủ trì tháng 01 năm 2014 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên, đóng dấu) (ký, họ và tên) Nguyễn Văn inh Mẫu 12. Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING HO CHI MINH CITY OPEN UNIVERSITY INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information  Project Title: Screening of Bacillus as probiotics for farm catfish (Pangasianodon hypophthalmus)  Project Code:  Coordinator: Nguyen Van Minh  Project Owner: Ho Chi Minh City Open University  Project time: November 2007 – April 2013 2. Purpose of the Study Isolated and screening of Bacillus as probiotics and biological control of Edwardsiella ictaluri for catfish. 3. Creation and innovation  Two Bacillus subtilis Q16 and Q111 have both abilities as probiotic and biological control of E. ictaluri.  Results of the project are the premise to continuing research and production of probiotic for control E. ictaluri in catfish culture, a product has never seen in Vietnam. 4. Research results  Two Bacillus strains (Q16, Q111) that can be applied as high potential probiotic for farm catfish are selected among 28 Bacillus strains that isolated from water samples, catfish pond mud samples and Perionyx excavates casting. They had been screening 7 activity of probiotics: the inhibition ability to E. ictaluri, production of extracellular enzyme (protease, amylase, cellulase), strong growth at salt concentrations from 0,1 to 1%, survival in pH from 6 to 8, resistance to low pH and bile salts, inability to produce haemolysin enzyme, sensitivity to eight antibiotic in the three impacting group. Two Bacillus strains (Q16, Q111) were identified by the 16S rDNA sequencing and the result showed that they are similar to Bacillus subtilis species.  Both B. subtilis Q16 and B. subtilis Q111 strains had shown the ability to protect the host against E. ictaluri in the experiments with catfish feeding composite ponds. 5. Products  B. subtilis Q16 and B. subtilis Q111 have the ability to produce probiotics and biologically control E. ictaluri.  Trained four (04) Bachelors of Biotechnology.  One report “Biocontrol of pathogenic edwardsiella ictaluri by bacillus spp. isolated from catfish pond” at the scientific and technology international conference ISCE2013. The report has been accepted for publication on the Scientific and Technology Journal (in press).  One (01) report poster “Isolation and selection of bacillus strans with high potential probiotic that used catfish (Pangasianodon hypophthalmus)” has been presented at the 3rd National Biotechnology Conference in Southern Vietnam 2013 dated 22 November 2013, held by the Department of Science and Technology of Ho Chi Minh City, Biotechnology Center of Ho Chi Minh City, Pasteur Institute of Ho Chi Minh City. 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability  Transfer the research results to organization for producing bio-products served in aquaculture. Ho Chi Minh City, 21th January 2014 Project Owner Project Author (Signed and Stamped) Nguyen Van Minh Trang 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trang 2 Hiện nay, đối tượng và mô hình NTTS ở Việt Nam khá phong phú, chủ lực nhất vẫn là nuôi cá tra thâm canh ở vùng nước ngọt và nuôi tôm ở vùng nước lợ ven biển. Theo báo cáo của tổng cục thủy sản, năm 2013, sản lượng nuôi cá tra đạt 1,5 triệu tấn và sản lượng tôm nuôi đạt 548 ngàn tấn (Linh Chi, 2013). (Nguyễn Thanh Phương và cs., 2009) Tuy nhiên, cùng với sự thâm canh hóa của nghề nuôi cá tra là sự suy thoái về môi trường và sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ngày một nhiều hơn. Trong số những bệnh thường gặp trên cá tra, thì bệnh do vi khuẩn gây ra thiệt hại lớn nhất, đặc biệt là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Bệnh được phát hiện ngày càng nhiều xảy ra quanh năm ở tất cả các lứa tuổi của cá. (Đặng Thị Hoàng Oanh và cs., 2012). Việc sử dụng hoá chất và kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản NTTS làm thay đổi quần thể tự nhiên, gây tổn hại đến môi trường và làm tăng sức đề kháng cũng như độc lực của các vi sinh vật gây bệnh (Gatesoupe và cs., 1999; Purivirojkul và cs., 2007; Skjermo và cs., 1999; Sze, 2000). Chính vì vậy mà việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi để kiểm soát mầm bệnh, tăng sức đề kháng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường ao nuôi ngày càng được xem như là một giải pháp thay thế cho điều trị kháng sinh (Balcazar và cs., 2006; Wang và cs., 1997). Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong NTTS. Những loài vi khuẩn Bacillus được sử dụng như tác nhân sinh học, có thể được xây dựng thành các sản phẩm thương mại hữu ích vì có khả năng tạo bào tử có lợi thế hơn các tế bào thực vật do ổn định trong thời gian dài, có tác động đối kháng trên các mầm bệnh và được tiêu hoá tự nhiên trong động vật (Hong và cs., 2005). Hơn nữa các chủng Bacillus spp. không sử dụng các gen kháng kháng sinh hoặc độc lực từ vi khuẩn Gram âm như Aeromonas spp. (Moriarity, 1999), sản xuất các chất ức chế đối với tác nhân gây bệnh (Wang S. L. và cs., 1997). Vì vậy các loài vi khuẩn Bacillus thường được sử dụng trong việc lựa chọn làm chế phẩm sinh học trong NTTS (Ravi và cs., 2007). Trong báo cáo của Chao và cs. năm 2012 cũng đã chứng minh rằng các chủng Bacillus được phân lập và sàng lọc từ đất hoặc trong ruột của cá da trơn có khả năng đối kháng với Edwardsiella ictalluri và Aeromonas hydrophila, tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính (ESC) và nhiễm trùng do vi khuẩn Aeromonas di động trên cá da trơn. Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật, pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản. Trang 3 Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Sàng lọc vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus)” Mục tiêu: sàng lọc, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có đồng thời hoạt tính hỗ trợ tiêu hóa và kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thậm mủ trên cá tra. Nội dung thực hiện 1. Phân lập Bacillus từ mẫu ruột, bùn ao cá tra. 2. Nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus phân lập được và vi khuẩn Bacillus từ bộ sưu tập phâp lập từ trùn quế với Edwardsiella ictaluri. 3. Sàng lọc các tiêu chí tiềm năng làm probiotic:  Thử khả năng sinh enzym ngoại bào (protease, amylase, lipase, cellulase).  Thử khả năng chịu muối môi trường nuôi và pH môi trường nuôi.  Thử khả năng chịu pH acid dạ dày.  Thử khả năng chịu muối mật. 4. Đánh giá độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên vật chủ. 5. Đánh giá tính an toàn của các chủng Bacillus tiềm năng với vật chủ  Khả năng sinh enzym hemolysin của các chủng tuyển chọn.  Đánh giá độ an toàn của các chủng thử nghiệm. 6. Nghiên cứu khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra bột) ở quy mô phòng thí nghiệm của Bacillus với Edwardsiella ictaluri. 7. Tiến hành thí nghiệm xác định liều gây chết trung bình (LD50) trên cá tra giống. 8. Nghiên cứu khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra giống) ở quy mô phòng thí nghiệm của Bacillus với Edwardsiella ictaluri. 9. Định danh các chủng bằng kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA. Trang 4 HƯƠNG 1. TỔNG QU N TÀI IỆU Trang 5 1.1 T NH H NH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT N 1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản Ngành thủy sản có vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế xã hội Việt Nam. Trong những năm qua sản xuất thủy sản đã đạt được những thành tựu đáng kể. Năm 2011, tổng sản lượng thủy sản đạt trên 5,2 triệu tấn (tăng gấp 5,1 lần so với năm 1990, bình quân tăng 12,02%/năm). Sản lượng khai thác thủy sản đạt trên 2,2 triệu tấn (tăng gấp 3,1 lần so với năm 1990, bình quân tăng 5,83%/năm). (Tổng cục thủy sản, 2012) Sự phát triển nhanh chóng của hoạt động NTTS đã kéo theo tình trạng ô nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh. Trong điều kiện NTTS hiện nay, môi trường ao nuôi rất phú dưỡng do chúng ta đưa vào ao nuôi lượng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có một lượng thức ăn rất nhỏ được đồng hóa thành sinh khối, còn lại không được sử dụng do bị hòa tan vào trong nước hoặc bài tiết ra ngoài môi trường. Lượng thức ăn thừa, chất thải hữu cơ cùng với xác động vật thủy sinh phù du là những yếu tố làm cho ao nuôi nhiễm bẩn. Ngoài ra việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong NTTS gây ra tác hại với môi trường như tồn lưu hóa chất trong môi trường thủy sinh, làm giảm số lượng thủy sinh, làm giảm số lượng vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, làm cho quá trình phân hủy hữu cơ bị đình trệ và hậu quả là môi trường bị phú dưỡng, kích thích sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tăng cơ hội nhiễm bệnhhiện tượng kháng thuốc, dư lượng chất kháng sinh trong sản phẩm thủy sản gây hại cho người tiêu dùng như: tăng mẫn cảm với dư lượng thuốc hoặc xuất hiện vi khuẩn đường ruột kháng lại các chất kháng khuẩn. (Nguyễn Thị Tươi, 2005) 1.1.2 Tình hình nuôi trồng cá tra ĐBSCL có hệ thống sông rạch chằng chịch, là điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp và nuôi trồng, đánh bắt thuỷ sản. Từ năm 1940 nghề nuôi cá nước ngọt bắt đầu phổ biến và phát triển trong đó, cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá Basa (Pangasius bocourti) là loài nuôi trồng thủy sản được nuôi thông dụng nhất đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL (tập trung chủ yếu ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp). (Thuý Huỳnh, 2009) Với sản lượng hàng năm đạt khoảng 1,3 triệu tấn, ngành công nghiệp cá tra ở Việt Nam hiện đã vươn tới 140 thị trường trên toàn cầu với tổng giá trị xuất khẩu đạt hơn 1,4 tỷ USD, đồng thời tạo công ăn việc làm trực tiếp và gián tiếp cho hơn 200.000 lao động và diện tích nuôi trồng khoảng 6.000 ha, chủ yếu trải dài trên các dòng kênh và nhánh sông nước ngọt ở khu vực ĐBSCL (Tổng cục thủy sản, 2012). Trang 6 Tuy nhiên hai năm trở lại đây đã có nhiều dấu hiệu bất ổn xuất hiện trong quá trình nuôi và tiêu thụ cá tra mà dấu hiệu rõ nét nhất là sự sụt giảm diện tích nuôi và tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu. Theo báo cáo của Cục Nuôi trồng Thủy sản Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về tình hình nuôi trồng thủy sản năm 2009 của các tỉnh phía Nam (từ Đà Nẵng đến Kiên Giang) thì: − Diện tích nuôi: trong năm 2009, tổng diện tích nuôi cá tra tính từ Nam Trung bộ trở vào chỉ đạt 6,788 ha (trong đó, riêng miền Tây Nam bộ là 6,756 ha) chỉ đạt 97% so với kế hoạch. − Năng suất: năm 2009 chỉ đạt bình quân 230 tấn/ ha thấp hơn năng suất năm 2008 (260 tấn/ ha). Năng suất cao nhất là tỉnh Tiền Giang (312 tấn/ ha), năng suất nuôi thấp nhất là tỉnh Bến Tre (195 tấn/ ha). − Kim ngạch xuất khẩu: theo Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thủy sản, tổng kim ngạch xuất khẩu cá tra cả nước tính từ đầu năm đến 15/11/2009 đạt gần 1,171 tỷ USD, giảm 10% so với cùng kỳ. Ước tính 1/2 tháng 11 và cả tháng 12 đạt 100 triệu USD, đưa tổng kim ngạch lên gần 1,3 tỷ USD, nhưng cũng vẫn giảm 10% so với cùng kỳ. − Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự bất ổn trên như: chất lượng cá giống, giá giống, thức ăn tăng cao và đặc biệt nguy cơ mất trắng do dịch bệnh, đặc biệt là bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra. Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90% gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi. − Bên cạnh những kết quả đạt được, trong quá trình phát triển, ngành thủy sản đã đương đầu với sự cạnh tranh gay gắt trên thị trường, nguồn lợi thủy sản có dấu hiệu suy thoái, ô nhiễm môi trường, dịch bệnh,… Bệnh trên cá tra được cho là một trong những thách thức quan trọng của ngành nuôi trồng thủy sản. Những bệnh thường gặp nhất như mủ gan, mủ thận mà tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Đã có rất nhiều biện pháp phòng bệnh được đề ra nhưng hiện nay dịch bệnh này vẫn chưa có biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Một trong những hướng có tiềm năng và đang được tập trung nghiên cứu là sử dụng các chủng vi khuẩn kháng lại tác nhân gây bệnh Edwardsiella ictaluri. 1.2 TỔNG QU N VỀ TRA Á BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN Á 1.2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra 1.2.1.1 Lịch sử phát hiện Hiện nay, ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.000 ha. So với năm 2000 diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong