Tài liệu Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH GIẢM CHOLESTEROL Mã số: T2012.22.151 Chủ nhiệm đề tài: ThS. Dương Nhật Linh TP. HCM, 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH GIẢM CHOLESTEROL Mã số: T2012.22.151 Thành viên đề tài: ThS. Dương Nhật Linh ThS. Nguyễn Văn Minh CN. Đan Duy Pháp CN. Lê Thị Anh Thiện CN. Phạm Thị Minh Trang TP. HCM, 11 /2014 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI Chủ nhiệm: Thành viên: ThS. Dương Nhật Linh ThS. Nguyễn Văn Minh Đan Duy Pháp Lê Thị Anh Thiện Phạm Thị Minh Trang BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM __________________ THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol. - Mã số: T2012.22.151 - Chủ nhiệm đề tài: Dương Nhật Linh - Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Trường ĐH. Mở Tp. HCM. - Thời gian thực hiện: 12/2012 - 02/2014 2. Mục tiêu: Sàng lọc được chủng vi khuẩn Lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm. 3. Tính mới và sáng tạo: - Hiệu quả giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn lactic được nghiên cứu cả in vitro và in vivo. Ở Việt Nam, đây là hướng nghiên cứu mới và chưa có bài báo khoa học về thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột được công bố. - Chúng tôi đã sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và hiệu quả giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả của đề tài là tiền đề để nghiên cứu sản xuất probiotic. 4. Kết quả nghiên cứu: - Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện thử nghiệm đồng thời hoạt tính probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm của 39 chủng vi khuẩn lactic và thu được 3 chủng L. plantarum NT1.5, L. Plantarum E16.2, L. paracasei/casei YK1.1 đáp ứng được 2 tiêu chí trên. Cả 3 chủng YK1.1, NT1.5, E16.2 có khả năng giảm cholesterol lần lượt 22,46% (giảm từ 3,65 mmol/L xuống 2,83 mmol/L), 22,96% (3,44 mmol/ L xuống 2,65 mmol/ L) và 20% (3,75 mmol/ L xuống 3,00 mmol/ L) ở 120 ngày thử nghiệm. 5. Sản phẩm: - Chủng vi khuẩn L. plantarum NT1.5, L. plantarum E16.2, L. paracasei/casei YK1.1 vừa có hoạt tính probiotic và khả năng giảm cholesterol in vitro, in vivo. - Đào tạo được 03 cử nhân công nghệ sinh học. o Lê Thị Anh Thiện MSSV: 0853 010 867  Đề tài: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol từ sữa mẹ và phân em bé. o Phạm Trần Phương Dung MSSV: 0853 010 111  Đề tài: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol từ thực phẩm lên men. o Phạm Thị Minh Trang MSSV: 0953 010 758  Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời hoạt tính Probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm”. - Có 02 bài báo khoa học được đăng trên tạp chí chuyên ngành: o Nguyễn Văn Thái, Vương Văn Sơn, Dương Nhật Linh, Trần Cát Đông, 2012, Khảo sát tính khử liên hợp muối mật và khả năng làm giảm cholesterol của một số chủng Lactobacillus, Y học TPHCM, tập 16 (phụ bản 1), pp.254-259. o Dương Nhật Linh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm Thị Minh Trang, Nguyễn Văn Minh, Trần Cát Đông, 2013, Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol. Hội Nghị CNSH Toàn quốc KV Phía nam, Tạp chí sinh học 36 (1se), 47-53. 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: - Viết một số bài báo đăng trên tạp chí về công nghệ sinh học, y dược nhằm thông tin các kết quả nghiên cứu. - Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất chế phẩm về khả năng giảm cholesterol. Cơ quan chủ trì xác nhận KT. HIỆU TRƯỞNG PHÓ HIỆU TRƯỞNG Ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài (Ký, Họ và tên) i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC .......................................................................... 4 1.1.1. Khái niệm ........................................................................................................... 4 1.1.2. Quá trình chuyển hóa và tác dụng của probiotic .................................................. 4 1.1.3. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic ....................................................................... 5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu probiotic trong và ngoài nước ........................................... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ........................................................... 10 1.3. TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL................................................................. 13 1.3.1. Giới thiệu ......................................................................................................... 13 1.3.2. Chức năng ........................................................................................................ 13 1.3.3. Phân loại........................................................................................................... 14 1.3.4. Tổng hợp cholesterol ........................................................................................ 15 1.3.5. Cơ chế điều hòa lượng cholesterol trong máu .................................................... 16 1.3.6. Bài tiết .............................................................................................................. 17 1.3.7. Chuyển hóa bởi vi sinh vật ................................................................................ 18 1.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT ................................................ 18 1.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống ...................................... 18 1.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự ............................................... 19 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................... 23 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 23 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 23 2.2.2. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm ........................................................................ 23 2.2.3. Môi trường – hóa chất ....................................................................................... 24 2.2.4. Thuốc thử - thuốc nhuộm .................................................................................. 24 2.2.5. Dụng cụ ............................................................................................................ 25 2.2.6. Trang thiết bị .................................................................................................... 25 2.3. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM........................................................................................ 26 2.3.1. Tái phân lập ...................................................................................................... 26 2.3.2. Sàng lọc các chủng có khả năng hấp thu cholesterol của tế bào vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy ................................................................................................................ ......................................................................................................................... 27 2.3.3. Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym BSH..................................... 28 2.3.4. Thử khả năng sinh enzym ngoại bào ................................................................. 32 2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 34 2.3.6. Khả năng chịu pH dạ dày .................................................................................. 35 2.3.7. Khả năng chịu mật ............................................................................................ 36 2.3.8. Thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh (MIC) ................................................. 37 2.3.9. Kiểm tra khả năng huyết giải ............................................................................ 38 2.3.10. Định danh bằng phương pháp truyền thống(Martin D. & cs., 2006).............. 39 2.3.11. Định danh bằng kỹ thuật giải trình tự ............................................................ 41 2.3.12. Xây dựng mô hình gây tăng cholesterol trên chuột ....................................... 45 2.3.13. Khảo sát khả năng giảm cholesterol .............................................................. 47 ii 2.3.14. Khảo sát một số hoạt tính probiotic trên mô hình chuột ................................. 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 50 3.1. KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP ............................................................................... 51 3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ................................................................................................... 51 3.2.1. Xây dựng đồ thị đường chuẩn ........................................................................... 51 3.2.2. Khả năng giảm cholesterol trong môi trường MRS ........................................... 52 3.3. ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME BSH ............................................. 58 3.4. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME BSH ........................................................ 61 3.4.1. Xây dựng đồ thị chuẩn ...................................................................................... 61 3.4.2. Kết quả xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng enzyme BSH của các chủng khảo sát ........................................................................................................................ 64 3.5. KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO ....................................................... 68 3.6. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ........................................................................ 71 3.7. KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI MẬT ....................................................................... 75 3.8. KHẢ NĂNG CHỊU PH DẠ DÀY ....................................................................... 78 3.9. KIỂM TRA KHẢ NĂNG HUYẾT GIẢI ........................................................... 80 3.10. THỬ NGHIỆM NHẠY/ KHÁNG KHÁNG SINH ............................................ 81 3.11. TÓM TẮT KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA 9 CHỦNG THỬ NGHIỆM ............ 84 3.12. ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG ............................ 87 3.12.1. Kết quả phân nhóm vi khuẩn lên men đồng hình – dị hình ............................ 87 3.12.2. Định danh bằng phương pháp truyền thống ................................................... 88 3.13. ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ...................... 89 3.13.1. Tách chiết, PCR và tinh sạch sản phẩm 16S rDNA ....................................... 89 3.13.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự ............................................................................ 90 3.13.3. So sánh trình tự trên cơ sở dữ liệu Genbank .................................................. 91 3.14. KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH TĂNG CHOLESTEROL TRÊN CHUỘT 91 3.15. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM GIẢM CHOLESTEROL TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT .......................................................................................................................... 94 3.15.1. Kết quả gây tăng cholesterol bằng chế độ ăn ................................................. 94 3.15.2. Kết quả thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm .. ..................................................................................................................... 95 3.16. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT ............................................................................................................... 99 3.16.1. Trọng lượng của chuột trong thời gian thí nghiệm ......................................... 99 3.16.2. Kết quả đo sức khỏe tổng quát .................................................................... 101 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 102 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 103 4.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 104 iii DANH MỤC VIẾT TẮT MT Môi trường KL Khuẩn lạc v/p Vòng/ phút TB Tế bào OD Optical Density LAB Lactic acid bacteria HHD Homofermentative-Heterofermentative Differrential medium WHO World Health Organization GRAS Generally recognized as safe BSH Bile salt hydrolase LDL Low Density Lipoprotein HDL High Density Lipoprotein nm nanomet 16S rDNA Trình tự DNA mã hóa cho RNA ribosome tiểu phần 16S ANOVA One-way analysis of variance BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp base pair iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic ..................................................... 11 Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ cholesterol và giá trị OD550 ........................................................................................ 27 Bảng 2.2. Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ taurine và giá trị OD570 .......................................................................................................... 29 Bảng 2.3. Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Albumin và giá trị OD595 .......................................................................................................... 30 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR ......................................................................... 43 Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR ....................................................................... 43 Bảng 2.6 . Dấu hiệu sức khỏe của chuột ..................................................................... 46 Bảng 3.1 Tương quan giữa nồng độ cholesterol (µg/ mL)và giá trị OD 550 .................. 51 Bảng 3.2 Khả năng giảm cholesterol sau 24 giờ và 48 giờ ......................................... 53 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzym BSH của các chủng vi khuẩn .......... 59 Bảng 3.4 Giá trị tương quan giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD 570 ................... 61 Bảng 3.5 Mối quan hệ giữa nồng độ BSA (µg/ 0,2 mL) và giá trị OD595 .................... 62 Bảng 3.6 Kết quả hoạt đô chung (U/ mL) và hoạt độ riêng (U/ mg) của các chủng vi khuẩn ......................................................................................................................... 64 Bảng 3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào .................................................................. 68 Bảng 3.8 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh (mm) ............................................. 71 Bảng 3.9 Kết quả thử khả năng chịu muối mật 0,3% .................................................. 76 Bảng 3.10 Tỉ lệ sống của các chủng thử nghiệm ở pH 2 trong thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ (%).................................................................................................................... 78 Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm khả năng huyết giải ................................................... 80 Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm MIC (µg/mL) ............................................................ 82 Bảng 3.13 Bảng tóm tắt kết quả sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và khả năng giảm cholesterol của 9 chủng vi khuẩn....................................................................... 85 Bảng 3.14 Kết quả phân nhóm ................................................................................... 87 Bảng 3.15. Kết quả định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình không bắt buộc group B ...................................................................................................................... 88 Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế ................................................ 89 v Bảng 3.17 Kết quả hiệu chỉnh .................................................................................... 90 Bảng 3.18 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA đã hiệu chỉnh với các trình tự trên GenBank.................................................................................................................... 91 Bảng 3.19 Kết quả khả năng tăng cholesterol giữa các nghiệm thức .......................... 92 Bảng 3.20 Tính ổn định khả năng tăng cholesterol của các nghiệm thức theo thời gian trình bày .................................................................................................................... 92 Bảng 3.21 Bảng kết quả đo trọng lượng chuột trong 21 ngày ..................................... 93 Bảng 3.22 Chỉ số cholesterol sau khi gây tăng bằng chế độ ăn ................................... 94 Bảng 3.23 Kết quả giảm cholesterol của các chủng thử nghiệm sau 120 ngày ............ 95 Bảng 3.24 Trọng lượng của chuột trong thời gian gây tăng cholesterol ...................... 99 Bảng 3.25 Trọng lượng của chuột trong thời gian thử nghiệm khả năng giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn .......................................................................... 100 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ cholesterol (µg/ mL) và giá trị OD550 ......................................................................................................................... 52 Đồ thị 3.2 Khả năng giảm cholesterol trong môi trường của các chủng thử nghiệm ... 57 Đồ thị 3.3 Khả năng giảm cholesterol trong môi trường của các chủng thử nghiệm ... 57 Đồ thị 3.4 Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD 570 62 Đồ thị 3.5 Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ BSA (µg/ 0,2 mL) và giá trị OD595 ......................................................................................................................... 63 Đồ thị 3.6 Biểu diễn hoạt độ chung (U/ mL) và hoạt độ riêng (U/ mg) của các chủng vi khuẩn ......................................................................................................................... 67 Đồ thị 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn ............. 77 Đồ thị 3.8 Tỉ lệ sống của các chủng thử nghiệm theo thời gian 1, 2 và 3 giờ ở pH 2 .. 79 Đồ thị 3.9 Kết quả giảm cholesterol của các chủng thử nghiệm sau 120 ngày ............ 96 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.2. Streptococcus ............................................................................................ 12 Hình 1.3. Lactobacillus .............................................................................................. 12 Hình 1.4. Công thức cấu tạo cholesterol ..................................................................... 13 Hình 1.5. Cholesterol hình thành các mảng bám trong mạch máu .............................. 14 Hình 1.6 Cơ chế tổng hợp cholesterol ........................................................................ 16 Hình 2.1 Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch đuôi (A), lô chuột thí nghiệm (B) .......................... 47 Hình 2.2 Thao tác cho chuột uống.............................................................................. 48 Hình 3.1. Vi khuẩn trên môi trường MRSA ............................................................... 51 Hình 3.2. Khả năng sinh enzym BSH ......................................................................... 61 Hình 3.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................................... 70 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S. typhi, L. monocytogenes................. 75 Hình 3.5. Kết quả thử tiêu huyết trên thạch máu ........................................................ 81 Hình 3.6. Thử nghiệm MIC của chủng E16.2 ............................................................. 84 Hình 3.5 Hình lên men trên môi trường HHD ............................................................ 87 Hình 3.7. Kết quả điện di sau phản ứng PCR ............................................................. 90 Trang 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến tử vong và nó liên quan chặt chẽ với việc tăng cholesterol. Do đó, giảm cholesterol huyết thanh là điều rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lee và cs, 1992). Do đó việc nghiên cứu các phương pháp làm giảm cholesterol trong máu là vấn đề mà các nhà khoa học quan tâm và theo các nghiên cứu cho thấy rằng có nhiều phương pháp làm giảm cholesterol trong máu. Sử dụng thuốc giúp làm giảm lượng choleterol như: statins, các loại thuốc ức chế, fibrates, acid bile resin, niacin… tuy nhiên khi sử dụng các loại thuốc này có thể gây ra một số tác dụng phụ. Các nghiên cứu hiện nay chú trọng đến các phương pháp không sử dụng thuốc: các nghiên cứu tại Mỹ, Nhật và Ấn Độ đã công bố Gamma Oryzanol (GO), vi chất tự nhiên trong lớp màng gạo có khả năng giúp giảm cholesterol thừa bằng cách ngăn chặn ruột hấp thu cholesterol từ thức ăn và do gan tiết ra, sau đó đào thải chúng ra khỏi cơ thể. Đồng thời có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn cũng có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu (Foo, 2003). Điển hình là các chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm giảm lượng cholesterol nhờ khả năng sinh enzyme bile salt hydrolase và cơ chế khử liên hợp muối mật. Trên thị trường đã có nhiều loại chế phẩm thực phẩm chức năng giảm cholesterol, tuy nhiên tác dụng không rõ ràng, giá thành rất cao, do đó người dùng khó tiếp cận. Bên cạnh đó, cũng có nhiều dược phẩm được chứng minh hiệu quả tốt nhưng chỉ dùng để điều trị, ít khi sử dụng để dự phòng nguy cơ vì không sử dụng lâu dài được. Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy một số vi khuẩn làm probiotic, trong đó có Lactobacillus có khả năng làm giảm cholesterol. Các chế phẩm này an toàn, có thể sử dụng lâu dài để làm giảm nguy cơ tăng cholesterol. Do đó, đây là vấn đề đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu nhưng ở Việt Nam, hiện chưa có nhóm tác giả nào công bố về vấn đề này, trong khi sản phẩm probiotic có tác dụng làm giảm cholesterol là rất cần thiết. Bên cạnh đó chúng tôi được thừa kế từ bộ sưu tập chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic từ nghiên cứu trước. Từ đó, tái phân lập, xác định khả năng làm giảm Trang 2 cholesterol qua cơ chế hấp thu và khử liên hợp muối mật, tiến hành đánh giá hiệu quả làm giảm cholesterol và các hoạt tính probiotic trên chuột và định danh đến loài bằng phương pháp giải trình tự chủng vi khuẩn cho hoạt tính probiotic và giảm cholesterol mạnh nhất. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH GIẢM CHOLESTEROL” Nội dung thực hiện đề tài bao gồm: - Tái phân lập và sàng lọc các chủng đồng thời có hoạt tính probiotic và giảm cholesterol. - Định danh các chủng vi khuẩn theo 2 phương pháp: truyền thống và sinh học phân tử. - Xây dựng mô hình chuột gây tăng cholesterol. - Thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm. Trang 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Khái niệm Năm 1965, Lilly và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật mà có khả năng kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác (Lilly và Stillwell, 1965). Năm 1974, Parker sử dụng thuật ngữ “probiotic” để định nghĩa “sinh vật và các chất góp phần cân bằng vi khuẩn đường ruột”. Năm 1991, probiotic đã được định nghĩa là vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn có lợi cho động vật bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi khuẩn của nó (Fuler và cs., 1991). Cho tới năm 2001, theo định nghĩa của FAO/WHO, “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể được kiểm soát, với số lượng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả cho vật chủ”. Đây là định nghĩa tổng quát nhất (FAO/WHO, 2001). Probiotic có lợi khi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bị biến đổi bằng cách tái thiết lập hệ cân bằng vi sinh vật đường ruột sau khi bị rối loạn do tiêu chảy, kháng sinh và bằng tia X, tia beta; ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn có hại, thúc đẩy tiêu hóa tốt, tăng cường chức năng miễn dịch và tăng khả năng chống nhiễm trùng (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Ngoài ra, các lợi ích sinh lý khác bao gồm loại bỏ các chất gây ung thư, giảm cholesterol (Begley và cs., 2006; Mai Đàm Linh và cs., 2008), kích thích miễn dịch và giảm khả năng dị ứng, tổng hợp và tăng cường khả dụng sinh học của các chất dinh dưỡng (Christine và cs., 2009). 1.1.2. Quá trình chuyển hóa và tác dụng của probiotic 1.1.2.1. Hệ vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria_LAB) là một nhóm vi khuẩn chính bên trong ống tiêu hóa của con người có tác dụng tăng cường sức khỏe và quá trình lên men sản xuất acid lactic. Đa phần chúng được coi là an toàn (GRAS_generally regarded as safe) (Christine và cs., 2010). Một số vị trí trong cơ thể tìm thấy sự hiện diện của vi khuẩn lactic như là miệng, tai, mũi, hệ hô hấp và đường ruột cùng với ống niệu sinh dục. Hệ vi sinh vật này tăng cường tiết các chất có lợi cho cơ thể như vitamin Trang 5 K, B12 và bacteriocin. Vì vậy, chúng góp phần bình ổn hệ vi sinh những khu vực này và chống các bệnh truyền nhiễm. Những rối loạn của hệ vi khuẩn này do nhiều nguyên nhân như stress, sử dụng kháng sinh không kiểm soát và những tác động cơ học quá mức vào các cơ quan hở sẽ dẫn đến những bệnh lý viêm nhiễm dễ dàng hơn. Do đó, chế độ ăn có bổ sung các vi khuẩn sống có lợi này sẽ nâng cao sức khỏe và giảm nhiều loại bệnh nguy hiểm. Vi khuẩn lactobacilli đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao miễn dịch, duy trì sự cân bằng vi khuẩn ruột và tránh nhiễm trùng tiêu hóa. Việc điều tiết miễn dịch là yếu tố quan trọng góp phần kháng viêm, kháng nhiễm và hạn chế ung thư (Paul và Gwendolyn, 2011). 1.1.2.2. Cơ chế tác động của probiotic Các cơ chế tác động của probiotic lên cơ thể con người như: tạo cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bằng khả năng ức chế, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong ruột, làm thay đổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi. Khả năng này được các nhà khoa học giải thích dựa trên khả năng tranh giành vị trí bám dính trên niêm mạc, tranh giành thức ăn với sinh vật khác và việc tạo ra môi trường acid, các chất kháng khuẩn, ức chế các vi sinh vật khác. Chúng còn tăng cường khả năng tiêu hóa sữa do tạo men lactase nên cải thiện dung nạp lactose, tăng cường khả năng dung nạp sữa (De Roos, 2000 và Herich, 2002). Ngoài những cơ chế trên, nhiều nghiên cứu đã và đang khám phá ra những hoạt động tiềm năng có lợi cho sức khoẻ của nhóm vi sinh vật này làm tăng cường khả năng miễn dịch do ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh, sản xuất kháng thể tại chỗ do kích thích làm tăng số tế bào sản xuất IgA. Những vi khuẩn này có thể sản sinh ra các hợp chất kháng khuẩn, biến đổi các độc tố hoặc receptor độc tố, chống sự hình thành ung thư do khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn tạo amin trong ruột và hạn chế sự hình thành những sản phẩm đồng hóa gây ung thư. Cùng với những tác dụng đáng quan tâm, làm giảm cholesterol, tăng và cân bằng oestrogen, phòng chống bệnh loãng xương, tránh những bệnh viêm nhiễm (Gill, 2008). 1.1.3. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic Nói chung các vi sinh vật được chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn về an toàn, chức năng và tính kỹ thuật. (Nguyễn Văn Thanh và Trần Cát Đông, 2009) Trang 6 1.1.3.1. Tính kỹ thuật Trước khi một probiotic có thể mang lại sức khỏe cho con người chúng phải đáp ứng được các tiêu chí sau:  Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp về công nghệ để có thể đưa vào sản xuất.  Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm.  Không gây các mùi khó chịu cho sản phẩm.  Có khả năng sống sót khi đi qua đường tiêu hóa (dạ dày - ruột non) nếu được sử dụng qua đường này.  Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng.  Có khả năng thực hiện chức năng trong môi trường nơi chúng được định hướng. 1.1.3.2. Về an toàn Những tiêu chuẩn an toàn về probiotic gần đây được đề cập rất nhiều. Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:  Có định danh chính xác.  Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người.  Không có khả năng gây bệnh.  Đặc điểm di truyền ổn định.  Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được. Nói chung các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally recognized as safe). 1.1.3.3. Về chức năng Những yêu cầu về chức năng của probiotic cần được chứng minh bằng các phương pháp thử nghiệm trên in vitro, và kết quả của những nghiên cứu này phải thể hiện trong những nghiên cứu có kiểm soát trên người. Khi lựa chọn một chủng probiotic thì các yếu tố chức năng cần được quan tâm là:  Dung nạp với acid và dịch vị của người.  Dung nạp được với muối mật. Trang 7  Có khả năng bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột và và tồn tại lâu dài trong đường tiêu hóa.  Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm.  Cạnh tranh được với hệ vi sinh vật tự nhiên.  Sản xuất các chất kháng sinh vi sinh vật (ví dụ: bacteriocin, hydrogen peoxide, acid hữu cơ).  Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu probiotic trong và ngoài nước Sản phẩm probiotic lactic được ghi nhận đầu tiên là sữa lên men dùng cho người. Metchnikoff đã phát hiện ra và sử dụng chủng Lactobacillus bulgaicus để lên men các sản phẩm từ sữa, nhằm kéo dài thời gian sử dụng chúng. Sau đó, các sản phẩm probiotic trở nên phổ biến trong khẩu phần của động vật. Vai trò của sữa lên men trong khẩu phần dinh dưỡng của người đã được biết từ rất lâu. Nhưng các nhà khoa học quan tâm nhiều đến lĩnh vực này sau khi quyển sách “The Prolongtion of life” của Ellie Metchnikoff xuất bản vào năm 1908. Trong đó, ông đề nghị mọi người nên dùng nhiều sữa lên men chứa Lactobacilli để kéo dài tuổi thọ. (Metchnikoff, 2003) Vấn đề này được tiếp tục quan tâm cho đến nay khi những tiến bộ về kỹ thuật cho phép phân lập và nuôi cấy vi sinh vật giúp cho việc xác định những đặc tính trị liệu của chúng. Những vi sinh vật này không những mang lại gía trị dinh dưỡng mà còn nhiều lợi ích khác. Những năm gần đây, việc sử dụng vi sinh vật probiotic và các acid hữu cơ như chất thay thế kháng sinh trong thực phẩm đang rất được quan tâm. Sự thích nghi tự nhiên của nhiều vi khuẩn lactic đối với môi trường ruột và những chất kháng khuẩn do chúng tạo ra như acid hữu cơ và bacteriocin đã cho vi khuẩn lactic một thuận lợi cạnh tranh so với những vi sinh vật khác khi được dùng làm probiotic. Có nhiều nghiên cứu về probiotic, tuy nhiên chưa định hướng dưới dạng phát triển sản phẩm thực phẩm hay dược phẩm để bổ trợ cho hệ tiêu hoá, vì vậy chưa có các nghiên cứu cụ thể về hệ vi sinh vật probiotic ứng dụng trong hai lĩnh vực này. 1.1.4.1. Các nghiên cứu trong nước Trang 8 Các nghiên cứu gần đây có thể kể đến: - Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh (2011) đã phân lập và xác định 15 chủng Lactobacillus, qua thí nghiệm in vitro 12 chủng có đặc tính probiotic cho con người và được định danh bằng phương pháp phân tích trình tự rDNA 16S. Trong đó, có 11 chủng có khả năng khử mức cholesterol huyết thanh đáng kể 10% - 33,34% làm tiên đề cho nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm probiotic có tác dụng giảm cholesterol huyết thanh (Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh, 2011). - Nghiên cứu của Nguyễn Minh Thái và cộng sự (2012) về khảo sát tính khử liên hợp muối mật và khả năng làm giảm cholesterol của một số chủng Lactobacillus. Định lượng được phần cholesterol kết tủa cùng với acid cholic ở pH thấp. Từ đó cho thấy khả năng giảm cholesterol qua con đường tủa với acid cholic không đáng kể (7-20%). Khẳng định được cơ chế giảm cholesterol do hấp thu hoặc liên kết trên màng tế bào vi khuẩn đóng góp phần lớn trong khả năng làm giảm cholesterol của các chủng thử nghiệm (80-93%). Trong đó có chủng Lactobacilllus plantarum (DC 3.9) có hoạt độ riêng BSH cao nhất, khả năng giảm cholesterol cao nhất trong môi trường MRS và dịch ruột nhân tạo (Nguyễn Văn Thái và cs, 2012). - Do đề tài nghiên cứu khả năng giảm cholesterol của chủng vi khuẩn lactic trên mô hình động vật đang là hướng mới nên hiện chưa có bài báo mới nào công bố. 1.1.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới đang tập trung nghiên cứu về những ảnh hưởng tốt trên sức khoẻ của LAB nhằm mục đích xác định một dạng nuôi cấy probiotic sử dụng cho sản xuất. Bên cạnh đó một số nghiên cứu chỉ ra rằng cholesterol trong huyết thanh có liên quan với nguy cơ bệnh tim mạch vành. Một lượng nhỏ cholesterol giảm trong huyết thanh trên 1% cũng dẫn đến hiện tượng giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành từ 23% (Liong và cs.,2006). Do vậy, nghiên cứu sản xuất probiotic có khả năng giảm cholesterol trong máu được khá nhiều các nhà khoa học quan tâm. - Trong nghiên cứu của Nelson và cs. (1985), các tác giả đã nghiên cứu về sự phát triển của các chủng Lactobacillus acidophilus được phân lập từ phân lợn trong môi