Tài liệu Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp. và lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc aspergillus spp. sinh aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện MSSV: 1515100007 : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực PhẩmMôi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác với bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình. TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Ngô Vũ Phượng. i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực hiện, hoàn thành đồ án này. Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe. TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Ngô Vũ Phượng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................... vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................... ix MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2 CHƢƠNG I: TÔNG QUAN ................................................................... 4 1.1. Tổng quan về nấm: .................................................................................. 4 1.1.1. Giới thiệu chung .................................................................................... 4 1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra .............................................................................4 1.1.3. Tác hại của nấm .................................................................................... 5 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật......................................5 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây cho thực vật ...................................................... 6 1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm ...........................................6 1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................ 7 1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học ................................................................ 10 1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học .............................................10 1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học ..................................................... 13 1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật: .................................................... 13 1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: ................................................... 17 a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. ............................. 17 b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp...................... 19 1.3. Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: .................. 21 1.3.1. Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn).................... 21 1.3.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) ..................... 23 1.3.3. Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): ...................................25 iii Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 26 2.1. Địa điểm nghiên cứu: ................................................................................ 26 2.2. Thời gian nghiên cứu: ............................................................................... 26 2.3. Vật liệu nghiên cứu: .................................................................................. 26 2.3.1. Giống vi sinh vật: .................................................................................. 26 2.3.1. Hóa chất và môi trường sử dụng ........................................................... 26 2.3.1.1. Hóa chất: ............................................................................................. 26 2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy:...........................................................................26 2.4. Thiết bị và dụng cụ:................................................................................... 27 2.4.1. Thiết bị: ..................................................................................................27 2.4.2. Dụng cụ: .................................................................................................28 2.5. Phương pháp luận:.................................................................................... 28 2.6. Phương pháp nghiên cứu: .........................................................................29 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu.................................................................................... 29 2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: .................................................. 30 2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .......................................................................................................................... 30 2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: .......................................................................................................................... 35 2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: . .......................................................................................................................... 39 2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn .................................................................................................43 2.6.6.1. Nhuộm gram........................................................................................ 43 2.6.6.2. Nhuộm bào tử ...................................................................................... 44 2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: ............................................................... 44 iv Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................... 45 3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn ..................................................................................................................... 45 3.1.1. Nhuộm Gram:.................................................................................... 45 3.1.2. Nhuộm bào tử: ................................................................................... 46 3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:............................................................. 47 3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: ............................................... 48 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc: .......................................................................................................................... 50 3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc: .................................................................................................................. 66 3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc .......................................................................................................................... 81 3.6. So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) .................................................... 90 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 96 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactobacillus spp NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth MT Môi trường PDA Potato dextrose agar VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống .......................................................................................................................... 9 Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) .............................................................................. 18 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. ............................. 45 Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. ................. 47 Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn........... .......................................................................................................................... 53 Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn .... .......................................................................................................................... 54 Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn .. .......................................................................................................................... 62 Bảng 3.6. So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn ............................................................................................................... 63 Bảng 3.7. Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ........... .......................................................................................................................... 68 Bảng 3.8. So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán .......................................................................................................................... 69 Bảng 3.9. Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán .... .......................................................................................................................... 76 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ..................................................................................................................... 77 Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp .............. .......................................................................................................................... 84 Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp ......................... 85 Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ....... .......................................................................................................................... 89 Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ............... 90 Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD .................................................................................... 91 Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD .............................................................. 92 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl ....................................................... 10 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb .................................................... 11 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................11 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones ......................................................... 14 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines ........................................................ 15 Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) ..........................................20 Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn................................................................................ 21 Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) ....................... .......................................................................................................................... 22 Hình 1.9. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ................................................................................ 23 Hình 1.10. Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp. với các loại nấm (trích từ Kumar và các cộng sự,2009). ............................................................. 24 Hình 1.11. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa .......................................................................................................25 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối với nấm mốc .................................................................................... 29 Hình 2.2. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường ................................................... 31 ix Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn ................................................................................................................ 35 Hình 2.4. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ...........................................36 HÌnh 2.5. Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán . .......................................................................................................................... 37 Hình 2.6. Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ........................................................................................................38 Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch ............................................... 40 Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp ............... 45 HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn ................................................... 46 Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn ................................................... 47 Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA ..................... 48 Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến .......49 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm ...................................................................................................55 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ đất .............................................................................................................. 56 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải ......................................................................................................57 Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem .........................................................................................................63 x Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử cơm mẻ ...................................................................................................64 Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm ............................................................................................... 70 Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân lập tử đất ...........................................................................................................71 Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải ......................................................................................................72 Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem ................................................................................................ 78 Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử cơm mẻ .......................................................................................... 79 xi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề: Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc. Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin, tricothecenes, zearalenone…. Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng cao sẽ gây chết người. Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật. Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nhưng việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm. Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau. Từ đó, em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm của trường .Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phƣơng pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”. 1 2. Tình hình nghiên cứu: Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.  Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản” (Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….  Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer,2001) . 3. Mục đích nghiên cứu: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường. 4. Mục tiêu nghiên cứu: Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu:  Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp. và 10 chủng Lactobacillus spp. đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. tiềm năng sinh aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method).  Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar Plug Diffusion Method). 2  Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ .(Overlay Method).  Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm. 6. Phƣơng pháp nghiên cứu: a. Phƣơng pháp luận: Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt giống cây trồng. b. Phƣơng pháp xử lí số liệu:  Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.  Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu. 7. Kết quả đạt đƣợc từ đề tài:  Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp. có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.  Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line Culture Method).  Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug Diffusion Method).  Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).  Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí nghiệm. 3 8. Kết cấu đồ án:  Mở đầu  Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu.  Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án.  Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu được  Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài. 4 Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm: 1.1.1. Giới thiệu chung về nấm:  Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier Antonio Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (17941874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao đổi chất  Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi:  Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.  Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử). 1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra:  Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo 5 ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, gia cầm và con người.  Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng bao gồm:  Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2), Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic.  Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin….  Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin.  Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl Ether Alternarion.  Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.  Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra, thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu dài sẽ gây ra bệnh ung thư.  Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết ra. 6 1.1.3. Tác hại của nấm mốc: 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:  Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium..., chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma... Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong.  Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystic. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,... cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii. 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:  Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,... 1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:  Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, 7 Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,…  Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai. 1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm: Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực phẩm và các vật liệu khác. 1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:  Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil, …. 8