Mô tả:
Định nghĩa thuật ngữ “selection” và “screening” trong phân tích tạo dòng gen.
-Các kỹ thuật chọn lọc các sản phẩm tạo dòng mang DNA mong muốn.
-Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu trong các kỹ thuật sàng lọc.
-Chọn lọc dựa vào lai acid nucleic.
-Sử dụng PCR trong các phương pháp chọn lọc.Sàng lọc theo cơ chế kháng thể -kháng nguyên (protein).
•Phân tích các đoạn DNA được tạo dòng dựa vào các phương pháp lai với mRNA.
•Kỹ thuật thẩm thấu -Southern, Northern, and Western blots.
•Giải trình tự DNA.
ĐỀ TÀI:
CHỌN LỌC VÀ PHÂN TÍCH GEN
TÁI TỔ HỢP
GVHD: Ths. Trần Huỳnh Bảo Quyên
TS. Trần Hoàng Dũng
TÓM TẮT CHƯƠNG
- Định nghĩa thuật ngữ “selection” và
“screening” trong phân tích tạo dòng gen.
- Các kỹ thuật chọn lọc các sản phẩm tạo
dòng mang DNA mong muốn.
- Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu
trong các kỹ thuật sàng lọc.
- Chọn lọc dựa vào lai acid nucleic.
- Sử dụng PCR trong các phương pháp
chọn lọc.
TÓM TẮT CHƯƠNG
• Sàng lọc theo cơ chế kháng thể - kháng
nguyên (protein).
• Phân tích các đoạn DNA được tạo dòng
dựa vào các phương pháp lai với mRNA.
• Kỹ thuật thẩm thấu - Southern, Northern,
and Western blots.
• Giải trình tự DNA.
Giới thiệu
• Sự thành công trong bất kì thí nghiệm tạo
dòng nào đều phụ thuộc vào việc nhận
dạng được trình tự gen mong muốn trong
số nhiều sản phẩm tái tổ hợp khác.
• Chương này giới thiệu một số phương
pháp và kỹ thuật được sử dụng để phát
hiện các đoạn gen được tạo dòng.
Giới thiệu
• Vd: sử dụng một vài loại cơ chế chọn lọc
(khả năng kháng kháng sinh hay khả
năng tạo β-galactosidase) hay sàng lọc
trong một nhóm quần thể đã được tạo
dòng bằng các mẫu dò đặc hiệu.
Giới thiệu
• “Selection” (chọn lọc) là gì?
- Là tạo loại áp lực nào đó ( vd: sự có mặt
của kháng sinh) lên quá trình phát triển
của tế bào chủ mang DNA tái tổ hợp.
- Tế bào sẽ tồn tại nhờ vào các đặc tính
mong muốn khi tạo dòng.
Giới thiệu
• “Screening” (sàng lọc)?
- Là một qui trình mà trong đó một quần
thể tế bào độc lập được phân tích để nhận
biết được trình tự mong muốn.
- Bởi vì chỉ một phần nhỏ trong quần thể tế
bào được phân tích mang trình tự DNA
mong muốn nên đòi hỏi các phương pháp
này phải thật chính xác và đặc hiệu.
8.1. Chọn lọc gen và các phương pháp
sàng lọc.
8.1.1. Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu.
Nguyên tắc:
• Cơ chất: hợp chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl-D-galactopyranoside). Đặc tính:
không màu và là cơ chất của β-galactosidase
• Chất cảm ứng: IPTG (iso-propylthiogalactoside) là một chất tương tự lactose.
8.1.1. Sử dụng cơ chất có khả năng tạo
màu.
• Ưu điểm của IPTG: đóng vai trò là chất cảm
ứng chứ không phải là cơ chất của βgalactosidase.
• Khi X-gal bị phân cắt sẽ tạo ra một sản phẩm
có màu xanh từ đó sẽ dễ dàng biết được sự
biểu hiện của gen lacZ (β-galactosidase).
8.1.1 Sử dụng hợp chất X-gal
• Hình 8.1
8.1.1 Sử dụng hợp chất X-gal
• Kết quả
8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất
hoạt gen.
• Một trình tự DNA khi gắn xen vào vị trí một
gen thì gen sẽ bị bất hoạt.
• Phương pháp này gồm:
- Khả năng kháng kháng sinh: khi mà các đoạn
DNA được đưa vào một vùng giới hạn nằm
trong một gen kháng kháng sinh.
Vd: đưa DNA vào vùng PstI của pBR322 (nằm
trong gen Ap) làm gián đoạn trình tự mã hóa
của gen và làm nó không biểu hiện.
8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt
gen.
Do đó, trên môi trường chứa ampicillin, tế bào
chủ mang sản phẩm tái tổ hợp sẽ không phát
triển.
- Hệ thống X-gal: chèn đoạn DNA vào gen chức
năng β-galactosidase. Do đó, các tế bào mang
gen tái tố hợp sẽ không biểu hiện tính trạng tạo
β-galactosidase. Như vậy các khuẩn lạc sẽ
không màu.
8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt
gen.
- Hình thái của các plague (một dạng khuẩn lạc
của virus): phương pháp sàng lọc này dùng để
nhận dạng các vector λ như λgt10, mang gen
cI . Gen này mã hóa cho chất kìm hãm cI,
thành phần chính của lysogen.
Các plague mang gen cI sẽ có vẫn đục nhẹ vì
một số tế bào sống sót có thể hình thành được
lysogen.
8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt
gen.
• Nếu gen cI bị bất hoạt thì các plague sẽ không
có vẫn đục và sẽ khó có thể phân biệt với các
mẫu đối chứng.
8.1.3.
• Yêu cầu của phương pháp:
- Các đột biến trong quá trình chọn lọc phải xuất
hiện.
- Môi trường chọn lọc thích hợp.
• Quá trình chọn lọc sử dụng với tế bào thực vật
bậc cao và động vật.
8.1.4. Các phương pháp chọn lọc khác.
• Các phương pháp này dựa trên sự kết hợp giữa
tế bào chủ và vector đặc hiệu để co thể khai
thác được các đặc tính của gen.
Vd: phương pháp chọn lọc Spi, vector EMBL4.
8.2. Sàng lọc sử dụng lai acid nucleic
8.2.1 Mẫu dò DNA:
• Nguồn DNA tái tổ hợp thường được tạo thành
từ việc gắn giữa những đoạn DNA có nguồn
gốc khác nhau vào trong vector tách dòng.
• Nguồn DNA tái tổ hợp phụ thụộc vào mức độ
tương đồng giữa các trình tự lai.
• Mục đích sử dụng cho việc tạo ra mẫu dò từ
nguồn DNA.
8.2.1 Mẫu dò AND
• Có 3 loại mẫu dò DNA chính là: cDNA ,
DNA, Oligonucleotic và ARN.
- Xem thêm -