XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO
(Camellia tamdaoensis): LOÀI CÂY ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM
Tạp chí Nông nghiệp và PTNT (2015), 5:123-130
XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO
(Camellia tamdaoensis): LOÀI CÂY ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM
Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp –
Trường Đại học Lâm nghiệp
TÓM TẮT
Trên cơ sở các thông tin của gen matK thuộc loài Trà vàng pêtêlô đã công bố (Mã số KJ806276.1), một cặp
mồi đặc hiệu được thiết kế để dựa trên khuôn ADN tổng số của 5 mẫu cây Trà hoa vàng Tam Đảo (TĐ1,TĐ2, TĐ3,
TĐ4 và TĐ5) và 5 mẫu Trà vàng lá dày (LD1, LD2, LD3, LD4 và LD5). Kết quả PCR đã chỉ ra, tất cả các băng
ADN đã được nhân lên từ các mẫu thí nghiệm có cùng một kính thước khoảng 950bp, tương tự với kính thước lý
thuyết của đoạn gen matK ở loài Trà vàng pêtêlô. So sánh trình tự nucleotide của các mẫu sản phẩm PCR cho thấy
không có sự khác biệt ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Kết quả so sánh cho thấy trình tự nucleotide
của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng tam đảo so với ở cây Trà vàng lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng
G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613; so sánh trình
tự nucleotide của gen matK ở Trà vàng lá dày so với trà vàng petêlô thì có 2 nucleotide sai khác là thay G bằng A ở
vị trí 508 và thay C bằng A ở vị trí 613. Trình nucleotide của đoạn gen matK xác định được từ cây Trà hoa vàng
tam đảo và Trà vàng lá dày đã được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số KP241692 và KP241693.
Trình tự này có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng của Việt Nam.
Từ khóa: gen matK, giám định loài, mã vạch ADN, trà hoa vàng, tam đảo
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trà hoa vàng là chi thực vật rất đa dạng về loài, theo thống kê trên thế giới có khoảng 300 loài và hàng chục
biến chủng khác nhau. Từ những năm 60 của thế kỷ 20, lần đầu tiên trà hoa vàng đã được phát hiện ở Quảng Tây,
Trung Quốc và từ đó Trà hoa vàng được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm vì nó có một số công dụng đặc biệt.
Phần lớn các loài trà hoa vàng phân bố ở Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc và Việt Nam (Ninh et al, 2007).
Các nhà thực vật xem các loài trà hoa vàng là nguồn gen quý hiếm cần được bảo vệ nghiêm ngặt. Năm 1965 các nhà
thực vật học người Trung Quốc đã mô tả loài trà hoa vàng có ở Trung Quốc và đặt tên khoa học là Camellia
chrysanda và loài này được xếp trong 10 loài thực vật quý và hiếm nhất của Trung Quốc. Đến nay, ở Trung Quốc
đã có 28 loài trà hoa vàng được ghi nhận. Ở Việt Nam, qua hơn 10 năm điều tra và nghiên cứu đã phát hiện được 24
loài trà hoa vàng. Trong đó, có 8 loài ở Vườn Quốc Gia Tam Đảo, đây là nguồn vô cùng quý hiếm cho hệ thực vật ở
Việt Nam nói chung và Tam Đảo nói riêng (Hakoda et al, 1998; Ninh et al. 2007).
Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh), do hai nhà khoa học Trần Ninh và Hakoda
Naotoshi người nhật bản phát hiện và công bố trên tạp chí khoa học của Đại học Quốc gia Hà Nội và tạp chí trà
Quốc tế vào năm 2007. Đây là loài Trà đặc hữu ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam (Ninh et al,
2007; Hakoda et al, 2007). Loài Trà hoa vàng tam đảo có giá trị kinh tế, dược liệu và thẩm mỹ rất cao, số lượng cá
thể còn lại rất ít và khu phân bố hẹp (Ninh và Hakoda, 2010). Đến nay, các nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh
thái và gây trồng loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế, chưa toàn diện và đồng bộ. Công tác bảo tồn các loài trà quý
này cũng chưa được chú ý, đặc biệt là các nghiên cứu về phát triển và ứng dụng loài trà này hầu như còn bỏ ngỏ
(Ninh và Hakoda, 2010).
Đến nay, các nghiên cứu về phân loại Trà hoa vàng ở Việt Nam chủ yếu dựa vào chỉ thị hình thái. Phương
pháp này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, đặc biệt một số loài tra hoa vàng có nhiều đặc
điểm hình thái khá giống nhau nên khó khăn cho việc phân loại. Trên thế giới, ngoài việc sử dụng các chỉ thị hình
thái cũng đã sử dụng các chỉ thị phân tử như gen matK, ITS, rbcL để phân loại, giám định một số loài trà, như:
Camellia sinensis, Camellia petelotii, Camellia yunnanensis, Camellia oleifera, Camellia taliensis, Camellia
japonica, Camellia cuspidata, Camellia grandibracteata, Camellia albogigas,..
Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử ADN sẽ làm tăng độ chính xác và nhanh chóng
xác định được sự khác biệt giữ các sinh vật.
Đến nay các nhà khoa học đã xác định được nhiều đoạn ADN đặc hiệu được sử dụng làm mã vạch ADN.
Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Việc
lựa chọn những đoạn ADN (gen) đặc trưng để làm mã vạch ADN là phụ thuộc vào từng nhóm sinh vật cụ thể và
mục đích nghiên cứu (Kress et al, 2008). Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra, ở rất nhiều loài thực vật sử dụng
gen matK lục lạp có thể phân biệt được loài thập chí dưới loài (Chase et al, 2005; Yakawa et al, 2006; Storchova et
al, 2007; Ford et al, 2009). Gen matK mã hóa cho enzyme maturase, enzyme này có liên quan đến quá trình loại bỏ
các intron trong quá trình phiên mã mRNA. Do gen matK tiến hóa nhanh và có mặt ở hầu hết các loài thực vật nên
được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu phát sinh loài, mối quan hệ di truyền ở thực vật. CBOL (Consortium
for the Barcode of Life) đã tiến hành phân tích gen matK ở trên 550 loài thực vật và thấy rằng có hơn 90% mẫu thực
vật hạt kín dễ dàng khuếch đại gen matK bằng 1 cặp mồi, CBOL đã đề nghị sử dụng gen matK là một trong những
chỉ thị chuẩn cho việc phân loại thực vật.
Do Trà hoa vàng tam đảo là loài mới được phát hiện, chưa có nghiên cứu nào về phân tích gen của loài trà
này được công bố. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn đoạn gen matK để nghiên cứu, kết quả nghiên
123
cứu này sẽ phục vụ cho các nghiên cứu khác về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng cao
hiệu quả bảo tồn và phát triển loài Trà hoa vàng quý hiếm, đặc hữu của Việt Nam.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, vật liệu:
Đối tượng nghiên cứu: loài Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et
Ninh) và loài Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda) mọc tự nhiên ở Vườn
Quốc gia Tam đảo, Vĩnh Phúc.
Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu lá bánh tẻ của cây Trà hoa vàng, mỗi loài lấy 5 mẫu lá ở 5
cây khác nhau. Sau khi thu, mẫu được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm
bảo quản ở -80oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu. Kí hiệu các mẫu Trà hoa vàng tam
đảo: TĐ1, TĐ2, TĐ3, TĐ4, TĐ5; Trà vàng lá dày: LD1, LD2, LD3, LD4, LD5;
TĐ1
TĐ2
TĐ3
TĐ4
TĐ5
Hình 01. Các mẫu lá Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis)
LD1
LD2
LD3
LD4
LD5
Hình 02. Các mẫu lá Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla)
Cặp mồi cho nhân bản đoạn gen matK được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của loài
Trà vàng petêlô (Camellia petelotii) đã được công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI (Mã số:
KJ806276.1):
- Mồi xuôi matKTHVF: 5’-TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3’
- Mồi ngược matKTHVR: 5’-CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA-3’
Hóa chất:
Các loại hóa chất phục vụ cho tách chiết ADN tổng số: CTAB, SDS, EDTA, Tris-HCl, NaCl,
PVP, Ascorbic acid, Mercaptoethanol, Potassium acetate, Sodium acetate, Ethanol,... do các
hãng Wako (Nhật bản) và Merck (Đức) cung cấp; Các hóa chất cho PCR: 10X Taq Reaction
buffer, dNTP mix (2,0 mM), Taq DNA polymerase (5 units/μl); Hóa chất cho điện di ADN:
Agarose, Ethidium bromide, DNA marker và các hóa chất khác do các hãng Fermentas (Đức),
Bioneer (Hàn quốc), Research Organics (Mỹ) cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của cây Trà hoa vàng tam đảo và Trà vàng lá dày theo
phương pháp của Keb-Llanes và cộng sự (2002). Xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung
dịch ADN tổng số bằng phương pháp quang phổ kế. Nhân bản đoạn gen matK từ các mẫu ADN
124
tổng số tách chiết từ lá cây Trà hoa vàng tam đảo bẵng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700
Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể
tích 25 μl, bao gồm: H2O deion (17 µl), 10X Taq Reaction buffer (2,5 µl), 2,0 mM dNTP mix
(2,0 µl), 10 µM mồi matKTHVF (1,0 µl), 10 µM mồi matKTHVR (1,0 µl), 5 U/µl Taq DNA
polymerase (0,5 µl) và 50 ng/µl ADN khuôn (1 µl). Chương trình phản ứng PCR: 95oC trong 3
phút; (95oC: 30 giây, 57oC : 30 giây, 72oC : 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC trong 7 phút; bảo
quản sản phẩm PCR ở 4oC. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2 %, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV)
và chụp ảnh bằng hệ thống Dolphin - Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ). Tất cả các sản
phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn gen
matK được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử
dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ở Viện Công nghệ sinh học – Viện
Hàn lâm KH và CN Việt Nam. Các sản phẩm PCR sau khi giải trình tự, tiến hành so sánh trình
tự nucleotide của đoạn gen matK giữa các lần lặp lại (3 lần/1 mẫu), giữa các mẫu trong cùng loài
(5 mẫu); giữa loài Trà hoa vàng tam đảo với loài trà vàng lá dày và loài trà vàng petêlô.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách ADN tổng số
Hiện nay, có nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số khá hiệu quả. Trong nghiên cứu
này sử dụng phương pháp của Keb – Llanes et al., (2002) để tách chiết ADN tổng số từ các mẫu
nghiên cứu. Chất lượng DNA tổng số (độ sạch và độ nguyên vẹn) sau khi tách chiết từ các mẫu
nghiên cứu có ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích ADN bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu
được thể hiện trên hình 03.
TĐ1
TĐ2
TĐ3
TĐ4
TĐ5
LD1
LD2
LD2
LD4
LD5
Hình 03: Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo (TĐ1-TĐ5)
và 5 mẫu Trà vàng lá dày (LD1-LD5)
Từ kết quả điện di hình 03 cho thấy, băng điện di sáng rõ nét và chỉ có một băng vạch,
chứng tỏ ADN tổng số nguyên vẹn, không bị đứt gãy và đã loại bỏ được ARN. Điều này, chứng
tỏ phương pháp tách chiết là phù hợp với đối tượng Trà hoa vàng. ADN tổng số đáp ứng được
yêu cầu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen matK
ADN tổng số tách chiết từ 5 mẫu lá của cây Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày
được sử dụng làm khuôn để nhân bản đoạn gen matK ở lục lạp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi
được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của của gen matK ở loài Camellia petelotii. Thành
phần và điều kiện của phản ứng PCR như mô tả ở phần phương pháp. Tuy nhiên, lúc đầu sử
dụng trực tiếp 1µl dung dịch ADN tổng số để làm khuôn cho nhân bản đoạn gen matK, thì kết
quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di không xuất hiện băng ADN quan tâm. Chúng tôi cho
rằng nồng độ ADN có ảnh hưởng đến hiệu quả nhân gen, vì vậy đã tiến hành thí nghiệm pha
loãng dung dịch ADN tổng số thành các nồng độ: 200 ng/µl (pha loãng 10 lần), 40 ng/µl (pha
loãng 50 lần) và 20 ng/µl (pha loãng 100 lần) sau đó tiến hành phản ứng PCR. Kết quả nhân
đoạn gen matK bằng PCR sử dụng dung dịch ADN ở các độ pha loãng khác nhau như sau:
125
1
2
3
4
Hình 04. Kết quả nhân bản đoạn gen matK sử dụng ADN khuôn ở các độ pha loãng khác nhau
Giếng 1: nồng độ ADN khuôn là 2.000 ng/µl, giếng 2: 200 ng/µl, giếng 3: 40 ng/µl, giếng 4: 20 ng/µl
Kết quả trên hình 04 cho thấy, sử dụng ADN tổng số ở nồng độ 2.000 ng/µl (giếng 1) và
200 ng/µl (giếng 2) thì không thấy xuất hiện sản phẩm PCR. Dung dịch ADN pha loãng ở nồng
độ 40 ng/µl (giếng 3) và 20 ng/µl (giếng 4) thì xuất hiện băng ADN đặc hiệu. Thí nghiệm này
cho thấy nồng độ dung dịch ADN tổng số được sử dụng làm khuôn cho nhân gen bằng kỹ thuật
PCR có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả nhân gen. Điều này có thể do trong dụng dịch ADN tổng
số còn chứa nhiều tạp chất khác có thể gây ảnh hưởng đến sự biến tính của ADN khuôn, cản trở
sự tiếp cận của mồi với ADN khuôn hoặc ức chế hoạt tính của enzyme Taq DNA polymerase,
dẫn đến không nhân bản hoặc hiệu quả nhân bản gen thấp. Từ kết quả trên, chúng tôi sử dụng
dung dịch ADN tổng số ở nồng độ 40 ng/µl để làm khuôn cho nhân bản gen matK ở các thí
nghiệm tiếp theo.
Sau khi xác định được nồng độ ADN phù hợp, tiến hành nhân bản gen matK từ ADN tổng số
của 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày bằng phản ứng PCR với cặp mồi
matTHVF và matTHVR. Thực hiện phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Sản
phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%.
Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày được
thể hiện trên hình 05 và 06.
M
1
2
3
4
5
bp
2.000
1.000
Sản phẩm PCR
500
Hình 05. Kết quả nhân bản đoạn gen matK từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo
126
1
2
3
4
5
Sản phẩm PCR
Hình 06. Kết quả nhân bản đoạn gen matK từ 5 mẫu Trà hoa vàng lá dầy
Kết quả điện di sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm cho thấy, ở các mẫu đều
thu được một băng ADN sáng rõ nét, có kích thước khoảng 950 bp phù hợp với kích thước lý
thuyết của đoạn gen matK dự kiến nhân bản. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng
ADN phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR nhân bản đoạn gen matK rất đặc hiệu, có thể sử
dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.
3.3. Kết qủa xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen matK
Tất cả các sản phẩm PCR của các mẫu nghiên cứu ( 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo x 3 lần
lặp = 15 mẫu; 5 mẫu Trà vàng lá dày x 3 lần lặp = 15 mẫu) đã được xác định trình tự nucleotide.
Kết quả xác định trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen matK được nhân
bản có kích thước là 951 nucleotide. Đã tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các mẫu sản
phẩm PCR ( 3 lần lặp/mẫu và 5 mẫu lấy từ 5 cây khác nhau), kết quả so sánh cho thấy không có
sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng
một loài. Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen matK phân lập từ cây Trà hoa vàng tam
đảo với trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà vàng lá dày và Trà vàng petêlô, kết
quả so sánh cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng tam đảo so với ở
cây Trà vàng lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng
petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613; so sánh trình tự nucleotide của
gen matK ở Trà vàng lá dày so với trà vàng petêlô thì có 2 nucleotide sai khác là thay G bằng A
ở vị trí 508 và thay C bằng A ở vị trí 613; kết quả so sánh được thể hiện trên hình 07.
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
1
50
GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC
GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC
GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
51
100
AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT
AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT
AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
101
150
TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG
TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG
TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
151
200
ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA
ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA
ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
201
250
AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA
AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA
AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA
127
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
251
300
GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT
GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT
GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
301
350
GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT
GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT
GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
351
400
GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA
GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA
GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
401
450
TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA
TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA
TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
451
500
GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA
GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA
GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
501
550
TGGAGTGGGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG
TGGAGTGGGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG
TGGAGTGAGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
551
600
TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT
TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT
TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
601
650
CACTATTTCT TTCCCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA
CACTATTTCT TTACCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA
CACTATTTCT TTACCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
651
700
CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC
CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC
CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
701
750
CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT
CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT
CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
751
800
CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT
CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT
CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
801
850
TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA
TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA
TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
851
900
TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA
TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA
TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA
901
950
128
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA
GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA
GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA
C1_Petelo
C2_Tamdao
C3_Crassi
951
T
T
T
951
Hình 07. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen matK
ở cây Trà hoa vàng tam đảo, Trà vàng lá dày và Trà vàng petêlô;
Dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng tam đảo và Trà vàng
lá dày đã xác định được, sử dụng công cụ Blast và Blast Tree View trong NCBI để tạo cây quan
hệ di truyền với 8 loài trà khác đã được công bố trên NCBI là: Camellia petelotii (KJ806276),
Camellia yunnanensis (KF156838), Camellia oleifera
(JQ975031), Camellia sinensis
(AJ429305), Camellia taliensis (KF156839), Camellia japonica (AF380074), Camellia
cuspidata (KF156833), Camellia albogigas (AF380072). Kết quả thể hiện ở hình 07.
Kết quả ở hình 07 cho thấy loài Trà hoa vàng tam đảo (Mã số KP241692) ở một nhánh
riêng, loài Trà vàng lá dày có quan hệ gần với loài Camellia japonica (AF380074).
Hình 08. Cây quan hệ di truyền giữ Trà hoa vàng tam đảo với các loài khác
đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI
Do đây là lần đầu tiên trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng tam đảo
được giải mã, vì vậy chúng tôi đã tiến hành đăng ký trình tự nucleotide của đoạn gen matK ở cây
Trà hoa vàng tam đảo trong ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) với mã số đăng ký KP241692.
KẾT LUẬN
Đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn ADN tổng số của loài Trà hoa vàng
bằng kỹ thuật PCR. Đã xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen matK của các mẫu sản
phẩm PCR có kích thước 951 bp, kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự
nucleotide của đoạn gen matK ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Trình tự đoạn
gen matK phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng
cùa việt Nam.
129
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Anders R., (2012). DNA barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case study
on medicinal roots traded in the medina of Marrakech. M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS
Brochure.
Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K et al (2008). Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome
discriminate plant species equally well. PLoS ONE, 3(7): e2802
Chase M.W, et al., (2005). Land plants and DNA barcodes: Short-term and long-term goals. Philos Trans
R Soc Lond B Biol Sci, 360:1889-1895
Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N et al., (2009). Selection of candidate coding DNA barcoding regions for
use on ADN plants. Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1): 1-11
Hakoda N, Kirino Sh, Ninh T., (2007). New species of genus Camellia in Vietnam. International Camellia
Journal, 39:54-57
Kress J.W, Erickson D.L. (2008). DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics. Proc Natl
Acad Sci U S A, 105(8):2761-2762
Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H., (2005). Use of DNA barcodes to identify
flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23): 8369–74.
Ninh T., (2003). Results of study on yellow Camellias of Vietnam. International Camellia Journal.
Ninh T., (2007). Diversity of wild Camellia species of Tam Dao Nationnal Park. Journal of Science –
Natural Science and Technology, 23:152-154.
Olmstead R.G, Palmer J.D., (1994). Chloroplast DNA Systematics: A review of methods and Data
Analysis. American Journal of Botany, 81: 1205-1224
Spooner D.M., (2009). DNA barcoding will frequently fail in complicated groups: an example in wild
potatoes. Am. J. Bot, 96: 1177- 1189.
Storchova H, Olson MS., (2007). The architecture of the chloroplast psbA -trnH non coding region in
angiosperms. Plant systematic and evolution. Biomedical and life sciences, 268:235-256
Trần Ninh, Hakoda Naotoshi (2010). Các loài trà ở vườn Quốc gia Tam đảo: 122-125
Yakawa M, Tsudzuki T, Sugiura M., (2006). The chloroplast genome of Nicotianas sylvestris and Nicotian
tomentosisformis: complete sequencing confirms that the Nicotiana sylvestris progenitor is the maternal
genome donor of Nicotiana tabacum. Mol genet genomics, 275: 367-373.
IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE FOR
TAM DAO YELLOW TEA (Camellia tamdaoensis): AN ENDEMIC PLANT
SPECIES OF VIETNAM
Ha Van Huan, Nguyen Van Phong
College of Forestry Biotechnology –
Vietnam Forestry University
SUMMARY
Base on the information of matK gene of Camellia petelotii (Accession no. KJ806276.1) was published, one primer
pair was designed to amplify matK gene from total DNA of Camellia tamdaoensis (TĐ1,TĐ2, TĐ3, TĐ4 và TĐ5)
and Camellia crassiphylla (LD1, LD2, LD3, LD4 và LD5) by PCR. The PCR results indicated that all DNA bands
were amplified from the samples, they have the same size of approximately 950bp, similar to the theoretical size of
matK gene of Camellia petelotii species. Results nucleotide sequencing of PCR product samples (repeated three
times / a sample and 5 samples / a species ) showed that the size of the isolated matK gene was 951 bp, comparison
of nucleotide sequences of the PCR product samples show that there is no difference between repeated three times
and samples in the same species. The nucleotide sequence of the matK gene from Camellia tamdaoensis was
compared with the nucleotide sequence of the matK gene from Camellia crassiphylla and Camellia petelotii. The
result comparison between Camellia tamdaoensis and Camellia crassiphylla showed that only one nucleotide is
various in 508 site (A was replaced by G); between Camellia tamdaoensis and Camellia petelotii that one
nucleotide is various in 613 site (C was replaced by A); between Camellia crassiphylla and Camellia petelotii that
two nucleotide are various in 508 and 613 site. The nucleotide sequences of isolated matK gene of Camellia
tamdaoensis and Camellia crassiphylla have been registered on the NCBI with Accession no. KP241692 and
KP241693. This sequence can be one of the markers used to identify the yellow flower tea species of Vietnam.
Key words: Camellia tamdaoensis, DNA barcode, matK gene, species identification, yellow tea.
130
- Xem thêm -