Tài liệu Xây dựng quy trình nested methylation specific pcr (nested msp) và ứng dụng chúng trong khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của gen p16ink4α

B() GIAO DlJC VA oAo T�o TRlJONG D�I HQC MO TP. H6 CHI MINH uAo cAo TONG KET DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHt CAP TRUONG XAY D\JNG QUY TRINH NESTED-METHY1*T�_ON SPECIFIC PCR (NESTED-MSP) VA UNG DVNG CHUNG cAc TRONG KHAO SAT MUC BO METHYL HOATAI . BAO CpG THUQC ViJNG PROMOTER GEN pl61NK4a Ma s6: 12-()Al. .oG,. � '3("°' . . . . Chu nhiem ct� tai:CN. TON NU TUNG KIM TP. HCM, Thang 07/ 2014 . -i- MỤC LỤC Trang Danh mục hình ảnh & bảng biểu iii Danh mục các chữ viết tắt v Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Việt vii Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh x TỔNG QUAN 1 I.1. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS 1 I.2. TỔNG QUAN VỀ GEN p16INK4a 3 I.2.1. Cấu trúc và chức năng 3 I.2.2. Sự methyl hóa của p16INK4a trong ung thư 4 I.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA 5 I.3.1. Phương pháp Methylation specific PCR (MSP) 6 I.3.2. Phương pháp Nested Methylation Specific PCR (Nested-MSP) 6 I.4. TÍNH CẤP THIẾT 7 I.5. MỤC TIÊU 8 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 9 II.1. VẬT LIỆU 9 II.2. PHƯƠNG PHÁP 9 II.2.1. Phương pháp in silico 9 II.2.1.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG 9 II.2.1.2. Đánh giá – thiết kế mồi 9 II.2.2. Thực nghiệm 9 II.2.2.1. Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng Q-MSP 9 II.2.2.2. Tách chiết DNA 11 II.2.2.3. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit 12 II.2.2.4. Phương pháp MSP trên mẫu bệnh phẩm 14 II.2.2.5. Phương pháp Nested-MSP trên mẫu bệnh phẩm 15 II.2.2.6. Giải trình tự sản phẩm MSP 15 -ii- II.2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose 15 KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 17 III.1. Kết quả khảo sát in silico gen p16INK4α, thiết kế các bộ mồi cho phản ứng MSP, Nested-MSP 17 III.2. Kết quả thực nghiệm 20 III.2.1. Thử nghiệm các mồi bằng DNA chứng 20 III.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai thích hợp cho các mồi 21 III.2.3. Một số thử nghiệm Nested-MSP và MSP trên bệnh phẩm 22 III.2.4. So sánh tính chất methyl hóa bằng Nested-MSP và MSP trên bệnh phẩm 25 III.2.5. Xác định mối tương quan giữa tính chất methyl hóa với ung thư vú 25 III.2.6. Khảo sát mức độ liên quan (tỉ suất chênh – Odd ratio – OR và nguy cơ tương đối – relative risk – RR) giữa tính chất methyl hóa với ung thư vú 30 III.2.7. Giải trình tự sản phẩm MSP 31 KẾT LUẬN 32 ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 34 39 -iii- DANH MỤC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU Trang Hình 1.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí 5’ của cytosine nhờ DNMTs 1 Hình 1.2: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4a trong ung thư vú nói chung và phân chia theo các giai đoạn bệnh Hình 1.3: Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil 5 6 Hình 3.1. Định vị gen p16INK4α trên nhiễm sắc thể số 9 17 Hình 3.2. Trình tự gen p16INK4α và sự phân bố của một số nhân tố phiên mã 17 Hình 3.3: Sơ đồ mô tả các vị trí của các mồi MSP và Nested-MSP trên gen 18 p16INK4α Hình 3.4: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản phẩm QMSP từ các cặp mồi (A): SQF-SQR, (B): MF-MR và (C): UF-UR 20 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại sử dụng cặp mồi ngoài SQFSQR 21 Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm MSP nhằm khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của cặp mồi MF-MR Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm MSP nhằm khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của cặp mồi UF-UR 22 22 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP và MSP thử nghiệm trên bệnh phẩm lần I 23 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP và MSP thử nghiệm trên bệnh phẩm lần II 24 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm từ mồi methyl của Nested-MSP và MSP thử nghiệm trên bệnh phẩm lần III 24 Hình 3.11: (a) Vùng trình tự gen p16INK4a chưa biến đổi bisulfite; (b) Vùng trình tự p16INK4a biến đổi bisulfite. (c) Trình tự thu được từ giải trình tự với cặp mồi xuôi methyl MF 31 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Q-MSP 10 Bảng 2.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP 10 -iv- Bảng 2.3: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite của EpiTect bisulfite Kit 13 Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng MSP 14 Bảng 2.5: Chu kì nhiệt của phản ứng MSP 15 Bảng 3.1: Trình tự các mồi và các thông số vật lý 19 Bảng 3.2. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen p16INK4α với ung thư vú 26 Bảng 3.3. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen p16INK4α với các yếu tố lâm sàng trên bệnh nhân ung thư vú 27 Bảng 3.4. Mối tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen p16INK4α với tình trạng biểu hiện Her2/neu và p53 trên bệnh nhân ung thư vú và lành tính 29 Bảng 3.5. Mức độ liên quan giữa tính chất methyl hóa tại vùng promoter ở gen 30 p16INK4α với ung thư vú -v- DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5-Aza CR 5-azacytidine 5-AzadC 5-aza 2’-deoxycytidine BD Desulfonation buffer BW Wash buffer EB Elution buffer CDK Cyclin dependent kinase CpG -C-phosphate-G- DC Di căn DNA Deoxyribonucleic acid DNMT DNA methyltransferase ER Estrogen receptor FDA Food and Drug Administration HDACIs Histone deacetylases inhibitors MCK Mô cận kề khối u MDS Myelodysplastic syndrome MSP Methylation specific PCR Nested –MSP Nested MSP methylation specific PCR NH4OAC Ammonium acetate NPC Nasopharyngeal carcinoma PCR Polymerase chain reaction Q-MSP Quantitative MSP RNA Ribonucleic acid SAM S-adenosylmethionine TBT Tế bào bình thường TUT Tiền ung thư UTR Untranslated region UTV Ung thư vú NOS Not otherwise specified carcinoma -vi- LOB Lobular carcinoma CIBRIFORM Cibriform carcinoma MUCINOUS Mucinous carcinoma BRCA1 Breast cancer, early onset CDKN2A Cyclin –dependent kinase inhibitor 2A CCND2 Cyclin D2 GSTP1 Glutathione S-transferase pi 1 CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16INK4A+ RASSF1A Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1 -vii- Mẫu NCKH-09. Thông tin kết quả nghiên cứu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc __________________ _________________ THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Xây dựng quy trình Nested-Methylation Specific PCR (NestedMSP) và ứng dụng chúng trong khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16INK4α - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN. Tôn Nữ Tùng Kim - Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công Sinh học - Thời gian thực hiện: (15 tháng) 2. Mục tiêu: Xây dựng quy trình Nested-MSP để khảo sát sự methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16INK4α; từ đó đánh giá mức độ nhạy cảm của phương pháp này so với phương pháp MSP thông thường áp dụng trên DNA các bệnh nhân ung thư vú ở người Việt Nam. 3. Tính mới và sáng tạo: - Epigenetics đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm trên thế giới. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công bố về vấn đề này. Nhóm nghiên cứu epigenetics của ĐH. Mở là một trong những nhóm đầu tiên tiếp cận về epigenetics ở Việt Nam. - Trong điều kiện hạn chế về cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã có nhiều nỗ lực, tìm tòi, nâng cao giá trị khoa học trong một chủ đề nghiên cứu mới mẻ và cần thiết. Quy trình Nested Methylation Specific PCR được xây dựng và áp dụng trong sàng lọc alen methyl hóa trên gen p16INK4α là chưa từng được công bố ở Việt Nam. 4. Kết quả nghiên cứu: - Đã thiết kế thành công các bộ mồi cho phản ứng MSP và Nested-MSP trên gen p16INK4a -viii- - Đã xác định tính khuếch đại đặc hiệu của các cặp mồi trên DNA chứng (ghi nhận bằng kết quả phân tích đường cong nóng chảy Quantitative-MSP) và trên DNA bệnh phẩm (ghi nhận bằng kết quả giải trình tự) - Đã xác định nhiệt độ lai tối ưu cho từng cặp mồi như sau: 55oC cho cặp SQFSQR, 61.9oC cho cặp MF-MR và 61.5oC cho cặp UF-UR - Đã thử nghiệm quy trình Nested-MSP trên bệnh phẩm, ghi nhận tính nhạy hơn: trên 58 mẫu bệnh ung thư vú, bằng Nested-MSP tần số methyl hóa và không methyl hóa được ghi nhận lần lượt là 50% (29/58) và 50 % (29/58), cao hơn so với phương pháp MSP đạt lần lượt 34.5% (20/58) và 65.5% (38/58). Đối với nhóm mẫu lành: 16.7% (3/18) methyl và 83.3% (15/18) unmethyl được phát hiện bằng Nested-MSP trong khi MSP không phát hiện trường hợp nào methyl hóa. Tính tương quan giữa tỷ lệ methyl hóa tại vùng promoter ở gen p16INK4α với bệnh ung thư vú được ghi nhận rõ ràng (p<0.05). - Đã có kết luận hiện tượng methyl hóa tại vùng promoter thuộc gen p16INK4α với yếu tố nguy cơ đã làm tăng khả năng mắc bệnh ung thư vú cao gấp 5 lần (OR=5, p<0.05). Đồng thời, nguy cơ mắc bệnh ung thư vú ở nhóm bị methyl hóa tại vùng promoter gen p16INK4a cao gấp 3 lần so với nhóm không methyl (RR=3, p<0.05). 5. Sản phẩm: - Quy trình Nested-MSP trên gen p16INK4α với các thông số: trình tự các bộ mồi, nhiệt độ lai tối ưu của các mồi, tính đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, độ pha loãng sản phẩm khuếch đại lần thứ I, cùng với các thông số cơ bản khác (mang tính kế thừa) cho một quy trình Methylation Specific PCR. - Dữ liệu methyl hóa bất thường của gen p16INK4α trên các mẫu ung thư vú và mô vú lành tính. - Kết luận về tỷ số chênh và tỷ số nguy cơ (mắc bệnh ung thư vú) giữa nhóm người bị methyl và không methyl lần lượt là 5 và 3 lần - Đang đào tạo một thạc sĩ (Di truyền học, ĐH. Khoa học Tự nhiên, TP. HCM, ứng viên: Trần Huỳnh Minh Nhật) - Một bản thảo tham dự Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn quốc, khu vực phía Nam, 2013 và gởi đăng tạp chí Sinh học (đang trong quá trình phản biện) 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: - Những dữ liệu thu nhận được trên gen p16INK4a này là rất giá trị trong việc tích lũy để hình thành một cơ sở dữ liệu nhằm hướng tới việc sử dụng chúng -ix- như một dấu chứng sinh học tiềm năng cho bệnh ung thư vú ở người Việt Nam, ứng dụng trong tiên lượng bệnh, chẩn đoán sớm và kể cả xác định phương án điều trị bệnh sau này. - Việc thử nghiệm thành công kỹ thuật Nested-MSP trong nghiên cứu này cũng là tiền đề để nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển kỹ thuật Nested-MSP cho các gen ứng viên khác nhằm tạo được cơ sở dữ liệu methyl hóa bất thường cho một số các gen – và cũng là một dấu chứng sinh học (biomarker) tiềm năng cho ung thư vú, người bệnh Việt Nam, là điều mà nhóm nghiên cứu chúng tôi hướng đến. Cơ quan chủ trì xác nhận Ngày tháng năm KT. HIỆU TRƯỞNG Chủ nhiệm đề tài PHÓ HIỆU TRƯỞNG (Ký, Họ và tên) -x- Mẫu NCKH-10. Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: - Project title: Establishment of Nested-Methylation Specific PCR (NestedMSP) protocol for surveying of methylation at CpG islands belonged to promoter of p16INK4α gene. - Code number: - Coordinator: Ton Nu Tung Kim - Implementing institution: Faculty of Biotechnology - Duration: from 6/1012 to 9/2013 (15 months) 2. Objective(s): Establishment of Nested-Methylation Specific PCR (Nested-MSP) protocol for the surveying of methylation at CpG islands belonged to promoter of p16INK4α gene. 3. Creativeness and innovativeness: - This is one the first work done in Vietnam to explore of the "Epigenetics" information in Vietnamese cancer patients. This Nested-Methylation Specific PCR protocol was also the first successfully established both on the DNA controls and DNA extracted from breast cancer tissues, in Vietnam. Consequently, the final results of this research about the aberrant methylation of p16INK4α gene were examined from breast cancer in comparison with healing specimens first published in Vietnam. 4. Research results: - Successfully designing specific primer pairs for MSP and Nested-MSP methods to surveying the aberrant methylation at CpG islands in the promoter region of p16INK4a gene - Successfully demonstrating the specificity of the primer pairs using DNA controls (by Q-MSP and melting-curve analysis) and clinical specimens (by MSP sequencing) - Successfully demonstrating the optimal annealing temperatures for each primer pairs: 55oC for SQF-SQR, 61.9oC for MF-MR and 61.5oC for UF-UR -xi- - Successfully application Nested-MSP using clinical specimens, giving the more sensitivity of Nested-MSP in comparison with MSP. The frequency of DNA methylation at CpG islands in the promoter regions of p16INK4α gene reaching 50% (in the comparison with MSP showing 34.5% (20/58) methylation. This aberrant methylation of p16INK4α gene is associated with breast cancer (p<0.05) with the odd ratio is 5 (p<0.05) and relative risk ratio is 3 (p<0.05). 5. Products: - Nested-MSP protocol for surveying methylation at CpG islands in the promoter regions of p16INK4α gene with all of parameters: primer pair sequences, optimal annealing temperatures of all primer pairs, specificity, diluted times of the first product amplification and all of principal parameters of MSP protocol. - Frequency of hypermethylation of p16INK4α gene from breast cancer specimens as well as healing samples. - Conclusion of the odd ratio and relative risk ratio (to be breast cancer) between methyl and unmethyl patients is 5 and 3, respectively. - MSc (Genetics, Natural Sciences University, HoChiMinh city) (on going) - Publication (National Conference in Biotechnology, South Vietnam, 2013) and Journal of Biology (in reviewing) 6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability: - Initial results of hypermethylation in p16INK4a gene are very positive to accumulate for build the database for epigenetics – aberrant methylation of other important genes in order to get the final purpose: use this data as a biomarker for Vietnamese breast cancer in Vietnam patients - This successful application of Nested-MSP towards our proposal to expand to other candidate genes. -1- TỔNG QUAN I.1. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS Epigenetics được định nghĩa là sự thay đổi trong sự biểu hiện của gen nhưng không liên quan đến biến đổi trình tự DNA và được di truyền một cách ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác [1]. Epigenetics bao gồm các hiện tượng sau: sự methyl hóa DNA, acetyl hóa histone, và microRNAs [2]. Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra trong quá trình phát triển của tế bào. Nó đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát chu trình tế bào, sự phát triển của phôi, quá trình phiên mã, sự bất hoạt nhiễm sắc thể X … [2]. Ở người, sự methyl hóa DNA được tìm thấy xuyên suốt cả bộ gen, nhóm –CH3 được bổ sung tại vị trí C5 của cytosine đứng trước guanine trong cặp dinucleotide CpG [3, 4]. Trong các tế bào của người có khoảng 70-80% dinucleotide CpG bị methyl hóa. Các cặp dinucleotide CpG phân bố không đồng đều trong bộ gen, chúng trải dài trên trình tự gen và xen kẽ với các vùng không bị methyl hóa. Vùng DNA giàu dinucleotide CpG có kích thước khoảng 0,5-4 kb gọi là đảo CpG [2]. Các đảo CpG thường kéo dài từ đầu 5’ đến exon đầu tiên của gen, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo này không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm riêng biệt từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen bị methyl hóa [2, 5]. Hiện tượng methyl hóa DNA xảy ra sau quá trình tổng hợp DNA, quá trình này được thực hiện bởi các enzyme chuyển nhóm methyl từ chất cung cấp methyl S-adenosylmethionine (SAM) đến vị trí C5 của cytosine (Hình 1.1) [4]. Đây là một hệ enzyme chuyên biệt có tên DNA methyltransferase (DNMTs) trong đó 3 enzyme DNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, 3A, 3B) trực tiếp tham gia quá trình methyl hóa: DNMT1 hoạt động chính ở động vật hữu nhũ, nhằm duy trì tính ổn định sự methyl hóa của các tế bào sinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sao chép DNA. Trong khi đó, DNMT3A và DNMT3B hoạt động nhằm tạo các vị trí methyl hóa mới (de novo methylation) [4, 5]. Hình 1.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí 5’ của cytosine nhờ DNMTs -2- Hiện tượng epigenetics trong ung thư ở người đã và đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu mới, nhằm một trong những mục tiêu là nhận dạng (sớm) các dấu chứng epigenetic và phát triển nhanh các kĩ thuật phát hiện (sớm) ung thư [6]. Trong nhiều bài tổng quan, các tác giả đều có chung nhận định rằng, trong tương lai các dấu chứng dựa trên thông tin DNA bị methyl hóa được sử dụng trong tiên đoán sớm ung thư bởi sự methyl hóa quá mức ở các đảo CpG này được tìm thấy phổ biến với số lượng “vừa đủ” trong các mẫu sinh thiết mô từ các bệnh nhân ung thư giai đoạn đầu, trong DNA tự do trong máu, nước tiểu... [1, 6]. Dõi theo các công bố gần đây hơn, các báo cáo đã cho thấy hiện tượng methyl hóa bất thường có thể tìm thấy từ các tế bào trong giai đoạn tiền ung thư thông qua sự bất hoạt do methyl hóa quá mức ở các gen đè nén u, các gen điều khiển chu trình tế bào; cũng như việc kích hoạt các gen gây ung thư bằng cơ chế giảm mạnh methyl hóa (hypomethylation) trong vùng promoter của gen [2, 3, 5, 6]. Ngoài ra, thông tin DNA methyl hóa cũng có vai trò trong dự đoán trị liệu. Hiện nay, khuynh hướng sử dụng thuốc epigenetic - chất ức chế methyl hóa, dùng riêng hoặc kết hợp với phương pháp hóa trị liệu nhằm tái hoạt động các gen (đè nén u) bị im lặng trong ung thư, phục hồi chức năng các gen này chính là hướng đi mới trong điều trị ung thư và đã được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng. Chất ức chế DNA methyltransferase (DNMTs), 5-azacytidine (5-AzaCR) và 5-aza2’deoxycytidine (5-AzadC), là những thuốc epigenetic được công bố đầu tiên. Những thuốc này tác động bằng cách gắn vào DNA tại các vị trí Cytosine trong quá trình tái bản DNA, từ đó ngăn cản hoạt động của DNMTs [7]. Những thuốc này đã được FDA (Food and Drug Administration) cho phép thử nghiệm lâm sàng trên các hội chứng myelodysplastic syndrome (MDS), u trung mạc ác (malignant mesothelioma), bệnh tiền ung thư máu (preleukemic disease), ung thư vú, ung thư mũi họng (nasopharyngeal carcinoma - NPC) và một vài bệnh khác [8-11]. Gần đây, Zebularine, một chất ức chế DNMT mới với độc tính thấp hơn nhưng nhạy cảm trong chọn lọc tế bào ung thư cũng được công bố, đặc biệt các báo cáo đã chỉ ra phản ứng của thuốc chỉ trên một số gen đè nén u quan trọng đã bị ức chế hoạt động trong các dòng tế bào ung thư vú cho dù ở nồng độ thấp [12]. Hơn nữa, một hướng chống methyl hóa mới đang được nghiên cứu, ức chế DNMT thông qua siRNA, ribozymes, và antisense oligonucleotides, cũng đã được đề nghị tuy chỉ mới là những thử nghiệm bước đầu. Một vài thuốc đã chứng minh được hiệu quả tác động trên hệ thống nuôi cấy tế bào, mô hình động vật và kể cả thử nghiệm lâm sàng [13]. Có thể kể tên các “thuốc” tiêu biểu: MG98, một antisense oligonucleotide tác động trực tiếp lên DNMT1 [14, 15], và RG108 [16, 17], một phân tử nhỏ, mới, gắn lên trung tâm hoạt động của DNMT. Việc kết hợp chất ức chế đề acetyl hóa histone (histone deacetylases inhibitors HDACIs), ví dụ như TSA và phenylbutyrate [18], với chất ức chế DNMT là đặc -3- biệt hứa hẹn tính hiệu quả trong điều trị ung thư. Hơn nữa, việc mất biểu hiện của estrogen receptor (ER) bằng methyl hóa bất thường và biến đổi histone đã dẫn đến hệ quả là kháng antiestrogen – một liệu pháp trong chữa trị ung thư vú. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc kết hợp dùng 5-azacytidine với TSA có thể cảm ứng tái biểu hiện chức năng của ER, chính vì vậy làm tăng độ nhạy của những dòng tế bào ung thư vú trước đó thể hiện âm tính với ER trong liệu pháp tamoxifen [19, 20]. Kết hợp HDACIs, trastuzumab (Herceptin), một kháng thể đơn dòng từ người kháng lại HER2 đưa đến hiệu quả tác động trong đàn áp sự phát triển và cảm ứng apoptosis ở các dòng tế bào ung thư vú [21, 22]. Hơn nữa, việc kết hợp các thuốc epigenetic với các chất hóa trị liệu hay các chất ăn kiêng tự nhiên (natural dietary ingredients) cũng làm tăng hiệu quả điều trị. Một nghiên cứu tiền lâm sàng đã chỉ ra rằng 5-AzadC kết hợp với docetaxel (một chất kháng phân bào, dùng trong hóa trị liệu) có thể tăng hiệu quả chống tế bào ung thư, thử nghiệm tiến hành trên các dòng tế bào ung thư vú [23]. 5-AzadC kết hợp với một chất khác, amsacrine hay idarubicin cũng cho thấy hiệu quả điều trị. Polyphenol trà xanh, (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), có thể là nguyên nhân dẫn đến tái mô hình hóa cấu trúc sợi chromatin của vùng promoter ERα bằng việc thay đổi tình trạng acetyl hóa histone và methyl hóa, và chính vì vậy, hệ quả là tái hoạt hóa ERα. Kết hợp TSA, EGCG dẫn đến tái hoạt động của rất nhiều gen đè nén u bằng sự ức chế trực tiếp hay gián tiếp hoạt động DNMTs [24]. Dietary sulforaphane (SFN) [25], một chất ức chế đề acetyl hóa histone, ức chế rất hiệu quả tính sống và tăng sinh của các tế bào ung thư vú nhưng không ảnh hưởng đến tế bào bình thường. Chính vì vậy, các liệu pháp kết hợp đề methyl hóa là rất hứa hẹn trong điều trị ung thư vú. Ví dụ thử nghiệm lâm sàng kết hợp trastuzumab với HDACI trong điều trị ung thư vú [26], và thử nghiệm mức phase II trong ung thư vú - kết hợp valproic acid (VPA) với FEC100 (5fluorouracil, epirubicin, và cyclophosphamide) cũng đang được tiến hành [27]. I.2. TỔNG QUAN VỀ GEN p16INK4a I.2.1. Cấu trúc và chức năng Gen CDKN2A (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) nằm trên vùng 9p12 của nhiễm sắc thể số 9 thuộc bộ gen người, mã hóa cho hai protein p16 (p16INK4a) có trọng lượng phân tử 16 kDa, và p14 (p14ARF) [28]. Trong đó, gen p16INK4a có ba exon 1α, 2 và 3, đóng vai trò chính trong các con đường điều hòa chu trình tế bào với chức năng điều hòa âm tính chu trình tế bào thông qua sự ức chế các CDK (cyclin dependent kinase) tương tác với cyclin D1 [28]. Sự biểu hiện của gen p16INK4a liên quan tới quá trình lão hóa của tế bào, khi càng lớn tuổi -4- thì nồng độ của p16INK4a càng cao. p16INK4a có khả năng chi phối quá trình lão hóa bằng giới hạn sự tự làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi. CDK và cyclin là hai nhóm protein có vai trò quan trọng tại các điểm kiểm soát chu trình tế bào [29]. Khi không có mặt p16INK4a, CDK cùng cyclin tạo phức hợp cyclin/CDK thực hiện quá trình phosphoryl hóa pRb (protein Retinoblastoma). Bình thường, pRb không bị phosphoryl hóa sẽ liên kết với nhân tố phiên mã E2F [30]. Khi bị phosphoryl hóa pRb sẽ mất liên kết với E2F, E2F được tự do sẽ kích hoạt các gen sao chép DNA thúc đẩy chu trình tế bào đi qua điểm kiểm soát G1/S. Tuy nhiên, khi qua điểm kiểm soát này nếu phát hiện DNA hư hỏng, chu trình tế bào sẽ tạm dừng để sửa chữa DNA. Quá trình tạm ngưng này được thực kiện nhờ sự tương tác của p16INK4a với các thành phần CDK4/CDK6 cản trở sự tạo thành phức hợp cyclin/CDK, dẫn tới ức chế quá trình phosphoryl hóa của pRb và không tách rời E2F, quá trình sao chép DNA không diễn ra, chu trình tế bào ngưng lại tại điểm kiểm soát G1/S, lúc này các gen chịu trách nhiệm sửa chữa DNA hư hỏng sẽ làm việc [31, 32]. Như vậy, khi p16INK4a bị bất hoạt sẽ làm cho chu trình tế bào bị xáo trộn, các tế bào sao chép không kiểm soát đến một lúc nào đó sẽ dẫn đến ung thư. I.2.2. Sự methyl hóa của p16INK4a trong ung thư Có thể thấy rằng sự xáo trộn chu trình tế bào đặc biệt do thiếu hụt chức năng của gen điều hòa trong con đường thiết yếu là pRb (pRb/p16INK4a/cyclin D1) là đích thường xuyên của các quá trình bệnh hóa ung thư, kể cả ung thư vú. Trong nhiều loại ung thư p16INK4a được tìm thấy ở trạng thái bị bất hoạt do hai nguyên nhân đột biến trên gen và biến đổi epigenetics [32]. Sự mất biểu hiện của p16INK4a thường do sự methyl vùng đảo CpG trong vùng 5’ không dịch mã tới vùng exon 1 của gen [33, 34]. Trong nghiên cứu của Krassenstein và cộng sự, tần số methyl của p16INK4a trong ung thư vú là 17% [35]. Theo một vài nghiên cứu, sự methyl hóa của gen p16INK4a là một sự kiện xảy ra sớm trong ung thư vú [36] và nhiều tác giả đều ghi nhận tính chất methyl hóa bất thường của gen p16INK4a có thể là một dấu chứng sinh học (biomarker) tiềm năng trong tiên đoán, chẩn đoán và theo dõi nguy cơ bệnh [34, 35, 36]. Các số liệu về mức độ methyl hóa bất thường trên gen p16INK4a dao động rất lớn từ 10-100% và là một đặc tính chỉ của tế bào ung thư [37] (Hình 1.2). Sự dao động này chủ yếu là do sự khác nhau về địa lý thu nhận mẫu, cỡ mẫu và kể cả kỹ thuật dùng để đánh giá mức độ methyl hóa trên nhiều loại mẫu khác nhau. -5- 1-69 70-119 120-160 Hình 1.2: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16INK4a trong ung thư vú nói chung và phân chia theo các giai đoạn bệnh Chú thích: Ung thư vú (UTV), tế bào bình thường (TBT), mô cận kề khối u (MCK), tiền ung thư (TUT), ung thư và di căn (DC). Tâm các vòng tròn thể hiện tần số methyl hóa đã được báo cáo trong các nghiên cứu liên quan. Kích thước vòng tròn thể hiện số lượng mẫu trong nghiên cứu. Đường thẳng nằm ngang hiển thị tần số methyl hóa trung bình có trọng số dựa trên tất cả các nghiên cứu. I.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA Việc phân tích sự methyl hóa của DNA được tiến hành với bước đầu tiên là biến đổi DNA bộ gen bằng sodium bisulfite. Phản ứng xử lý DNA bằng sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt cystosine và cystosine methyl hóa (5mC) trong DNA. Dưới tác dụng của sodium bisulfite, tất cả các cystosine không bị methyl hóa sẽ bị chuyển hóa thành uracil (Hình 1.3), trong khi đó các cystosine methyl hóa không bị tác động và vẫn giữ nguyên cấu trúc [4, 38]. Như vậy, biến đổi sodium bisulfite sẽ cho biết sự thay đổi đặc biệt trên trình tự DNA và tình trạng methyl hóa cho đoạn gen. -6- Hình 1.3: Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil I.3.1. Phương pháp Methylation Specific PCR (MSP) Phương pháp MSP do Herman và cộng sự phát minh vào năm 1996, được sử dụng để phân tích nhanh tình trạng methyl hóa của các đảo CpG. MSP thực chất là một kĩ thuật cải biên dựa trên PCR có độ nhạy phát hiện đến 0,1% các alen bị methyl hóa của vùng đảo CpG khảo sát và đặc hiệu cho việc đánh giá sự methyl hóa của hầu như bất kì vị trí CpG thuộc đảo CpG [39]. MSP là phản ứng PCR tiến hành với mạch khuôn DNA đã biến đổi sodium bisulfite, khuếch đại bởi hai cặp mồi methyl và không methyl được thiết kế để phân biệt giữa các alen bị methyl hóa và không bị methyl hóa, cũng như để phân biệt giữa DNA đã biến đổi sodium bisulfite với DNA chưa bị biến đổi bằng hai phản ứng độc lập. Để đạt được các mục tiêu này thì các trình tự mồi cho phản ứng MSP thường thiết kế chứa nhiều cytosine và có các cặp CpG nằm gần vị trí 3’ của các mồi [39]. I.3.2. Phương pháp Nested Methylation Specific PCR (Nested-MSP) Một số công trình công bố gần đây về tình trạng methyl hóa dựa trên kĩ thuật Nested-MSP. Kỹ thuật này chứng tỏ được ưu thế do làm tăng độ nhạy và cả độ đặc hiệu trong mục tiêu xác định tình trạng methyl hóa của các đảo CpG lên rất nhiều qua hai lần MSP. Lần khuếch đại đầu tiên được thực hiện với cặp mồi ngoài, đa số được thiết kế nhằm khuếch đại cả allele methyl và allele không methyl, qua đó làm tăng số lượng trình tự đích. Lần khuếch đại thứ hai, thực chất là phản ứng MSP, phát hiện allele methyl hoặc không methyl hóa có trong mẫu ban đầu trong từng phản ứng riêng biệt, sử dụng sản phẩm khuếch đại lần thứ -7- nhất làm bản mẫu. Với nguyên lý thực hiện như vậy, ước tính độ nhạy của phản ứng lên khoảng 50 lần so với phương pháp MSP thông thường. Cụ thể phương pháp cải tiến này có thể giúp phát hiện được 1 allele methyl hóa trong 50,000 allele không methyl hóa [40, 41]. I.4. TÍNH CẤP THIẾT Ung thư vú là bệnh ung thư phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho phụ nữ ở nhiều nước trên thế giới. Theo Forouzanfar et al. (2011) [42], bệnh ung thư vú đã tăng từ 641.000 trường hợp ở năm 1980 đến 1.643.000 trường hợp ở năm 2010, với tỷ lệ tăng số trường hợp mắc bệnh là khoảng 3%. Bệnh ung thư vú gây tử vong khoảng 425.000 phụ nữ mỗi năm, bao gồm 68.000 trường hợp thuộc độ tuổi 15-49 ở các nước đang phát triển. Ước tính trong năm 2008, ung thư vú chiếm 23% (1,38 tỷ người bệnh) những trường hợp được phát hiện mới, 14% (485,400 trường hợp) bị tử vong. Khoảng ½ những trường hợp bị ung thư vú và 60% tử vong vì căn bệnh này đều xảy ra ở các nước đang phát triển [42]. Nhìn chung, bệnh ung thư vú có tỷ lệ cao ở vùng Bắc Âu, Úc và New Zealand, Bắc Mỹ; tiếp theo là vùng Nam Mỹ, Bắc Phi. Từ cuối thập niên 1980 đến thập niên 1990, bệnh ung thư vú có chiều hướng tăng cao ở các nước phát triển: Mỹ, Anh, Pháp, Úc. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư vú ở các nước phát triển đã giảm rất nhiều trong 25 năm qua, đó là kết quả của việc áp dụng các kỹ thuật mới vào trong việc chẩn đoán, phát hiện sớm và điều trị hiệu quả. Ngược lại, các nước thuộc châu Phi và vùng Đông Nam Á có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong gia tăng [42]. Ở Việt Nam, trong tổng số 100,000 Việt Nam, thì có khoảng 137 bệnh nhân nam và 94 bệnh nhân nữ bị ung thư hoặc tử vong. Năm 2010, có khoảng 5664 trường hợp ung thư vú với tỷ lệ 13,6 trường hợp trên 100.000 phụ nữ. Ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh thành phía nam, hàng năm có 26 trường hợp mới được phát hiện trên 100.000 phụ nữ. Bệnh ung thư vú phân bố theo độ tuổi bệnh nhân Việt Nam theo tỷ lệ 12,9% (40-50 tuổi), 27,7% (45-54 tuổi), 18,5% (55-64 tuổi) và tỷ lệ thấp nhất là 12,9% (trên 65 tuổi) [42]. Ung thư vú có thể phòng ngừa và chữa trị kịp thời nếu phát hiện ở giai đoạn sớm, điều này sẽ làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư ở phụ nữ. Do đó, việc tìm ra một dấu chứng sinh học phát hiện bệnh và các giai đoạn của bệnh là điều cấp thiết. Như đã đề cập ở trên, hiện tượng epigenetics thường xuất hiện từ rất sớm trong quá trình phát sinh nhiều loại ung thư. Đồng thời, sự methyl hóa quá mức ở các đảo CpG này cũng được tìm thấy phổ biến trong các mẫu mô giai đoạn đầu, các khối u được phẫu thuật cắt bỏ [1, 4, 5, 7]. Chính vì đặc điểm này, thông -8- tin methyl hóa đang được nghiên cứu nhằm hướng tới sử dụng chúng như một biomarker trong việc tiên đoán, chẩn đoán cũng như trong việc theo dõi nguy cơ sự hình thành và phát triển của khối u (risk assessment) [43]. Tuy nhiên, việc xuất hiện sớm trong các loại mẫu, cho nên có thể allele methyl hóa chỉ chiếm rất thấp trong quần thể DNA được sử dụng để tìm kiếm, nên rất dễ bỏ sót kết quả do hạn chế về độ nhạy của kĩ thuật. Bên cạnh đó, chúng tôi đang thực hiện nghiên cứu khảo sát tình trạng methyl hóa trên các gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, p16IN4a, GSTP1 ở các bệnh nhân ung thư vú bằng phương pháp MSP; kết quả ban đầu cho thấy có 7/27 mẫu hiện tượng methyl hóa xảy ra trên gen p16IN4a [44]. Tỉ lệ này là khá thấp so với các công bố trước, hơn nữa nguồn mẫu mà chúng tôi khảo sát là mẫu mô sinh thiết từ các bệnh nhân ung thư ở các giai đoạn trễ của bệnh. Chính vì vậy, việc có được một quy trình kĩ thuật với độ nhạy cao, đặc hiệu, giúp phát hiện chính xác allele bị methyl hóa dù hiện diện ở mức thấp là rất cần thiết. I.5. MỤC TIÊU Xây dựng quy trình Nested-MSP để khảo sát sự methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen p16INK4α; từ đó đánh giá mức độ nhạy cảm của phương pháp này so với phương pháp MSP thông thường áp dụng trên DNA các bệnh nhân ung thư vú ở người Việt Nam.