Tài liệu Xemtailieu nghien cuu quy trinh trich ly va khao sat hoat tinh sinh hoc cua hop chat anthocyanin tu dau den vigna cylindrica

ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----- ----- BÀI BÁO CÁO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TRÍCH LY VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HỢP CHẤT ANTHOCYANIN TỪ ĐẬU ĐEN (VIGNA CYLINDRICA) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thuỷ SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân MSSV: 1053010478 Khoá: 2010-2014 Bình Dương, tháng 5 năm 2014 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về vật chất cũng như về tinh thần để em có thể học tập tốt. Tiếp theo em xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè mà em có cơ hội được tiếp xúc và học hỏi,…trong suốt thời gian em ngồi trên ghế nhà trường, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học nói chung và các thầy cô chuyên ngành nói riêng. Trong khoảng thời gian bốn năm học tại trường dưới sự dạy dỗ, hướng dẫn tận tình của thầy cô, sự chia sẻ giúp đỡ của bạn bè,…đã giúp em có được những kiến thức, những kinh nghiệm và những kĩ năng vô cùng cần thiết để em trưởng thành hơn trong cuộc sống. Em xin chúc quý thầy cô cùng những người bạn thân thương dồi dào sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình đến cô Nguyễn Thị Lệ Thuỷ - là giảng viên khoa công nghệ sinh học, chuyên ngành thực phẩm và cũng là giảng viên hướng dẫn em thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp. Cô đã đồng hành, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chúc cô luôn khoẻ mạnh, hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công hơn. Cuối cùng em xin dành lời tri ân sâu sắc nhất đến ba, mẹ - người đã nuôi nấng, dạy dỗ, tạo mọi điều kiện cho con được học hỏi, được tiếp xúc với thế giới này. Con cầu mong ba, me luôn mạnh khoẻ, bình an và sống mãi với con để con có cơ hội được đền đáp công ơn to lớn của ba, mẹ. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... i DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ ii ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 1. Anthocyanin ......................................................................................................3 1.1 . Giới Thiệu Anthocyanin .................................................................................3 1.2 . Vai trò của các hơp chất Anthocyanin ........................................................... 15 1.3 . Một số nghiên cứu về Anthocyanin .............................................................. 17 2. Giới thiệu về đậu đen ...................................................................................... 18 2.1 . Đặc điểm thực vật ........................................................................................ 18 2.2 . Thành phần chất màu có trong đậu đen ......................................................... 21 3. Phương pháp trích ly ....................................................................................... 22 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 2. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 25 2.1 . Địa điểm nghiên cứu.................................................................................... 25 2.2 . Nguyên liệu .................................................................................................25 2.3 . Hoá chất sử dụng .......................................................................................... 25 2.4 . Dụng cụ và thiết bị sử dụng .......................................................................... 25 3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 27 3.1 . Quy trình trích ly Anthocyanin dự kiến ........................................................ 27 3.2 . Sơ đồ nghiên cứu quy trình trích ly Anthocyanin ......................................... 29 3.3 . Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 30 [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ 3.3.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch trích Anthocyanin................. 30 3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Anthocyanin ............. 31 3.3.3. Khảo sát hoạt tính sinh học ......................................................................... 38 3.3.4. Khảo sát một số đặc tính của Anthocyanin thô ............................................ 41 PHẦN III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ................................................................... 3.1. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch trích Anthocyanin ........ 43 3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly Anthocyanin .... 44 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................ 50 3.4. Khảo sát một số đặc tính của Anthocyanin thô ............................................... 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 61 PHỤ LỤC ............................................................................................................... i [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số Anthocyanin phổ biến ................................................................. 6 Bảng 1.2: Các Anthocyanin trong một số nguồn thực vật ..................................... 10 Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng hạt đậu đen trong 100g ăn được ...................... 21 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dung dịch acid đến trích ly .. 32 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến trích ly ...... 33 Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ dung môi (ml): nguyên liệu (g) đến trích ly .......................................................................................................................... 35 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến trích ly............. 36 Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến trích ly ........... 38 Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hoá........................................................... 40 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của dung dịch acid đến quá trình trích ly ............................ 44 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình trích ly ............................... 45 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và nguyên liệu đến khả năng trích ly Anthocyanin ......................................................................................................... 46 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Anthocyanin ................. 48 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Anthocyanin ............... 49 Bảng 3.6 : Hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích Anthocyanin.............................. 52 Bảng 3.7: Một số đặc tính của Anthocyanin thô. .................................................. 55 Bảng 3.8. Phần trăm màu còn lại theo thời gian ở 95oC – 1000C........................... 55 Bảng 3.9: Màu của Anthocyanin trong các pH khác nhau ..................................... 56 [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page i Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Anthocyanin ở dạng thường.................................................................... 3 Hình 1.2: Anthocyanin ở dạng trung tính .............................................................. 3 Hình 1.3: Các Anthocyanin phổ biến trong rau quả ................................................ 4 Hình 1.4: Khung sườn cơ bản của Anthocyanin ..................................................... 5 Hình 1.5: Cấu trúc chuyển hoá của Anthocyanin trong nước .................................. 7 Hình 1.6 : Cây đậu đen ......................................................................................... 19 Hình 1.7 : Hạt đậu đen ......................................................................................... 19 Hình 1.8 : Đậu đen (Vigna unguiculata ssp. cylindrica ) ...................................... 20 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình trích ly Anthocyanin .................................................... 27 Hình 2.2: Sơ đồ các giai đoạn nghiên cứu quy trình trích ly Anthocyanin ........... 30 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH .............................. 39 Hình 3.1: Đồ thị xác định bước sóng hấp phụ cực đại của dịch trích..................... 43 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn khả năng kháng oxy hoá ............................................ 50 Hình 3.3 : Khả năng kháng khuẩn của Anthocyanin thô đối với E.coli ................. 53 Hình 3.4: Khả năng kháng khuẩn của Anthocynin thô với B.subtilis ................... 54 Hình 3.5: Bột Anthocyanin thô............................................................................. 55 Hình 3.6: Màu của Anthocyanin theo pH ............................................................. 56 Hình 4.1 : Sơ đồ hoàn thiện quy trình trích ly Anthocyanin từ đậu đen ................ 59 [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page ii Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng những hợp chất thiên nhiên để chữa bệnh, làm thực phẩm, mỹ phẩm và nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và thảm thực vật đa dạng là nguồn cung cấp tài nguyên sinh học quý giá.Vì thế việc tìm hiểu, tách chiết các thành phần có lợi của các loài thực vật là điều cần thiết để góp phần vào việc khai thác và sử dụng có hiệu quả hơn. Hiện nay trên thế giới xu hướng nghiên cứu quay về các hợp chất thiên nhiên vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng. Anthocyanin là hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên, thuộc nhóm flavonoid, có màu đỏ, đỏ tía, tím... Chúng có mặt trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy trong các hoa quả, rau củ, hạt… như hoa bụt giấm, quả nho, dâu, bắp cải tím, gạo nếp than, gạo đỏ,…và cả trong các hạt học đậu như đậu đỏ, đậu đen. Anthocyanin ngày càng được quan tâm đầu tư nghiên cứu, chế biến và sản xuất bởi vì chúng không những có màu sắc tươi đẹp, khi tiêu thụ không gây tác hại xấu, an toàn cho sức khoẻ con người mà còn có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng kháng oxy hoá cao nhờ hạn chế sự hình thành các gốc tự do, tăng cường sức đề kháng, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng xạ….. Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrica thuộc họ đậu, Đông y thường gọi là hắc đại đậu hay ô đậu, thường dùng làm nguyên liệu cho các món ăn dân dã như xôi, chè,…Bên cạnh đó đậu đen không đơn thuần là một thực phẩm bình thường mà còn tác dụng phòng và chữa bệnh. Đặc biệt là lớp vỏ bên ngoài có chứa hàm lượng chất chống oxy hoá cao hơn nhiều so với các loại đậu khác và gấp 10 lần so với cam. Các thuộc tính chống oxy hóa mạnh của đậu đen chủ yếu là do nồng độ cao của chất Anthocyanin như delphinidin, petunidin, malvidin . [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 1 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Ở nước ta, vùng trồng đậu đen phân bố rất rộng từ Bắc vào Nam với diện tích đáng kể. Tuy vậy, đậu đen chỉ được sử dụng chế biến trong các món ăn thông thường hàng ngày. Do vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình trích ly và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất Anthocyanin từ Đậu đen (Vigna cylindrica)” để tận dụng các hoạt tính sinh học quý có trong hạt đậu đen, nâng cao giá trị thương mại của hạt đậu đen nhằm mang lại lợi ích cho người nông dân cũng như cung cấp một nguồn chất màu có nguồn gốc tự nhiên, an toàn cho sức khoẻ người tiêu dùng. Mục tiêu đề tài: o Xây dựng quy trình tách chiết, thu nhận chất màu Anthocyanin từ hạt đậu đen trong phòng thí nghiệm. o Khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hoá của Anthocyanin thu từ dịch trích. Nội dung nghiên cứu: o Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của dịch trích Anthocyanin. o Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của quá trình trích ly Anthocyanin: hệ dung môi (nước và các loại acid), nồng độ cồn, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly. o Khảo sát hoạt tính sinh học: khả năng kháng oxy hoá, khả năng kháng khuẩn. o Khảo sát một số đặc tính của Anthocynain thô: độ ẩm, độ bền màu, hàm lượng polyphenol, ảnh hưởng của pH [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] đến màu sắc Anthocyanin. Page 2 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ 1. ANTHOCYANIN 1.1. Giới Thiệu Anthocyanin[7] Anthocyanin hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật. Thuật ngữ Anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rưc rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Các Anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi Anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng Anthocyanin lớn hơn Anthocyanidin từ 15-20 lần. 1.1.1. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin [7,12,14] Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nước và chứa trong các không bào. Về bản chất, các Anthocyanin là những hợp chất glycoside của các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của muối flavylium hoặc 2-phenylbenzopyrylium. Tất cả Anthocyanindin đều có chứa vòng pyran oxy hoá trị tự do. Tuy nhiên người ta chưa biết được chắc chắn nguyên tử nào: oxy hay cacbon mang điện tích dương tự do. Do đó Anthocyanindin thường được biểu diễn dưới dạng công thức trung tính. Hình 1.1: Anthocyanin ở dạng thường Hình 1.2: Anthocyanin ở dạng trung tính [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 3 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Nhờ điện tích dương tự do này mà các Anthocyanindin trong dung dịch acid tác dụng với những cation và tạo muối được với các acid. Còn trong dung dịch kiềm thì Anthocyanindin lại tác dụng như anion và tạo muối được với base. Cho đến nay, người ta đã xác định được 18 loại aglycon khác nhau, trong đó 6 loại phổ biến nhất là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin và maldivin. Hình 1.3: Các Anthocyanin phổ biến trong rau quả Trong tự nhiên, Anthocyanin rất hiếm khi ở trạng thái tự do (không bị glycosyl hóa). Nhóm hydroxy tự do ở vị trí C-3 làm cho phân tử Anthocyanidin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với Anthocyanin tương ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxy. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 4 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Nếu có thêm một phân tử đường nữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-5. Ngoài ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C-7, C-3’, C-5’. Loại đường phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài loại monosaccharide (như galactose, rammose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu là rutinose, sambubiose hay sophorose) hoặc trisaccharide tham gia vào quá trình glycosyl hóa. Sự methoxyl hóa các Anthocyanin và các glucoside tương ứng diễn ra thông thường nhất là ở vị trí C-3’ và C-5’, cũng có thể gặp ở vị trí C-7 và C-5. Tuy nhiên cho đến nay người ta vẫn chưa tìm thấy môt hợp chất nào bị glycosyl hóa hay bị methoxyl hóa trên tất cả các vị trí C-3, C-5, C-7 và C-4’ do cần thiết phải còn ít nhất một nhóm hydroxyl tự do ở C-5, C-7 hay C-4’ để hình thành dạng cấu trúc quinonoidal base (dạng cấu trúc của Anthocyanin thường tồn tại trong không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5). Hình 1.4: Khung sườn cơ bản của Anthocyanin Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C-3 của phân tử đường hay ester hóa ở nhóm hydroxy C-6. Các nhóm acyl hóa chính là các acid phenolic như caffeic, ρ-coumeric, ferulic hay acid sinapic và một loạt các acid như acetic, malic, malonic, axalic và succinic. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 5 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ 1.1.2. Tính chất của Anthocyanin [7,11] Nói chung các Anthocyanin, hoà tan tốt trong nước và trong dịch bão hoà. Khi kết hợp với đường làm cho phân tử Anthocyanin càng hoà tan hơn. Màu sắc của Anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác… Khi tăng số lượng nhóm OH - trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm (trong vòng benzen có thể có 1-2 hoặc 3 nhóm OH-). Bảng 1.1: Một số Anthocyanin phổ biến Anthocyanin Đường Có ở cây Pelargoin Hai glucoza Cúc tây, mỏ cò Xianin Hai glucoza Hoa hồng Ceraxinanin Glucoza, Ramnoza Quả anh đào Prunixianin Galactoza Quả mận Ldain Glucoza, Ramnoza Quả việt quất Malvin Hai glucoza Hoa cẩm quỳ Peonin Glucoza Hoa mẫu đơn Enin Hai glucoza Quả nho Hirxutin Hoa anh thảo, hoa ngọc trâm (Nguồn: Lê Ngọc Tú, 2005) [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 6 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Mức độ methyl hoá các nhóm OH - trong vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH- ở vị trí thứ ba kết hợp với gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít. Các Anthocyanin cũng có thể tạo phức với các kim loại để cho ra các màu khác nhau: chẳng hạn muối kali sẽ cho với Anthocyanin màu đỏ máu, còn muối canxi và magie sẽ cho với Anthocyanin phức có màu xanh ve. Hoặc người ta cũng thấy Phúc Bồn Tử Đen sẽ chuyển sang màu xanh, còn Anh Đào sẽ chuyển sang màu tím khi có mặt thiếc, Anh Đào cũng chuyển sang màu tím khi có mặt nhôm, nhưng nhôm lại không ảnh hưởng đến màu sắc của Nho đỏ. Các Anthocyanin của Nho chỉ thay đổi đáng kể khi có mặt Fe, Sn, hoặc Cu. Điểm đáng chú ý là màu sắc của Anthocyanin phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường. Hình 1.5: Cấu trúc chuyển hoá của Anthocyanin trong nước [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 7 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Thông thường: Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh. Khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ. Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ. Ở pH = 4÷5 chúng có thể chuyển về dạng base cacbinol hay base chalcon không màu. Ở pH = 7÷8 lại về dạng base quinoidal anhydro màu xanh. Chẳng hạn rubrobraxindin clorua của Anthocyanin của bắp cải đỏ là một triglucozit của Anthocyanindin. Khi: pH = 2,4 – 4,0 thì có màu đỏ thắm. pH = 4 – 6 thì có màu tím. pH = 6 thì có màu xanh lam. pH là kiềm thì có màu xanh lá cây. Hoặc xianin có trong hoa hồng màu sắc thay đổi khi pH của dịch bào thay đổi. Các màu sắc khác nhau của hoa có được là do tổ hợp các Anthocyanindin và các este metylic của chúng với acid và base. 1.1.3. Đặc tính quang phổ của Anthocyanin[9] Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510÷540nm. Màu của Anthocyanin tạo ra từ màu tím đến màu xanh của nhiều loại quả. Độ hấp thụ Anthocyanin phụ thuộc vào dung môi, pH của dung dịch, nồng độ Anthocyanin. Thông thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh. Độ hấp thụ thể hiện bản chất của mỗi Anthocyanin do khả năng hấp thụ khác nhau của chúng. Độ hấp thụ liên quan mật thiết đến màu sắc của các Anthocyanin. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 8 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ 1.1.4. Sự phân bố của Anthocyanin[13,14,15] Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa. Trong tự nhiên Anthocyanin có mặt trong 80% sắc tố lá, 69% trái cây và 50% hoa. Trong những loại thưc vật này, Anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì. Sự phân bố của sáu Anthocyanidins phổ biến nhất trong các phần ăn được của thực vật là cyanidin (50%), pelargonidin (12%), peonidin (12%), delphinidin (12%), petunidin (7%) và malvidin (7%). Bốn loại sau đây của Anthocyanidin glycoside là phổ biến: 3 monosides, 3 biosides, 3,5-diglycosides và 3,7-diglycosides. Số lượng các 3–glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glucoside. Loại Anthocyanin hay gặp nhất chính là Cyaidin-3-glucoside. Các hợp chất Anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberlake, 1996). Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo,…) là các nguồn Anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác như solanceae ( cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất) và brassicaceae (bắp cải tím). [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 9 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Bảng 1.2: Các Anthocyanin trong một số nguồn thực vật Tên thực vật Tên thông Loại Anthocyanin thường Allium cepa Củ hành đỏ Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3-diglucoside và 3laminarriobioside, Pn-3-glucoside Brassica oleraea Bắp cải tím (red cabbage) Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa với malonoyl, ρ-coumaroyl, di-ρ-coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl Fragaria spp Dâu tây (strawberry) Pg và Cy-3-glucoside Glycine maxima Đậu nành (vỏ) Cy và Dp-3-glucoside Hibicus sabdariffa L Hoa bụt dấm Cy, Pn, mono- và biosides Raphanus sativus Củ cải đỏ (rễ) Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside ở dạng tự do và dạng acyl hóa Malus pumila Táo (apple) Cyanidin-3-galactoside Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl hóa với ρ-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl. Cyd-3-glucose, Cy-3-arabinose, Cy-3-xylose Prunus persica Đào Cyanidin-3-glucoside Sambucus nigra Cơm cháy Cyanidin-3-glucoside, Cyani di n-3-sambubiose Cyd-3-sambubiose-5-glucose Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt = petunidin, Mv= malvidin (Nguồn: Ronald E. Wroistad, May 1993) [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 10 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ 1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ màu của Anthocyanin [9] So với đa số các chất màu thiên nhiên, Anthocyanin là chất màu có độ bền kém hơn nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể phân hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng với những sản phẩm không tan. Sự phân hủy Anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế chúng đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Độ bền của các Anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học của Anthocyanin, pH, nhiệt độ, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính.  Cấu trúc Độ bền màu và cường độ màu của các Anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số nhóm hydroxyl trong vòng Benzen tăng thì bước sóng hấp thu cực đại ở vùng thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương. Khi nhóm methoxyl thay thế nhóm hydroxyl thì ta thu được kết quả ngược lại. Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các Anthocyanin sẽ giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa sẽ thu được kết quả ngược lại. Các Anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh. Sự glycol hóa những nhóm OH- tự do làm tăng tính bền của Anthocyanin. Vì vậy, các diglucoside bền hơn các monogluside của cùng một Anthocyanin. Anthocyanin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như ternatin, platyconin, cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong Anthocyanin và acid vòng thơm. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 11 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ  pH Khi pH thay đổi làm cho cấu trúc của Anthocyanin thay đổi từ đó dẫn tới sự thay đổi màu sắc. Do trên gốc aglycon có mang điện tích dương nên các Anthocynin có khả năng nhận H+ hoặc OH- nên làm thay đổi màu sắc Anthocynin, khi tăng nhóm OH- màu của anthocynin chuyển theo hướng sắc màu xanh.  Nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ thì tốc độ phân huỷ Anthocyanin tăng. Đối với Anthocyanin – 3- glucoside khi nhiệt độ tăng sẽ cắt đứt liên kết Anthocyanin – 3glucoside tạo thành các gốc aglycon, gốc aglycon là một gốc kém bền nhiệt nên màu của Anthocyanin giảm dần.  Oxy Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của Anthocyanin, do đó mà sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Chính sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase đã gây ra sự kết tủa và đóng váng trong nước trái cây. Trong quá trình đun nóng các Anthocyanin bị oxy hóa mãnh liệt. Oxy và nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đặc biệt nhất trong nước ép của blueberry (việt quất), cherry (anh đào), nho, raspberry (mâm xôi) và dâu.  Enzyme Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu Anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là Anthocyanase. Dựa vào đặc tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm, glycosidase và polyphenol oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal). [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 12 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin tạo ra đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của catechol (1,2-dihydroxybenzen). Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên Anthocyanin với sự có mặt của Odiphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp. Theo Gromeck và Markakis, sự thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy Anthocyanin. Tốc độ phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng benzen và mức độ glycosyl hóa.  Ánh sáng Các Anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được và các nguồn khúc xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến Anthocyanin: Tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp. Xúc tiến sự biến tính của chúng. Năm 1964, Siegenman cho rằng những quả táo giống đỏ sẽ chuyển sang màu xanh khi để trong bóng tối. Năm 1968 Vanburen và các cộng sự tường trình rằng các diglucoside được acyl hóa và methyl hóa thì các Anthocyanin trong rượu bền nhất khi để ngoài ánh sáng, các diglucoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglucoside là kém bền nhất, năm 1975 Palamidis và Markakis đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình phân hủy Anthocyanin trong nước giải khát có CO2 được phối màu với Anthocyanin từ xác nho.  Đường và các sản phẩm biến tính Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các Anthocyanin, trong đó fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả năng phân hủy Anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose, và maltose. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 13 Báo cáo khoá luận tốt nghiệp GVHD: Th.S: Nguyễn Thị Lệ Thuỷ Tốc độ phân hủy của Anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfura l,5–hydroxymethyl furfural và acctaldehyde thu được từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các Anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các Anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm.  Các ion kim loại Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các Anthocyanin có nhóm OH- ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi kim loại tiếp xúc với Anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm.  Sunphurdioxide (SO2) Các Anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thực phẩm có chứa Anthocyanin bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500 – 2000 ppm) làm mất màu các anthocynin của chúng trước khi chế biến. Chúng được disunfit hóa và màu Anthocyanin được phục hồi. SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme của Anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng. Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với lượng lớn SO2 (0.8 – 1.5%) và soda (0.4 – 1.0%) được dùng trong quá trình tẩy quả. [SVTH: Nguyễn Thị Kim Ngân-1053010478] Page 14