BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN VẬT LÝ
PHẠM MINH TÂN
CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT
QUANG CỦA HẠT NANO SILICA
CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ
HÀ NỘI, NĂM 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN VẬT LÝ
PHẠM MINH TÂN
CHẾ TẠO VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT
QUANG CỦA HẠT NANO SILICA
CHỨA TÂM MÀU VÀ THỬ NGHIỆM
ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH DẤU Y - SINH
CHUYÊN NGÀNH: VẬT LÝ CHẤT RẮN
MÃ SỐ: 62 44 01 04
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRẦN HỒNG NHUNG
2. PGS.TS. TỐNG KIM THUẦN
HÀ NỘI, NĂM 2015
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới
PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần, những người thầy luôn
tận tụy hết lòng hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong thời gian tôi học tập
và nghiên cứu ở Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Hồng Nhung đã
luôn giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần, tạo mọi điều kiện cho tôi có cơ hội học
tập, trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu ở trong và ngoài nước.
Tôi xin chân thành cảm ơn: TS. Nghiêm Thị Hà Liên, TS. Vũ Thị Thùy
Dương, CN. Trần Anh Đức, ThS. Nguyễn Thị Vân, ThS. Trần Thu Trang, ThS.
Nguyễn Thị Thùy, PGS.TS. Đỗ Quang Hòa, TS. Vũ Dương, TS. Phạm Long và các
bạn đồng nghiệp trong nhóm NanoBiophotonics đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá
trình làm thực nghiệm và các trao đổi khoa học trong suốt quãng thời gian tôi học
tập, nghiên cứu ở Viện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện
Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện
để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình. Tôi xin cảm ơn NCS. Nguyễn Đình
Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo quang
học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang
Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tôi
trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo và bạn đồng
nghiệp trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. Đặc biệt, xin chân thành
cảm ơn các thầy cô và bạn đồng nghiệp trong Phòng Đào tạo, các thầy cô, các bạn
đồng nghiệp và các em sinh viên Khoa Vật lý và Công nghệ, trường Đại học Khoa
học, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về thời gian, vật chất và động viên
tôi để tôi có thể hoàn thành được luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô, chú,
anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Điện tử học Lượng tử, Viện Vật lý.
Cuối cùng, tôi xin dành những lời cảm ơn sâu nặng nhất đến những người
thân thương trong gia đình tôi: Bố, mẹ, vợ, con, các anh chị em và các cháu đã dành
cho tôi những tình cảm, động viên, chia sẻ cho tôi rất nhiều trong những năm tháng
làm việc vất vả này.
Phạm Minh Tân
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của PSG.TS. Trần Hồng Nhung và PGS.TS. Tống Kim Thuần. Các kết quả, số
liệu trong luận án là trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Phạm Minh Tân
Luận án được hoàn thành bởi kinh phí của đề tài NAFOSTED
Mã số: 103.06.101.09
Và đề tài cấp Nhà nước
Mã số: 01/2/2011/HĐ-NCCBUD
MỤC LỤC
Tiêu đề
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN………………………..…… i
DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………....……iii
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ………………………………….....…v
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN .................................. 10
1.1. Chất màu hữu cơ .............................................................................................. 10
1.1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 10
1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học ............................ 11
1.1.3. Quang phổ của chất màu .............................................................................. 13
1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ ........................................... 15
1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ ...................................................................... 16
1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường .......................................................................... 17
1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi........................................................................... 17
1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu ......................................................................... 18
1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ....................................................... 18
1.2.1. Các hạt nano silica và latex .......................................................................... 18
1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil .......................................................................... 19
1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ........................ 20
1.2.3.1. Phương pháp Stober ............................................................................
20
1.2.3.2. Các phương pháp micelle ....................................................................
21
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý ...............................................................................
22
1.2.4.1. Vật liệu nền ..........................................................................................
22
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang .....................................................................
23
1.2.4.3. Thế Zeta................................................................................................
24
1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh ......................................................................... 26
1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh ............................................
1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học ..........................
26
27
1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học.......................................... 31
1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) ........... 31
1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học ................................. 31
1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy .............................................................................. 32
1.1.6.4. Phân tích đa kênh ...................................................................................... 32
1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm................................. 33
1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) ..................................................... 34
1.2.6.7. Vận chuyển thuốc ...................................................................................... 35
1.3. Các đối tượng sinh học .................................................................................... 36
1.3.1. Protein ........................................................................................................... 36
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) ........................................ 36
1.3.3. Strepavidin (SA) ........................................................................................... 37
1.3.4. Kháng thể ...................................................................................................... 37
1.3.5. Kháng nguyên ............................................................................................... 38
1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 39
1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) ............ 39
1.3.7.1. Khái niệm................................................................................................... 39
1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể .............................................. 39
1.4. Kết luận chương 1 ........................................................................................... 40
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................. 41
2.1. Các thí nghiệm chế tạo .................................................................................... 41
2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng
41
phương pháp micelle thuận ....................................................................................
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB .................. 41
2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein............................................................... 46
2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý ....................................... 49
2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
50
micelle đảo ..............................................................................................................
2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với
50
APTES .....................................................................................................................
2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC ............................................ 51
2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
53
Stober ......................................................................................................................
2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng
53
xúc tác lên kích thước hạt .......................................................................................
2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC ................................... 54
2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu .............................................. 55
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt .................................. 55
2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................................................ 56
2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................. 56
2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)
56
xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta ........................
2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation
57
Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán .......................
2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học ................ 59
2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý ......................................... 63
2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ ......................................................................... 63
2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang................................................................. 64
2.2.5.3. Hiệu suất lượng tử ..................................................................................... 65
2.2.5.4. Thời gian sống phát quang ........................................................................ 67
2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học .......................... 68
2.2.6.1. Kính hiển vi quang học .............................................................................. 68
2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy ......................................................... 70
2.3. Kết luận chương 2 ........................................................................................... 71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ........ 73
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề
73
mặt theo phương pháp micelle thuận .....................................................................
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt ............................................................................ 73
3.1.2. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 74
3.1.3. Đường kính thủy động học ........................................................................... 77
3.1.4. Các đặc trưng quang học .............................................................................. 80
3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang............................................................................ 80
3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang ..................................... 81
3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương
85
pháp micelle thuận ..................................................................................................
3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) .................................................. 86
3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano ........................ 88
3.2.2.1. Tính chất quang ......................................................................................... 88
3.2.2.2. Độ phân cực huỳnh quang ......................................................................... 92
3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp
93
FCS .........................................................................................................................
3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) ...... 95
3.3.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 95
3.3.2. Tính chất quang ............................................................................................ 96
3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) ............................ 98
3.4.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 98
3.4.2. Tính chất quang ............................................................................................ 98
3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước .................................................................... 98
3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS ......................... 99
3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo ...................... 100
3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với
100
APTES ....................................................................................................................
3.5.2. Tính chất quang ............................................................................................ 102
3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober .............................. 104
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt........................... 104
3.6.2. Tính chất quang ............................................................................................ 105
3.6.3. Chức năng hóa .............................................................................................. 107
3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2 ........................... 107
3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt ................................................ 108
3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH.......................... 110
3.7. Kết luận chương 3 ........................................................................................... 112
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU
114
SINH HỌC .............................................................................................................
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh .................. 114
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn
114
dịch huỳnh quang....................................................................................................
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 .......... 114
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli
114
O157 :H7 ................................................................................................................
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào ......................................................................................... 114
4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn ... 115
4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú .......................................................................... 115
4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...................................................................... 115
4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2
115
(SiO2RB@HER2) ....................................................................................................
4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào .......................................................................................... 115
4.1.2.4. Sử dụng phức hệ SiO2RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4
116
4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy ................................................... 116
4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 ............................................................. 116
4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2
116
(SiO2FITC@HER2) ................................................................................................
2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO2FITC@HER2 ....................... 116
4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch
117
huỳnh quang ...........................................................................................................
4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 117
4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi
119
khuẩn E. coli O157:H7 ...........................................................................................
4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú ............................................................................ 121
4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang ........................ 121
4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào ............... 124
4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC ........... 127
4.5. Kết luận chương 4 ........................................................................................... 127
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN
131
ÁN ..........................................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 133
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TRONG LUẬN ÁN
Ký hiệu
Giải nghĩa
φ
Kích thước hạt (đường kính)
τ
Thời gian sống huỳnh quang
∆λHQ
Độ bán rộng phổ huỳnh quang
∆λHT
Độ bán rộng phổ hấp thụ
λHQ
Đỉnh phổ huỳnh quang
λHT
Đỉnh phổ hấp thụ
APTES
Aminopropyltriethoxysilane
AOT
Aerosol-OT
BSA
Bovine serum albumin
C
Nồng độ (mol/l)
COOH
Nhóm carboxyl
CTMES
Chlorotrimethylsilane
DLS
Dynamic Light Scattering
DMSO
Dimethyl Sulfoxide
DNA
Deoxyribonucleic acid
DTOH
Dập tắt OH
E. coli
Escherichia coli
EDC
Ethylene dichloride
FCS
Fluorescence Correlation Spectroscopy
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
HĐBM
Hoạt động bề mặt
HSLT
Hiệu suất lượng tử
IHQ
Cường độ huỳnh quang
IHT
Cường độ hấp thụ
KT
Kháng thể
LSCM
Laser Scanning Confocal Microscope
MES
axit 2-(N-morpholino)etansulfonic
MTEOS
Methyl triethosyxilane
NP
Nano particles – các hạt nano
NH2
Nhóm amine
OH
Nhóm hydroxyl
Ormosil
Organically modifiled silicate
PEG
polyethylene glycol
PdI
Polydispertion Index
PDT
Photodynamic Therapy
Precursor
Tiền chất
PTTMEOS
3-(trimethoxysilyl)-1 propanthiol
Q
Hiệu suất lượng tử
R
Bán kính
R6G
Rhodamine 6G
RB
Rhodamine B
SA
Streptavidin
SEM
Scanning Electron Microscope
SH
Nhóm thiol
SiFITC
Hạt nano silica chứa FITC
SiRB
Hạt nano silica chứa RB
TCSPC
Time-correlated single photon counting
TEM
Transmission electron microscopy
TEOS
Tetraethyl orthosilicate
TGSPQ
Thời gian sống phát quang
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Độ ổn định của huyền phù theo thế Zeta ..........................................
25
Bảng 2.1. Thí nghiệm xác định lượng BSA đủ để bọc hạt ................................
47
Bảng 2.2. Dãy mẫu thay đổi nhóm chức năng ......... ........................................
49
Bảng 2.3. Dãy mẫu thay đổi kích thước hạt ......................................................
49
Bảng 2.4. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương
pháp micelle đảo ................................................................................................
52
Bảng 2.5. Thí nghiệm chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương
pháp Stober với lượng NH4OH thay đổi............................................................
54
Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt
nano silica với các nhóm chức khác nhau ......................................................... 79
Bảng 3.2. Các thông số về kích thước theo các phương pháp đo khác nhau ....
83
Bảng 3.3. Các thông số của các mẫu hạt nano silica kích thước khác nhau ....
87
Bảng 3.4. Tổng hợp các đặc trưng của chất màu RB trong nước và trong hạt
nano silica với kích thước khác nhau ................................................................
91
Bảng 3.5. Độ phân cực huỳnh quang của RB trong nước, trong ethanol và các 93
hạt nano kích thước khác nhau..........................................................................
Bảng 3.6. Tổng hợp kích thước và hệ số khuếch tán của hạt đo bằng các
phương pháp khác nhau ....................................................................................
95
Bảng 3.7. Kết quả đo DLS của các mẫu với hợp chất FITC@APTES với
lượng ethanol pha loãng khác nhau ..................................................................
101
Bảng 3.8. Kết quả đo DLS và TEM của các mẫu hạt nano silica chứa FITC
với các kích thước khác nhau chế tạo bằng phương pháp Stober.....................
105
Bảng 3.9. Các thông số của phổ hấp thụ và huỳnh quang................................
107
Bảng 3.10. Kết quả đo DLS và thế Zeta của các hạt nano silica có nhóm chức
NH2 được chế tạo bằng phương pháp Stober ....................................................
108
Bảng 3.11. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức NH2 ............................................................................................................
108
Bảng 3.12. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica được dập tắt
nhóm OH trên bề mặt ........................................................................................
109
Bảng 3.13. Kết quả đo DLS và thế Zeta của mẫu hạt nano silica có nhóm
chức COOH .......................................................................................................
111
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử màu RB và R6G ....................................................
10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của chất màu FITC ..............................................
11
Hình 1.3. Cấu trúc mức năng lượng và chuyển dời quang học của phân tử
màu ....................................................................................................................
12
Hình 1.4. Phổ hấp thụ và huỳnh quang của RB................................................
13
Hình 1.5. Sự phụ thuộc của hiệu suất huỳnh quang vào nồng độ ....................
16
Hình 1.6. Các cách phổ biến kết hợp tâm màu vào các hạt nano silica và latex
19
Hình 1.7. Sự phát xạ huỳnh quang của các hạt nano silica chứa các loại tâm
màu khác nhau ...................................................................................................
19
Hình 1.8. Các hệ micelle: Hệ micelle thuận (a) và Hệ micelle đảo (b) ...........
21
Hình 1.9. Ảnh SEM của các mẫu hạt silica đơn phân tán với các kích thước
khác nhau ...........................................................................................................
22
Hình 1.10. Tính chất của RuBpy pha trong hạt nano silica .............................
24
Hình 1.11. Biểu diễn thế Zeta của một hạt .......................................................
25
Hình 1.12. Các cách thường tiếp hợp phân tử sinh học với hạt nano ..............
28
Hình 1.13. Các cách gắn kết đồng hóa trị thông thường giữa phân tử sinh
học và hạt nano..................................................................................................
29
Hình 1.14. Mô tả cách gắn kết đặc hiệu của hạt nano silica với vi khuẩn lao
Mycobacterium ..................................................................................................
29
Hình 1.15. Hình ảnh các vi khuẩn E. coli .........................................................
31
Hình 1.16. Mô tả thí nghiệm đánh dấu DNA xem kẽ dựa vào gắn kết sinh học
với hạt nano silica .............................................................................................
32
Hình 1.17. Giản đồ phân tích đa kênh bằng hạt nano silica chứa hai loại tâm
màu với tỷ lệ nồng độ hai tâm màu khác nhau ..................................................
33
Hình 1.18. Nguyên tắc hoạt động của máy đếm dòng tế bào (flow cytometry)
35
Hình 1.19. Cấu trúc của một phân tử kháng thể...............................................
38
Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của các chất precursor và hoạt động bề mặt .......
42
Hình 2.2. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu RB có các nhóm chức
NH2, NH2+OH ...................................................................................................
43
Hình 2.3. Sơ đồ phản ứng loại bỏ nhóm OH trên bề mặt hạt NH2+OH ..........
44
Hình 2.4. Sơ đồ chế tạo hạt nano silica có các nhóm chức –OH và –SH ........
44
Hình 2.5. Phương trình phản ứng tạo nhóm –SH trên bề mặt hạt nano ..........
45
Hình 2.6. Cấu trúc phân tử SH – PEG – COOH ..............................................
45
Hình 2.7. Sơ đồ minh họa quá trình bọc BSA lên hạt nano silica ....................
46
Hình 2.8. Phương trình phản ứng tạo liên kết amide .......................................
48
Hình 2.9. Mô hình quá trình bọc SA bằng cách trực tiếp (a) và gián tiếp (b) .
48
Hình 2.10. Cấu trúc hóa học của TEOS (a), FITC (b) .....................................
50
Hình 2.11. Phản ứng giữa FITC và APTES .....................................................
51
Hình 2.12. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
micelle đảo .........................................................................................................
52
Hình 2.13. Phản ứng đồng trùng hợp của FITC@APTES với TEOS để tạo
liên kết hóa trị của chất màu trong hạt silica....................................................
52
Hình 2.14. Sơ đồ chế tạo hạt silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober .................................................................................................................
53
Hình 2.15. Phản ứng tạo nhóm chức NH2 trên bề mặt hạt nano ......................
54
Hình
2.16.
Cấu
trúc
hóa
học
của
Disodium
3-
[dihydroxy(oxido)silyl]propanoate (a) và phản ứng tạo nhóm chức COOH
trên bề mặt hạt nano (b) ....................................................................................
55
Hình 2.17. Các trạng thái năng lượng của phân tử hai nguyên tử....................
59
Hình 2.18. Phổ hấp thụ của RB và R6G ...........................................................
65
Hình 2.19. Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời
gian ....................................................................................................................
68
Hình 2.20. Sơ đồ nguyên lý hệ đếm Flow cell....................................................
71
Hình 3.1. Ảnh TEM của hạt nano SiO2-NH2&OH (a), SiO2-NH2 (b), SiO2COOH (c), SiO2-OH (d) và SiO2-SH (e)…………………………………………….
74
Hình 3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-NH2&OH.....................
74
Hình 3.3. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-NH2...............................
75
Hình 3.4. Phổ hấp thụ hồng ngoại của HS-PEG-COOH……………………...
76
Hình 3.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano SiO2-COOH...........................
76
Hình 3.6. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO2-OH………………
77
Hình 3.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của hạt nano silica SiO2-SH………………
77
Hình 3.8. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica
với các nhóm chức khác nhau............................................................................
80
Hình 3.9. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt
nano silica với các nhóm chức khác nhau..........................................................
80
Hình 3.10. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr/Γnr
(b)…………………………………………………………………………………………
82
Hình 3.11. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có nhóm chức khác
nhau………………………………………………………………………………………
84
Hình 3.12. Phân bố kích thước hạt theo cường độ của phương pháp DLS:
SiO2-NH2&OH (a), SiO2-NH2 (b), SiO2-COOH (c), SiO2-SH (d)………………..
85
Hình 3.13. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của các hạt nano silica
với các kích thước khác nhau............................................................................
88
Hình 3.14. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các hạt
nano silica với các kích thước khác nhau..........................................................
88
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nền silica lên cường độ huỳnh quang và HSLT các
mẫu......................................................................................................................
90
Hình 3.16. Mối liên hệ giữa TGSPQ và vận tốc HPKBX (a); HSLT và Γr/Γnr
(b)………………………………………………………………………………………..
92
Hình 3.17. Cường độ huỳnh quang theo các hướng của chất màu RB trong
nước (a), dung môi ethanol (b) và trong các hạt nano kích thước khác nhau
(c, d, e, f)………………………………………………………………………………..
92
Hình 3.18. Đường tương quan huỳnh quang của các mẫu có kích thước khác
nhau………………………………………………………………………………………
94
Hình 3.19. Kích thước các mẫu theo các phương pháp đo khác nhau………….
95
Hình 3.20. a) Ảnh SEM của các hạt nano silica SiOH2-OH trước khi bọc BSA
96
b) Ảnh TEM của các hạt nano silica SiOH2-OH sau khi bọc BSA….
Hình 3.21. a) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong nước
b) Phổ hấp thụ chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong PBS…………..
96
Hình 3.22. a) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong nước
b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH@BSA trong PBS……
97
Hình 3.23. a) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong nước
b) Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào lượng BSA trong PBS
Hình 3.24. Ảnh SEM của SiO2-OH@SA@BSA..................................................
97
98
Hình 3.25. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của SiO2-OH
bọc SA trong nước……………………………………………………………………..
99
Hình 3.26. a) Phổ huỳnh quang của SiO2-OH bọc SA trong PBS
b) Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của SiO2-OH bọc SA trong PBS…
99
Hình 3.27. Phổ hấp thụ (a), hấp thụ chuẩn hóa (b) của chất màu FITC tự do
và FITC@APTES. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ của FITC@APTES vào lượng
ethanol (c)………………………………………………………………………………. 101
Hình 3.28. Ảnh TEM của các hạt nano SiO2@FITC với FITC@APTES pha
trong môi trường ethanol bão hòa (a) và pha loãng 10 lần (b)…………………
102
Hình 3.29. Phổ hấp thụ chuẩn hóa của phân tử FITC tự do, hợp chất
FITC@APTES trong ethanol và FITC trong các hạt nano silica……………….
103
Hình 3.30. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và
trong các hạt nano silica……………………………………………………………… 103
Hình 3.31. Phổ huỳnh quang của hợp chất FITC@APTES với lượng ethanol
khác nhau……………………………………………………………………………….
103
Hình 3.32. Ảnh TEM của các hạt nano SiO2@FITC theo phương pháp
Stober................................................................................................................... 104
Hình 3.33. Phổ hấp thụ (a) và hấp thụ chuẩn hóa (b) của hợp chất
FITC@APTES trong ethanol và trong các hạt nano silica với các kích thước
khác nhau……………………………………………………………………………….. 106
Hình 3.34. Phổ huỳnh quang chuẩn hóa của chất màu FITC trong ethanol và
trong các hạt nano silica với các kích thước khác nhau………………………….
106
Hình 3.35. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
trong môi trường Tris………………………………………………………………….
110
Hình 3.36. Phổ huỳnh quang (a) và huỳnh quang chuẩn hóa (b) của các mẫu
hạt nano có nhóm chức năng COOH với lượng DDOS khác nhau……………... 112
Hình 4.1. Hình ảnh các tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7……………………….. 118
Hình 4.2. Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn đánh dấu bằng hạt nano
silica pha RB với các nồng độ vi khuẩn khác nhau………………………………..
119
Hình 4.3. a) Phổ huỳnh quang của các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 với
nồng độ khác nhau đánh dấu bằng hạt nano silica chứa tâm màu RB
b) Đường cường độ huỳnh quang theo số lượng vi khuẩn (đường màu đỏ) và
đường fit (màu xanh, Y = 0,008.X)…………………………………………………..
120
Hình 4.4. So sánh hai phương pháp phát hiện vi khuẩn: phương pháp đếm
khuẩn lạc (trái) và phương pháp phổ huỳnh quang (phải)……………………….
121
Hình 4.5. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ sống với phức hệ SiRB@HER2
(A) và với SiRB@BSA B)....................................................................................
122
Hình 4.6. Ảnh huỳnh quang tế bào HeLa sống ủ với phức hệ SiRB@HER2 (A)
và với SiRB@BSA (B).........................................................................................
122
Hình 4.7. Ảnh huỳnh quang tế bào KLP4 cố định ủ với phức hệ SiRB@HER.
123
Hình 4.8. Ảnh huỳnh quang kết hợp tế bào KPL4 và Hela cố định ủ với phức
hệ SiRB@HER2, nhuộm kháng thể 2-M488………………………………............. 123
Hình 4.9. Ảnh huỳnh quang tế bào KPL4 ủ với phức hệ SiRB@HER2 ở 4
khoảng thời gian khác nhau………………………………………………………….. 124
Hình 4.10. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1…………………………………..
125
Hình 4.11. Đối chứng tế bào HeLa:KPL4= 1:1…………………………………..
125
- Xem thêm -