Tài liệu Determination of protein content in foods with microwave digestion method by nessler′s colorimetry

中国卫生检验杂志 2009年 1 月 第 19卷 第 1期 　Chi ne s eJ our na lofHea l t hLab or at o r yTec hno l og y, J a n2009;Vol19　No1 97 【 化学测定方法 】 微波消解纳氏比色法测定食品中的蛋白质 顾立公 ( 南京市下关区疾病预防控制中心 , 南京 　 210011) [ 摘要 ] 　目的 : 建立一种用微波消解前处理 、纳氏比色法 测量食品中 蛋白含量 的检测方法 。 方 法 : 样品用 微波消解 法进 行前处理 , 用纳氏比色法进行蛋白质含量测定 。 结果 : 本方法在氮含量 0.02 ～ 5.0 mg/L范围内 线性良好 , 样品蛋 白质含 量在 3.19% ～ 66.20%之间的相对标 准偏差为 0.97% ～ 3.87%, 样 品加标回收率为 88% ～ 108%。 该法与凯 氏定氮法对 不同样品进行蛋白质含量 检测 , 无显著统计学差异 。 结论 : 该 方法操 作简单 、快速 、准 确 、灵 敏度高 、干 扰少 , 取得满 意结 果。 [ 关键词 ] 　微波消解 ; 纳氏比色法 ; 蛋白质 [ 中图分类号 ] 　O657.32　　　　[ 文献标识码 ] 　A　　　　[ 文章编号 ] 　 1004 -8685(2009)01 -0097 -02 De t e r mi nat i onofprot ei nc ont e nti nf oodswi t hmi c r owavedi ge s t i onme t ho dbyNes s l e r′ s Col or i met ry GuLi -go ng (Xi a g u a nCe n t e rf o rDi s e a s eCo n t r o la ndPr e v e nt i o n , Na nj i n g210011, Ch i n a ) [ Abs t r a c t ] 　Ob j e c t i v e : Toe s t a b l i s hame t h o df o rd e t e r mi na t i o no fpr o t e i nc o n t e nti nf o o dswi t hmi c r o wa v ed i g e s t i o no fs a mp l e s by Ne s s l e r ′s Co l o r i me t r y .Me t hod s :T he f o o ds wi t h mi c r o wa v ed i g e s t i o n me t h o d we r e de t e r mi n e d b y Ne s s l e r ′s Co l o r i me t r y .Re s ul t s : Th ec a l i b r a t i o nc ur v e swe r el i n e a ri nt h er a n g e so f0.02 ～ 5.0 mg/Lf o rNi t r o g e nc o nt e n t .TheRS D wa s 0.97% ～ 3.87% , wh e nPr o t e i nc o n t e n ti nt h es a mp l e swe r e3.19 % t o66.20% .Th es a mp l er e c o v e r i e sr a t e swe r e88% ～ 108%.Th e r ewa sn os i g n i f i c a ntdi f f e r e n c eb e t we e ns a mp l e so fd i f f e r e n tp r o t e i nc o nt e n td e t e r mi n e ds e pa r a t e l yb yt h i sme t ho da nd t h eKj e l d a h lme t h o d .Co nc l u s i on: Th i sme t h o di ss i mp l e , r a pi d, a c c u r a t ea nds e ns i t i v ea ndha sl o wi nt e r f e r e n c e . [ Ke ywor d s ] 　Mi c r o wa v ed i g e s t i o n;Ne s s l e r ′ sc o l o r i me t r y ;Pr o t e i n 　　蛋白质是食 品中 的重要 营养 成分 , 是 衡量 食品 质量 优劣 的主要卫生指标 之一 , 食 品中蛋 白质 的测 定通 常采 用凯 氏定 标准样品研究所 。 1.1.2.3　氨氮标准使用溶液 (10 μg/ml ): 临用时吸 取 10.0 ml 氮法 [ 1] , 该法稳定可靠 , 但 样品 消化 费时 , 操作 繁琐 。 应 用微 波消解样品 , 纳氏比色法测定食品 中蛋白 质含量 , 不但 节约了 大量的试剂 , 减轻了对环境的污染 和分析 人员的 毒害 , 还提高 氨氮标准溶液 (500 mg/L) 用纯水定容至 500 ml , 混匀 。 了效率 , 降低了劳 动强度 。 用本 方法 与国 标法 同时 测定 常见 食品样品 , 证明测定结果与法定方 法无显 著性差 异 , 且 具有操 吸取 1 ～ 5 ml液体样品于溶样杯中 , 干的样品需先用去离子水 作简单 , 消化速度快 , 试剂用量 少 , 空气污染少等优势 。 表 1进行样品消解 , 消 解后 样液 应为 清澈 的溶 液 , 放 冷后 , 定 容至 25 ～ 100 ml , 混匀备用 。 同时做试剂空白 。 1.2　实验方法 1.2.1　样品消解 [ 3] 　准确称 取 0.1 ～ 0.5 g混匀固 体样 品或 浸湿 , 加 5 ～ 8 ml硫酸 , 稍摇匀后加 1 ～ 2 ml30%过氧化氢 , 按 1　材料与方法 1.1　仪器及试 剂 1.1.1　仪器 　XT-9900型智能微波消解仪 ( 上海新拓微波溶 样测试技术有限公司 ); 聚 四氟乙 烯消解 罐 ;752N型紫 外可见 分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司 ); 纯水机 ( 艾科浦 )。 1.1.2　试剂 　硫酸 (AR)、30%过氧化氢 (AR), 实验用水均为 不含氮的纯水 。 1.1.2.1　纳氏试剂 [ 2] : 称取 100 g碘化 汞及 70 g碘化钾 , 溶 于少量纯水中 , 将此溶液缓 缓倾入 已冷却 的 500 ml氢 氧化钠 (320 g/L)中 , 并 不停 搅拌 , 然 后再 以纯 水稀 释至 1000 ml ,贮 表 1　样品消解程序 样品类别 称量 (g ) 豆浆 、牛奶 糖果 、保健品 奶粉 、蛋白质粉 1 ～ 5 ml 0. 2 ～ 0.5 0. 2 ～ 0.3 于棕色瓶中 , 用橡皮塞塞紧 , 避 光保存 。 1.1.2.2　氨氮标准溶液 (500 mg/L): 购自国 家环境保 护总局 螺旋藻片 [ 作者简介 ] 　顾立公 (1968 -), 男 , 本科 , 副主任 技师 , 主 要从事 理化检验工作 。 0. 1 ～ 0.2 消解步骤 、溶剂名称 压力值 加热时间 功率 及加入量(ml ) (MP a ) (s ) 1.H2SO4 5, H2 O2 2 (%) 0. 5 ～ 1.5 300 80 ～ 100 2.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 240 100 1.H2SO4 5, H2 O2 2 0. 5 ～ 1.5 360 60 ～ 100 2.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 360 100 1.H2SO4 5, H2 O2 2 0. 5 ～ 1.5 360 60 ～ 100 2.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 360 100 3.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 360 100 1.H2SO4 8, H2 O2 2 0. 5 ～ 1.5 420 60 ～ 100 2.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 360 100 3.H2O2 1 0. 5 ～ 1.5 360 100 中国卫生检验杂志 2009 年 1月 第 19卷 第 1 期 　Chi nes eJ o ur n alo fHe a l t hLa bo r a t or yTe ch nol o gy ,J an2009;Vo l19　No1 98 1.2.2　样品测定 　精 确吸 取样 品和 空白 消化 液 0.50 ml ,分 液) 回收试验 , 测得方法的回收率范围 88% ～ 108%(表 3)。 别于 50 ml比色管中 , 加适量 水后 , 再加 1.0 ml纳 氏试 剂 , 用 水定容 至 50 ml , 10 mi n后 于 420 nm波 长 , 以 空 白 作 参 比 , 1c m比色皿 , 比色定量 。 表 3　比色法回收率实验 样品 样品含氮量 (μg ) 加标量 (μg ) 加标测定值 (μg ) 回收率 (%) 蜂王浆 　 19.58 10 29.02 94.40 椰奶 　　 3.41 10 12.57 91.60 根据样品蛋白质 含量高低 , 适 当增减 取样量 或定容 体积 。 如遇在常温下需要长 时间反应的样 品 , 或 样品的 称量增 加 , 可 奶粉 　　 29.15 10 38.70 95.50 营养米粉 16.35 10 27.13 107.8 将准备好的样品 放置 过夜 , 或在 电热 板上 低温 稍加 热进 行预 处理 , 并不断摇动溶样杯 , 待 反应缓 和后再 进行微 波消解 。 过 纯牛奶 　 15.62 10 24.84 92.20 火腿肠 　 8.54 10 17.39 88.6 2　结果与讨论 2.1　样品消化 条件的控制 氧化氢可趁热缓慢加 入 , 并不断摇 动溶样 杯 , 可大大缩 短消化 时间 , 效果更理想 。 干的样品放入 溶样杯 后 , 需先用少 量去离 子水湿润 , 溶样杯内液体体积保 持在 7 ～ 15 ml , 液面太 低压力 上升缓慢 。 消解程 序中的第一档 , 功率可调至 60% ～ 80%, 第 二 、三档再调至 100%, 防止压力上冲 , 造成危险 。 2.2　线性范围 和检出限 2.5　两种方法测定结果比较 分别用微波消解纳氏比色 法和凯氏 定氮法 对 6种 样品测 定蛋白质含量 ( 表 4), 结果表 明 , 两种方 法对同 一样品 的测定 结果差异无显著性 (t =0.633, P>0.05)。 标 准曲线在 0.02 ～ 5.0 mg/L范围内线性关系良好 。 以浓 度为横 坐 标 , 吸 光 度 为 纵 坐 标 , 回 归 方 程 为 y=0.0348x样品 0.0061; 相关系数 r=0.9996; 检出限为 0.02 mg/L。 2.3　精密度试 验 取蛋白质含量不 同的 3 种样品 , 分别 称取 6 份平行 测定 , 按照微波消解纳 氏比 色法测 定蛋 白质 含量 , 测 定样 品蛋 白质 含量在 3.19% ～ 66.20% 之 间 的 相 对 标 准 偏 差 为 0.97% ～ 3.87%, 表明该方法的精密度良好 ( 表 2)。 测定值 (%) 1 椰奶 蜂王浆 奶粉 纯牛奶 营养米粉 火腿肠 比色法 (%) 1.98 4.31 24.36 3.18 14.49 3.73 国标法 (%) 1.93 4.34 24.52 3.20 14.13 3.66 3　结论 实验结果表明 , 微波消解纳氏比 色法具 有试剂 用量少 , 操 作简便 快速 、省时省 力等优 点 。 在碱性 条件下 , NH3 -N与纳 氏试剂反应生成的 黄色 化合 物稳 定 , 准确 度高 , 精密 度好 , 测 表 2　比色法精密度试验 样品 表 4　比色法与国标法测定食品中蛋白质结果比较 平均值 RSD (%) (%) 定结果无显著性差异 , 适合大批样品的测定 。 2 3 4 5 6 纯牛奶 　 3.15 3.18 3.17 3.19 3.20 3.24 3.19 0.97 火腿肠 　 4.01 3.66 3.84 3.76 3.61 3.69 3.76 3.87 [ 1] GB/T5009.5 -2003.食品卫生检验方法理化部分 ( 一 )[ S] . 螺旋藻片 65.82 66.51 65.16 67.12 65.38 67.23 66.20 1.33 [ 2] GB/T5750.5 -2006.生活饮用水标准检验方法 [ S] . [ 参考文献 ] [ 3] 蔡志斌 , 刘俩燕 , 刘丽 .微波消解技术在测定食品蛋白质含量中的 2.4　加标回收 试验 取蛋白质含 量 不同 的 3 种 样 品 , 进 行加 标 (氨氮 标 准溶 应用 [ J ] .中国卫生检验杂志 , 2006, 16(1):11. (收稿日期 :2008 -10 -28) (上接第 70页 ) 表 4　样品含量测定及回收率数据 加入标准量 加标总含量 回收率 (mg/L) (mg/L) (mg/L) (%) 甲苯 121 15 135.8 99.9 二甲基甲酰胺 38.2 50 86.9 98.5 二氯乙烷 95.4 50 141.6 97.4 丁酮 45.0 20 63.8 98.2 正己烷 46.8 15 60.1 97.2 名称 含量 3　结论 从上述结果 看出 , HP-I NNOWAX色 谱柱 对 以上 个 有机 物的分离效果良好 , 该法操作简 单 , 重 现性好 , 灵敏 度高 , 分析 周期短并能同时测定各种有毒有机物 。 [ 参考文献 ] [ 1] 齐敏 , 张立军 , 俞安复 .车间空气中笨系物 、正几烷 、酮类的气相色 谱同时测定方法 [ J ] .中国卫生检验杂志 , 2006, 16(2):196. [ 2] 叶艺娟 .气相色谱法同时测定 工作场所 中 6 种有 毒成分 [ J] .中 国卫生检验杂志 , 2008, 18(3):446. [ 3] GBZ/T160.工作场所空气有毒物质测定 [ S] . (收稿日期 :2008 -05 -19)