Tài liệu Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan hoàng thảo thạch hộc tía (dendrobium nobile lindl)​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC NAM NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA (DEDROBIUM NOBILE LINDL) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN NGỌC NAM NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA (DEDROBIUM NOBILE LINDL) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN Thái Nguyên - 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Hải Yến giảng viên Khoa Công nghệ sinh học đã rất nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ Phòng thí nghiệm sinh học Khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện về thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đề tài này. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm đề tài. Thái Nguyên, ngày … tháng …năm 2018 Học Viên Trần Ngọc Nam i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i MỤC LỤC .......................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. iv DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................................. vi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN ............................................................... 3 1.1.1. Phân loại và nguồn gốc ..................................................................................... 3 1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium).................................................................... 4 1.2. MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC .............................. 7 1.2.1. Lan Thạch hộc ................................................................................................... 7 1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme............................................ 9 1.2.3. Dendrobium officinale ...................................................................................... 9 1.2.4. Các Dendrobium khác ..................................................................................... 10 1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC ................................................ 10 1.3.1. Đặc điểm thực vật học ..................................................................................... 10 1.3.2. Thu hái và chế biến ......................................................................................... 11 1.3.3. Công dụng và thành phần hóa học .................................................................. 12 1.3.4. Các vị thuốc chứa thạch hộc ........................................................................... 13 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM ...... 16 1.4.1. Một số nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 16 1.4.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam ..................................................................... 17 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 19 2.1. VẬT LIỆU .............................................................................................................. 19 2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 19 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................ 19 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 20 2.2.1. Thu và xử lý mẫu ............................................................................................ 20 2.2.2. Khử trùng mẫu hạt đưa vào nuôi cấy .............................................................. 20 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 20 ii 2.2.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 21 2.2.5. Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................... 22 2.2.6. Các chỉ tiêu đánh giá ....................................................................................... 22 2.2.7. Xử lý số liệu .................................................................................................... 22 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23 3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU ............................................................................ 23 3.2. KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM ......................................................... 25 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tăng sinh protocorm ................. 25 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm 26 3.2.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát sinh chồi protocorm................. 28 3.2.4. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ protocorm ..... 29 3.3. KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO ............. 31 3.3.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc ........................ 31 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh nghiền đến sự phát triển chồi lan Thạch hộc .................................................................................................... 33 3.3.3. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc .......................... 35 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY ............................................ 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 42 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc....................................... 23 Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt lan Thạch hộc ................................................. 24 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng phát sinh Protocorm..... 26 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanh protocorm ............................................................................................................ 27 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng phát sinh chồi từ cụm protocorm .................................................................................................... 28 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm protocorm ............................................................................................................ 30 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển cụm chồi lan Thạch hộc ....... 31 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự phát triển lan Thạch hộc ...................................................................................... 33 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc...... 35 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển lan Thạch hộc 37 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây và hoa lan Thạch hộc ................................................................... 11 Hình 3.1. Hình ảnh mẫu thân lan thạch hộc sinh trưởng trên môi trường bổ sung BAP 1mg/l ........................................................................................................... 23 Hình 3.2. Hình ảnh protocorm phát sinh từ hạt Thạch hộc trong môi trường nuôi cấy sau 40 và 60 ngày ......................................................................................... 25 Hình 3.2. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau............................................................................................................. 26 Hình 3.3. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có bổ sung saccharose sau 8 tuần nuôi cấy............................................................................ 28 Hình 3.4. Chồi phát sinh từ cụm protocorm trong môi trường chứa 100ml/l nước dừa .............................................................................................................. 29 Hình 3.5. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm protocorm ............................................................................................................ 30 Hình 3.6. Ảnh hưởng của BAP tới sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc ............. 32 Hình 3.7. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự phát triển lan Thạch hộc ....34 Hình 3.8. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc ...... 35 Hình 3.9. Hình ảnh cây lan thạch hộc con sinh trưởng trên các loại giá thể khác nhau sau khi ra chai và huấn luyện tại vườn ươm .............................................. 37 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Tên đầy đủ Chữ viết tắt (ký hiệu) ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP 6 - Benzyl adenin purine EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - 3 - acetic acid IBA Indol - 3 - butyric acid Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - NAA α - Naphthalene acetic acid vi MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu dân gian đang trở thành vấn đề cấp thiết, do tình trạng khai thác bừa bãi, thiếu khoa học cũng như sự giảm nhanh diện tích rừng tự nhiên, điều đó đã và đang làm giảm trầm trọng nguồn cây thuốc trong tự nhiên trong đó bao gồm cả các loài lan làm thuốc, đại diện điển hình là dược liệu lan Thạch hộc thuộc chi lan Hoàng thảo. Trên thế giới, chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa. Tình trạng khai thác đến cạn kiệt hầu hết các loài phong lan rừng ở nước ta đang xảy ra mạnh, điển hình như vùng Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Yên Bái, Thái Nguyên... gây nguy cơ tuyệt chủng cao một số loài phong lan quý hiếm. Hoa Phong Lan không chỉ có tác dụng làm đẹp cho không gian sống mà còn là bài thuốc có tác dụng chữa bệnh thần kỳ. Trong đó có thể kể đến lan Kim tuyến được dùng trong điều trị các bệnh như trị đau bụng, sốt cao, rắn cắn, bệnh tiểu đường, bệnh viêm thận, huyết áp cao, yếu sinh lý, phòng ngừa u bướu và chữa các bệnh tim mạch; Lan Phi Điệp, Hoàng thảo đùi gà trị các chứng suy nhược cơ thể, thần kinh suy nhược, đau họng và yếu sinh lý ở nam giới. Lan Thạch hộc được dùng chữa ho lao, sốt nóng, khô cổ, ho, đau họng, khát nước thuộc chứng âm hư, nóng trong, đau lưng, chân tay nhức mỏi, ra mồ hôi trộm, thiểu năng sinh dục ở nam giới, di tinh, đau dạ dày, viêm ruột… Hiện nay, lan rừng đang bị khai thác cạn kiện do nhu cầu chơi hoa cũng như nhu cầu thu hái làm thuốc. Các thương lái Trung Quốc đã tràn sang các tỉnh phía bắc Việt Nam và săn lùng, thu mua số lượng lớn các loại lan có tác dụng làm thuốc. Vì vậy việc bảo tồn nguồn dược liệu tự nhiên là rất cần thiết. 1 Thông qua phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với hệ số nhân giống cao có thể tạo ra rất nhiều cây con in vitro đồng đều mang các đặc điểm ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp phần thực hiện công tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt hơn. Thêm vào đó, phương pháp nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thực vật có thể tạo ra các cây con sạch virus từ cây mẹ đã bị nhiễm bệnh (phục tráng giống cây trồng). Hơn nữa, nuôi cấy mô, tế bào còn cung cấp nguyên liệu cho việc tạo ra giống mới bằng công nghệ gen, lai soma, chọn dòng tế bào… mang các đặc điểm tốt như có hoạt tính sinh học cao, có khả năng kháng bệnh virus, chịu hạn, chịu các yếu tố bất lợi từ môi trường. Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)" 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho công tác bảo tồn và cung cấp giống lan Thạch hộc. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu đối với lan Thạch hộc. 2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình tái sinh chồi, sự phát triển chồi và ra rễ của lan Thạch hộc in vitro. 3. Nghiên cứu giá thể phù hợp để ra cây đối với lan Thạch hộc. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN 1.1.1. Phân loại và nguồn gốc Họ lan hay họ Phong lan (Orcchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (monocotylendons). Họ Phong lan là một trong những họ thực vật lớn nhất và phân bố khắp nơi trên thế giới. Phong lan chủ yếu mọc bám trên các cây cao trong rừng và ở các khu rừng nhiệt đới. Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất và được gọi là địa lan và có một số loài mọc trên đá tức thạch lan. Họ lan đã biết khoảng 28.000 loài tự nhiên và 100.000 lai ghép, 850 chi chiếm khoảng 10% của các loài thực vật có hoa. Danh sách dưới đây liệt kê sự phân bố của họ này: • Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi • Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi • Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi • Châu Đại Dương: 50 - 70 chi • Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi • Bắc Mỹ: 20 - 25 chi Ở Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng, bao gồm địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước . Theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia làm hai nhóm là nhóm cây đơn thân (monopodia) và nhóm cây đa thân (sympodia). (1) Thuộc nhóm cây đơn thân thì cây chỉ có một trụ phát triển duy nhất, lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa tới vài mét. (2) Thuộc nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến một kích thước nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát triển thay thế. Thân mầm phát triển từ mắt cây. Các mắt cây phát triển đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ 3 phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ gốc ban đầu [6]. 1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) a. Phân loại chi lan Hoàng thảo Chi lan Hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium thuộc họ thực vật Orchidacea, là một chi hoa rất lớn bao gồm trên 1500 loài, sinh sống tự nhiên trong một khu vực trải rộng từ Triều Tiên, Nhật xuống Mã Lai, Indonesia, đến Úc và New Zealand. Dendrobium là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở các vùng châu Úc, châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan Dendrobium là một họ lan nhiều sắc thái bao gồm cả những loài rụng lá và loài có lá xanh quanh năm. Đa số lan tự nhiên thuộc loài cộng sinh, sống bám trên cây hoặc trên đá, có những giả hành dài từ vài cm (D. leucocyanum) đến vài thước (D. discolor), thân gầy, uốn cong khi phát triển hoặc mập mạp và đứng thẳng. Lan Dendrobium có thể có lá thon nhỏ, mọc chéo theo suốt chiều dài của thân. Lá nơi gốc có thể mọc bao kín chồi.Cần hoa cũng dài hay ngắn khác nhau, từ vài cm đến 1m. Cây mang từ 1-4 hoa (D. nobile) nhưng cũng có thể đến cả 100 hoa (D. speciosum). Những cây rụng lá, thường mất lá sau 1-2 năm và hoa mọc ra từ các thân trơ trụi, trong khi đó những cây không rụng lá thường trổ hoa từ thân sau khoảng 1 năm và tiếp tục ra hoa trong nhiều năm kế tiếp. Do sự đa dạng nên các nhà sưu tập và trồng Dendrobium đã tạm phân loại chúng dựa theo một số điểm tương đồng, về cách sống, mùa nghỉ và mùa hoa. Một số nhóm tiêu biểu như: (1) Callista : Không rụng lá, đa số có giả hành. Có từ 1-6 lá mọc phía trên đỉnh giả hành. Cần hoa xuất hiện vào mùa Xuân, thường cong vòng và mang nhiều hoa màu vàng, trắng, tím nhạt. Trong nhóm này có những loài như Den. chrysotoxum (Hoàng lạp), Den. densiflorum (Thủy tiên vàng), Den. farmeri (Thùy tiên trắng), Den. Lindleyi và Den. Thyrsiflorum (2) Spatulata : thường được gọi là nhóm lan 'Hoàng thảo-sừng sơn dương', do hoa có đôi cánh dài và mọc xoắn như sừng antelope. Không rụng lá, 4 giả hành to, cao. Ra hoa một lượt với nhiền cành hoa, hoa lâu tàn. Được xem là nhóm dễ trồng. Trong nhóm có Den. antenatum, Den. canaliculatum, Den. discolor, Den. gouldii, Den. johannis, Den. lineale, Den. sratiotes, Den. strebloceras và Den. Laurinum. (3) Dendrobium : Rụng lá và giả hành mọc rũ xuống. Hoa mọc ra gần đầu các cành già không còn lá. Cây cần có mùa đông lạnh để trổ hoa. Nhóm này có Den. Anosmum (Phi điệp), Den. chrysanthum, Den.falconeri, Den. fimbriatum, Den. findlayanum, Den.friedricksianum, Den. heterocarpum, Den.loddigesti, Den. moniliforme, Dem. Nobile (Thạch hộc), Den. Parishii (Trầm), Den. primulinum, Den. transparent và Den. wardianum (4) Formosae: Lá không rụng, hẹp; giả hành mọc thẳng đứng có những đám lông đen nơi nối kết của lá. Hoa trắng, lớn đến 10 cm, có những điểm vàng, cam, lục hoặc tím. Trong nhóm có Den. bellatulum (Bạch hỏa hoàng), Den. draconis (Nhất điểm hồng), Den. formosum (Bạch nhạn), Den. infundibulum, Den. lowii, Den.lyonii, Den. margaritaceum, Den. sanderae (5) Latura : Không rụng lá, có giả hành dày, to cỡ trung bình. Hoa thường màu vàng-xanh đến xanh lục gồm Den. atroviolaceum, Den. johnsoniae, Den macrophylum, Den. spectabile. (6) Oxyglossum : Nhóm lan rừng, nhỏ, không rụng lá, gặp tại vùng núi cao. Hoa lâu tàn , nhiều màu sắc. Gồm Den. bellwigianum, Den. cuthbersonii, Den. laviefolium, Den. vexillarius Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính là (1) Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m; (2) Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia, Indonexia…).[8] b. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium - Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó 5 là dấu hiệu thiếu nắng, hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa. - Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ. - Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70%. Nếu độ ẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi. - Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mất tiền mua vì có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuất. Những loại giá thể thường sử dụng như vỏ thông, mùn cưa, vụn dớn, vỏ dừa, rêu... - Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [26]. c. Sâu bệnh và các vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị: + Bệnh hại trên lan - Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp. gây nên, cách phòng trị là tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000. 6 - Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp. gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000. - Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum sp. gây ra. Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/1 lần. - Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám. Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun nhiều hơn (1 tuần 2 - 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa. + Sâu hại lan: - Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng. - Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [26]. 1.2. MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC 1.2.1. Lan Thạch hộc Đây là loài lan được dùng làm thuốc lâu đời nhất tại Trung hoa, Nhật và cũng là cây được nghiên cứu sâu rộng nhất về dược tính và ứng dụng làm thuốc kể cả các thuốc đặc chế. Lan Thạch hộc phân bố khá rộng từ vùng Himalaya, Assam, Nepal, Bhutan, Myanmar, Trung Hoa, Thái, Lào, Việt Nam. Cây được 7 dùng làm 'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủ màu sắc. Loài lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium bao gồm một số loài quý hiếm đang cạn kiệt trong thiên nhiên. Tên Thạch hộc, theo Trung Hoa, “thạch” là đá; “hộc” là đơn vị đo lường, “Thạch hộc” có nghĩa là lan mọc trên những tảng đá to cỡ một hộc. Đây là cây lan được dùng làm thuốc lâu đời nhất tại Trung Quốc, Nhật Bản và cũng là cây được nghiên cứu sâu rộng nhất về dược tính và ứng dụng làm thuốc kể cả các thuốc đặc chế . Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán. Một số loại Thạch hộc thường gặp bao gồm: - Thạch hộc Rỉ sắt (Thiết bì Thạch hộc - Dendrobium nobile Lindl.) với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía nên còn được gọi là thạch hộc tía, là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát, có giá trị độc đáo về dược phẩm. - Thạch hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam, Quảng Châu ở độ cao 600 - 1700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma, Thái Lan, Việt Nam. Loài này rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao, cũng có tác dụng nhất định về công năng dược liệu. - Thạch hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công dụng làm thuốc chữa một số bệnh. - Thạch hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ cao 750 - 1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh. - Thạch hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1600 m, phân bố ở Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam. 8 - Thạch hộc Hooc sơn phân bố ở huyện Hooc Sơn, An Huy - Trung Quốc, có công dụng làm dược liệu để chữa một số bệnh. - Thạch hộc Thủy thảo rất dễ trồng, sinh trưởng nhanh, năng suất cao, cũng có công năng làm dược liệu. Trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệt phẩm của Thạch hộc. Thạch hộc rỉ sắt là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt. Quý tộc thời Trung Hoa cổ đại coi Thạch hộc rỉ sắt là “nàng tiên” hay “cỏ cứu mệnh”, được dùng trong nhiều vị thuốc và chữa được nhiều bệnh theo kinh nghiệm của dân gian [22]. 1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme Phong lan với thân cao khoảng 30 - 40 cm gồm nhiều đốt, mỗi đốt dài chừng 2.5 cm, màu vàng tươi. Lá mọc cách hình thuôn chừng 3-5 cm x 0.5 - 1.2 cm. Hoa mọc từng chùm 2-3 chiếc, ở các đốt trên thân cây già đã rụng lá. Hoa có nhiều màu như trắng, hồng, tím, vàng nhạt và xanh. Hoa lớn cỡ 3-4 cm, lâu tàn và rất thơm. Cây phân bố rất rộng: Trung Hoa, Taiwan, Bhutan, Ấn, Nhật, Hàn, Myanmar, Nepal, Việt Nam. Trong cây có những hợp chất phenanthrene-quinones như denbinobin, có hoạt tính chống sưng và tạo tiến trình apoptosis nơi tế bào. Cây còn có những sesquiterpene glucosides và phenolic glycosides như copacamphane, picrotoxane có những hoạt tính kích ứng miễn nhiễm. Dendroside A, C và vaniloside có hoạt tính kích thích sự sinh sản tế bào B, đồng thời ức chế sự bội sinh tế bào T. Dịch chiết bằng methanol toàn cây cho những alkyl ferulates có hoạt tính chống oxy-hóa. Dịch chiết bằng methanol từ rễ có hoạt tính hạ nhiệt khi thử [8]. 1.2.3. Dendrobium officinale Cây lan hầu như ít được nhắc đến trong các sách vở nghiên cứu, nuôi trồng lan và chỉ được mô tả trong các bài viết y dược tại Trung Hoa. Theo Ủy Ban Chế dược thư (Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010) thì D. officinale được xếp vào loại cây thuốc giúp đề kháng ung thư và tăng tuổi thọ. Những nghiên cứu khoa học ghi nhận D. officinale có polysaccharides trong cây cải thiện, tăng cường sức đề kháng tế bào khi thử trên chuột, hoạt tính chống oxy-hóa của các polysaccharides tổng cộng và polysaccharide tinh chế DCPP3c-1 (trích từ môi trường cấy mô D. officinale) đã được 9 chứng minh qua các thử nghiệm 'in vitro'. Dịch chiết từ D. officinale có hoạt tính làm hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline và bằng streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta, đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự phân hủy của glycogen trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan. D. officinale là một trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau [8]. 1.2.4. Các Dendrobium khác Một số Dendrobium khác đã được nghiên cứu về hoạt chất cùng khả năng trị bệnh như: - Dendrobium densiflorum: Trong cây có Scopoletin và Scoparone có hoạt tính ngăn chặn sự kết tụ tiểu cầu. - Dendrobium chrysanthum: Trong đọt có erianin có hoạt tính diệt bào chống sự bội sinh của tế bào ung thư máu HL-60 do khả năng tạo tiến trình tự hủy (apoptosis) và gây trở ngại cho sư phân lập bcl-2 và gen bax trong HL-60. Erianin còn có tác động làm teo bướu ung thư , gây hoại tử tế bào ung thư và chặn sự chuyển vận dưỡng chất qua vi mạch tế bào ung thư khi thử trên tế bào ung thư gan hepatoma Bel7402 và melanoma A375 [8]. - Dendrobium amoenum var. denneanum: Hợp chất loại dihydrostibene, isoamoenylin có hoạt tính chống oxy-hóa khá mạnh. 1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC 1.3.1. Đặc điểm thực vật học Thạch hộc rỉ sắt (Dendrobium nobile Lindl.) thuộc nhóm cây đa thân, thân mọc khỏe chia nhiều đốt ngắn, có nhiều rễ khí sinh. Cây biểu sinh trên cây gỗ hay vách đá, cao 30-60 cm, đường kính 1,3 cm, thường mọc thành khóm. Thân hơi dẹt có rãnh dọc, khi khô có màu vàng rơm. Lá mọc so le hai bên thân dài 6-12 cm, rộng 1-3 cm, không lông, dễ rụng. Hoa to xếp thành bó 1-4 cái ở sát nách lá, hoa dài 4-4,5 cm, rộng 3-3,5 cm, màu hồng tía ờ chót đầu của cánh hoa, chuyển sang trắng vào phía trung tâm; ở họng của cánh môi có một chấm to màu hạt dẻ. Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc. 10 Hình 1.1. Cây và hoa lan Thạch hộc [28] Lan Thạch hộc phân bố khá rộng từ vùng Himalaya, Assam, Nepal, Bhutan, Myanmar, Trung Hoa, Thái Lan, Lào, Việt Nam.... Cây được dùng làm 'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủ màu sắc. Ở Việt Nam loài này phân bố rộng trên toàn quốc tập trung ở vùng núi phía bắc, ngoài ra loài này còn phân bố ở các tỉnh như Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng… Thạch hộc rỉ sắt thường mọc ở những cây cao, cổ thụ hoặc ở những hốc đá nhỏ ẩm ướt. Cũng như các loài lan khác chúng ưa nơi có độ ẩm trong không khí cao và cường độ ánh sáng vừa phải [23]. 1.3.2. Thu hái và chế biến Trữ lượng Thạch hộc của ta rất phong phú, nhu cầu làm thuốc và xuất khẩu cũng rất nhiều nhưng ở thị trường không có bán vì Thạch hộc là một loại dược liệu hiếm gặp, khai thác khó khăn tốn kém, trong thân cây có chất dịch keo quánh, vỏ dày, phơi rất lâu khô, nếu không được nắng mà bị mốc đen mất phẩm chất thì không bán được. Do đó ít người thu hái chế biến để bán. Vậy thu hái Thạch hộc phải chọn thời gian nắng lâu để có điều kiện phơi khô. Nên tổ chức phơi, sấy tại chỗ nơi có dược liệu, vừa sẵn củi để sấy khô, vừa đỡ phải chở cây tươi về, tốn nhiều công sức cước phí. Thạch hộc thu hái về, cắt bỏ lá rễ, lấy thân trước trên luộc lên rồi phơi nắng cho chóng khô, sau sấy thêm và xông diêm sinh cho vàng và khô đều. Ở 11 những nơi có nhiều dược liệu và có điều kiện tập trung thì nên xây lò sấy như một gian chuông kín, làm giàn nhiều tầng để rải mỏng dược liệu từng lớp, đốt than củi mà sấy, và trở luôn cho đều, thì không cần phải luộc trước. Tiện nhất là làm lò sấy bằng tôn, để lưu động. Và nếu khai thác với quy mô lớn thì tốt nhất xây lò gạch chịu lửa kiểu như lò bánh mỳ, đốt lò để sấy với hơi nóng hẩm đều thì phẩm chất đảm bảo và sau không cần xông diêm sinh nữa. Cao Thạch hộc: Để khỏi phải phơi sấy phức tạp và chuyên chở công kềnh tốn công, ta nên nấu cao thạch hộc tại chỗ: đập dập thân cây, cắt khúc nấu, lọc, cô thành cao, 100kg dược liệu tươi cho 8 lít cao lỏng như mật ong, dùng rất tốt và rất tiện trong việc trị bệnh cũng như tẩm bổ [1]. 1.3.3. Công dụng và thành phần hóa học Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch hộc tía giàu polysacharide Thạch hộc, alkaloid Thạch hộc, các acid amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó polysacharide Thạch hộc tới 22%, hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine. Ngoài ra, Thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như este và các chất phenanthryn, bibenzyl, keton, nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch hộc tía có hàm lượng alkaloid sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac Nmethyl-dendrobium, các chất này có vị hơi đắng. Thân Thạch hộc có dầu bay hơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%. Giá trị: Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc, Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông trùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng. Giá trị của thạch hộc có 2 loại công năng chủ yếu: 12