Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc bệnh tiêu chảy thành dịch do virus (porcine epidemic diarrhea ped) gây ra trên lợn mán và lợn rừng tại tỉnh hà giang tt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH DO VIRUS (PORCIN EPIDEMIC DIAREEHEA - PED) GÂY RA TRÊN LỢN MÁN VÀ LỢN RỪNG TẠI TỈNH HÀ GIANG Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, NĂM 2019 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM 2. PGS.TS. PHẠM HỒNG NGÂN Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS.TS. Chu Đức Thắng Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. Cù Hữu Phú Hội Thú y Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện Lƣơng Định Của Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngành chăn nuôi lợn ở Hà Giang ngày càng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp của tỉnh và nhanh chóng chuyển đổi thành sản xuất hàng hoá. Cùng với trào lưu đó, hiện nay ở Hà Giang đang có xu thế phát triển chăn nuôi lợn Mán và lợn Rừng theo mô hình trang trại và bước đầu đã cho kết quả khả quan. Ở Hà Giang, hiện nay những thông tin và hiểu biết về PED của người quản lý và người chăn nuôi còn rất hạn chế, chưa có công bố chính thức nào về tình hình nhiễm PEDV tại tỉnh. Trước thực trạng đó, nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) gây ra cho đàn lợn Mán, lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. Đồng thời có thêm cơ sở khoa học cho việc chủ động xây dựng các biện pháp trong công t c phòng ngừa sự x m nh p của virus ED trên lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang, cũng như c c tỉnh miền núi phía BắcViệt Nam. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu chung Mục tiêu của lu n án nhằm x c định c c đặc điểm bệnh lý chủ yếu ở lợn Mán và lợn Rừng mắc PED. Để làm căn cứ trong chẩn đo n l m sàng và chẩn đo n ph n biệt với các nguyên nhân gây tiêu chảy khác. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - X c định tỷ lệ lợn Mán, lợn Rừng mắc tiêu chảy thành dịch (PED) trong các trang trại nuôi lợn Mán và lợn Rừng điển hình của tỉnh Hà Giang; - X c định rõ các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích (đại thể và vi thể) chủ yếu của (PED); - X c định được sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học ở lợn mắc (PED). 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Lợn Mán và lợn Rừng mắc tiêu chảy và mắc tiêu chảy thành dịch (PED) tại các trang trại và gia trại điển hình của tỉnh Hà Giang. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học. - Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý Thú y (làm tiêu bản bệnh lý), Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Địa điểm theo dõi và lấy mẫu: Tại các trang trại và gia trại nuôi lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. - Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu và số liệu của đề tài được thu th p từ th ng 12/2014 đến tháng 8/2017. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - X c định được c c đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED tại tỉnh Hà Giang; 1 - hương ph p hóa mô miễn dịch đã x c định được sự hiện diện của virus porcine epidemic diarrhea trong các mô của lợn Rừng mắc PED; - Cung cấp các thông tin về chỉ tiêu huyết học của lợn Rừng trong chăn nuôi trang trại. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đ y là nghiên cứu về PED trên lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang Việt Nam. Cùng với việc phát triển nuôi lợn Mán và lợn Rừng như hiện nay, nhất thiết phải có nhiều nghiên cứu về dịch bệnh để có biện pháp phòng ngừa và phát triển bền vững đối tượng nuôi này. Do v y, kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng cho các nhà quản lý chăn nuôi, c c nhà thú y và người nuôi trong việc sàng lọc và nhân giống lợn Mán, lợn Rừng. Bảo vệ đàn lợn Mán, lợn Rừng và đề ra chiến lược phát triển phù hợp giúp người nuôi an tâm sản xuất và phát triển kinh tế, đặc biệt là tại các tỉnh miền núi phía Bắc ở Việt Nam. - Kết quả của lu n án chỉ ra được những đặc điểm bệnh lý của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED, c c thông tin có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn đo n lâm sàng và chẩn đo n ph n biệt các bệnh tiêu chảy trên lợn Mán và lợn Rừng. - Lu n án làm tài liệu tốt cho việc tham khảo giảng dạy và nghiên cứu về PED trên lợn Mán và lợn Rừng ở c c trường, viện chuyên ngành. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - ết quả nghiên cứu đã khẳng định lợn Mán và lợn Rừng nuôi tại tỉnh Hà Giang có thể mắc PED và đã làm rõ các đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED. Là tài liệu tham khảo hữu ích cho các cán bộ thú y, người chăn nuôi có thể bước đầu chẩn đo n x c định bệnh để có biện pháp can thiệp kịp thời giảm thiểu các thiệt hại kinh tế. - ết quả nghiên cứu có thể được s dụng làm tiền đề để tiếp tục nghiên cứu về virus PED, là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN Ở HÀ GIANG Ngành chăn nuôi lợn ở Hà Giang ngày càng chiếm một vị trí quan trọng, trong sản xuất nông nghiệp của tỉnh và nhanh chóng chuyển đổi thành sản xuất hàng hoá. Cùng với trào lưu đó, hiện nay ở Hà Giang đang có xu thế phát triển chăn nuôi lợn Mán và lợn Rừng theo mô hình trang trại và bước đầu đã cho kết quả khả quan. 2.1.1. Giống lợn Mán (hay còn gọi là lợn địa phƣơng, bản địa) Lợn Mán thuộc lớp động v t có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Articodactyla), họ Suidae, chủng Sus, loài Sus domesticus. Lợn Mán là giống lợn được nuôi phổ biến trong làng bản đồng bào các dân tộc Dao, Nùng, Tày, Mông,… ở Hà Giang. Số lượng ước tính khoảng trên 50.000 con lợn trưởng thành đang được nuôi rải rác trong các làng bản vùng sâu, vùng xa. Lợn Mán 2 có hình dáng rất gần với lợn Rừng, tầm vóc nhỏ, mõm dài, hơi nhọn và chắc, thích hợp cho việc đào bới tìm kiếm thức ăn. Da dày, mốc, lông đen dài, có bờm dài và dựng đứng, chân nhỏ, đi bằng móng và rất nhanh nhẹn, thích nghi với việc thả rông, tự tìm kiếm thức ăn. Tốc độ sinh trưởng ch m và phụ thuộc vào nguồn thức ăn. Lợn này có màu lông đen, hung, n u. Trong phạm vi Dự n Biodiva đã đ nh gi sự đa dạng trên 1053 mẫu của quần thể lợn tỉnh Hà Giang. Nguyễn Thiện (2006), Nhà xuất bản Lao động - Xã hội 2.1.2. Giống lợn Rừng Lợn Rừng là loài v t mới nuôi phổ biến hiện nay ở nhiều tỉnh trong cả nước, bởi phẩm chất thịt thơm ngon, gần như không có mỡ, ít cholesteron và đặc biệt có da dày, giòn ng y. Phong trào nuôi lợn Rừng ngày càng lan rộng do đó gi thịt hơi kh hấp dẫn (luôn giữ giá 100.000 đ/kg) và nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng mạnh. Lợn Rừng (wild pig) vốn chính là thủy tổ của các giống lợn hiện nay. Theo phân loại động v t thì lợn Rừng thuộc giới động v t (Amimalia), ngành dây sống (Chordata), ph n ngành có xương sống (Vertebarata), nhóm động v t có hàm (Gnathosomata), lớp có vú (Mamalia), phân lớp thú cao hay thú có nhau (Eutheria), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ lợn (Sus), loài lợn Rừng (Sus Serofa) (Võ Văn Sự, 2009; Đào Lệ Hằng, 2008). 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHẢY Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hóa. Tùy theo yếu tố nào được xem là nguyên nh n chính mà nó được gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh lợn con ỉa phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hóa hay Colibacillosis, Salmonellosis,… hoặc tiêu chảy là triệu chứng thường gặp ở nhiều bệnh ký sinh trùng, bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn. 2.2.1. Nghiên cứu tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) trên thế giới Bệnh tiêu chảy thành dịch hay còn gọi là dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch ED thường xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch ED đã và đang g y thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Lee, 2015). Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó c c ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các quốc gia ch u Âu kh c như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và ở ch u Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nh t Bản, Thái Lan (Chen et al., 2013). Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các quốc gia ch u Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and ark, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm EDV đầu tiên được phát hiện năm 3 1973, sau hơn hai th p kỷ s dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của EDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát ngày càng trầm trọng ở các tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn. Từ th ng 2 năm 2010 đến th ng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2013). Ở Nh t, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, g y chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới 100% lợn con, dịch ED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc, dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam. Trong thời gian cuối năm 2007 - 2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã g y thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích cây phát sinh loài, thấy tất cả các PEDV phân l p được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở Trung Quốc JS - 2004 - 2 (Puranaveja et al., 2009). 2.2.2. Nghiên cứu về tiêu chảy thành dịch (PED) ở lợn tại Việt Nam Năm 2008, EDV đã được phát hiện trong một số đàn lợn mắc tiêu chảy ở Việt Nam. Trong năm 2008 - 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ t vong trên đàn lợn giữa các tỉnh dao động từ 65 - 91%. Theo nh n định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) g y ra. Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số trại, th m chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009. Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 th ng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu t p trung ở miền Nam (Đồng Nai, L m Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình hước, Củ Chi). Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức các công ty, trang trại tại Hải Dương, Th i Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Th i Bình, Hà Nam, Nam Định, Hòa Bình,… dịch tiêu chảy do EDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010 và cho đến nay tình hình dịch bệnh tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam ngày càng trầm trong hơn. C c nghiên cứu trước đó tại Viện Thú y Quốc gia, Trung tâm chẩn đo n Thú y TW, hòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã x c định được các ca nhiễm PED trên lợn ở phía Bắc Việt Nam. Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED). Theo Do Tien Duy et al. (2011); Nguyễn Tất Toàn (2012), bệnh được phát hiện ở Việt Nam từ năm 2008. Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực. Bệnh gây thiệt hại nặng nề cho các trang trại bởi tỉ 4 lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%). Theo thống kê không chính thức của phòng xét nghiệm nhanh công ty CP Việt Nam trong năm th ng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu t p trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, L m Đồng, Bình hước, Bà Rịa - Vũng Tàu. Ở khu vực phía Bắc, các nghiên cứu đã x c định được bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine epidemic diarrhea - viết tắt: PED) xảy ra tại 26 trại ở 6 tỉnh, trong đó một số trại cộng nhiễm cả virus TGE và virus Rota. Tại các trại, ED thường bùng phát vào mùa lạnh (từ th ng 11 đến tháng 4), thời gian l y lan nhanh, thường xảy ra đầu tiên trên đàn lợn nái, tỷ lệ lợn biểu hiện tiêu chảy cao (trung bình 76,8%). Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều bị tiêu chảy (có thể lên tới 100%), tỷ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ (68,6%). Có sự khác biệt lớn về mức độ cảm nhiễm, tỷ lệ biểu hiện tiêu chảy, tỷ lệ chết, thời gian tiêu chảy giữa các trại và giữa các nhóm tuổi, giới tính. Triệu chứng chủ yếu ở lợn mắc PED là tiêu chảy, nôn m a, bỏ ăn, kèm theo c c rối loạn về hô hấp, thần kinh, mức độ trầm trọng tăng dần theo tuổi. Bệnh tích đại thể ở lợn con thường gặp là thành ruột non mỏng, căng phồng toàn bộ hoặc từng đoạn (61,3 - 94%); dạ dày sung huyết, xuất huyết (19,4 - 84%); hạch lympho màng treo ruột, gan sung huyết, ứ huyết; tĩnh mạch màng treo ruột sung huyết nặng, khó quan sát thấy mạch bạch huyết ở màng treo ruột. Bệnh tích vi thể chủ yếu đường tiêu hóa: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô hấp thu thoái hóa không bào; biểu mô phủ dạ dày, ruột bong tróc; sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp đệm và lớp hạ niêm mạc đường tiêu hóa (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thu t RT- CR đã chỉ ra được các lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Mẫu bệnh phẩm được lấy từ phân, ruột và hạch ruột có thể dùng để chẩn đo n ED bằng kỹ thu t RT-PCR cho kết quả tốt. Bệnh tiêu chảy do virus ED g y ra có tính l y lan nhanh tuy nhiên chưa có loại vacxin nào phòng bệnh thì nguy cơ t i ph t, nguy cơ biến chủng của virus cũng là vấn đề rất đ ng lo ngại. Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm căn bệnh và chẩn đo n nhanh là hết sức cấp thiết trong phòng chống dịch bệnh, bảo vệ sức khỏe v t nuôi và kinh tế cho người chăn nuôi. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU * Vật liệu Từ c c đàn lợn có triệu chứng tiêu chảy đặc trưng do virus, mẫu bệnh phẩm được lấy là ph n, ruột, hạch ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy cấp ED, được thu th p bảo quản trong c c ống chứa mẫu đã được vô trùng. C c mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng chẩn đo n ED bằng test chẩn đo n nhanh hoặc phản ứng RT- CR với c c cặp mồi đặc hiệu để chẩn đo n bệnh ED. 5 Chỉ c c mẫu dương tính với EDV mới được lựa chọn cho qu trình nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu máu của 60 con lợn đã được chẩn đo n dương tính với virus PED bằng kít PED-Ag test từ một số trại lợn tại Hà Giang và của 60 lợn khỏe cùng giống làm đối chứng. Xác chết của 26 con lợn Rừng và 27 con lợn M n được chẩn đo n dương tính với virus PED bằng phương ph p RT-PCR. Kháng thể kháng virus PED từ Viện Thú Y Nh t Bản, kháng kháng thể chứa enzyme bắt màu cơ chất, và một số hóa chất khác s dụng trong HMMD, làm tiêu bản vi thể. * Hóa chất Formol trung tính 10%. Nước cất, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm heamatoxylin, eosin... Kit tách chiết QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen), Primers. Hóa chất: Môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm: Formol 10%. Hóa chất dùng để nhuộm tiêu bản: nước cất, cồn ở các nồng độ, xylen, paraffin nấu với. - Máy móc, thiết bị được s dụng trong nghiên cứu: Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 37ºC, tủ ấm 56ºC, m y đúc Block, khuôn đúc, m y cắt mảnh Microtom, kính hiển vi quang học, máy li tâm. - Dụng cụ: ipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning) ống ly tâm 15ml, 50ml (corning). đèn cồn, xi lanh, kim lấy m u, đũa thủy tinh, ống nghiệm. - Dụng cụ mổ khám gia cầm gồm: kéo (kéo cắt da, cơ và cắt xương), kẹp... vòng vớt, lam kính, la men, dao, pank, kẹp, cốc đựng hóa chất. - Trang bị bảo hộ cho người mổ kh m: găng tay và khẩu trang, áo blouse. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Khảo sát tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết do tiêu chảy trên lợn Mán lợn và Rừng tại tỉnh Hà Giang - X c định tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn M n và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang; - X c định tỷ lệ lợn chết do mắc tiêu chảy trên lợn M n và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. 3.2.2. Xác định tỷ lệ mắc PEDV trên lợn Mán lợn và Rừng trong các đàn lợn bị tiêu chảy tại tỉnh Hà Giang - X c định tỷ lệ lợn mắc ED bằng kít chẩn đo n nhanh EDV -Ag test; - X c định tỷ lệ lợn mắc ED bằng phản ứng RT – PCR. 3.2.3. Xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích chủ yếu trên lợn Mán lợn và Rừng mắc PED - X c định triệu chứng l m sàng chủ yếu trên lợn M n và lợn Rừng mắc PED; - X c định bệnh tích chủ yếu trên lợn M n và lợn Rừng mắc ED. 3.2.4. Xác định biến đổi bệnh lý vi thể một số cơ quan trên lợn mắc PED và áp dụng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch để xác định sự có mặt của virus trong các mô của lợn bệnh - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể của dạ dày, t tràng, không tràng, hồi tràng, kết tràng, hạch màng treo ruột, l ch, gan, th n, phổi, tim của lợn mắc ED; 6 - Áp dụng phương ph p hóa mô miễn dịch để x c định sự có mặt của virus trong c c mô của lợn bệnh. 3.2.5. Xác định một số chỉ tiêu huyết học cơ bản trên lợn Mán và lợn Rừng mắc PED - X c định c c chỉ số hồng cầu của lợn M n và lợn Rừng mắc ED; - X c định c c chỉ số bạch cầu của lợn M n và lợn Rừng mắc ED; - X c định c c chỉ số sinh hóa m u của lợn M n và lợn Rừng mắc ED. 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phƣơng pháp điều tra dịch tễ học - Áp dụng c c phương ph p điều tra dịch tễ học thường quy: phỏng vấn trực tiếp, ph t phiếu điều tra, hồi cứu tài liệu lưu trữ, dịch tễ học mô tả; - Triệu chứng l m sàng của lợn mắc tiêu chảy được x c định bằng phương ph p kh m l m sàng thường quy, theo dõi qua c c tiêu chí như trạng th i ph n, thể trạng của lợn. 3.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh bằng bộ Kít PED-Ag test * Nguyên lý: Bộ kít này dựa trên nguyên lý kỹ thu t sắc ký miễn dịch s dụng phương ph p Direct Sandwich. Hai kh ng thể ( T) đơn dòng trong thiết bị kết hợp đặc thù với c c vùng quyết định kh ng nguyên kh c nhau của kh ng nguyên cần chẩn đo n. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, c c kh ng nguyên của virus ED sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kh ng thể đơn dòng kh ng virus ED, để tạo thành phức chất „ T- N‟. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kh ng thể đơn dòng kh ng virus ED kh c trong màng nitơ-cellulose của thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh „ T-KN- T‟ (“Ab-Ag-Ab” direct sandwich). 3.3.3. Phƣơng pháp RT – PCR Sự có mặt của virus ED trên những lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng ED được x c định bằng kỹ thu t RT- CR. RNA được chiết t ch bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có độ dài 651bp (Park et al., 2008). 3.3.4. Phƣơng pháp mổ khám tiêu chuẩn S dụng phương ph p mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010) để tiến hành nghiên cứu tổn thương đại thể và lấy mẫu làm tiêu bản bệnh lý. 3.3.5. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể Chúng tôi s dụng phương ph p làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) và Burn (1974), cắt dán mảnh bằng Microtom. Mỗi lợn bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc 7 thành một block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra bốn tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. 3.3.6. Phƣơng pháp nhuộm hoá mô miễn dịch hương ph p ho mô miễn dịch s dụng phản ứng T- N đặc hiệu p dụng cho c c mảnh cắt đã chuyển đúc paraffin. C c mảnh cắt sau khi đã kh sạch paraffin được phủ T lên trên bề mặt. Nếu trong mô bệnh phẩm có N tương ứng với T, phức hợp N- T sẽ được hình thành. hức hợp này được nh n biết nhờ hệ thống khuếch đại tín hiệu bao gồm T bắt cầu (kháng KT) và ho chất nhuộm màu DAB (3,3- Diaminobenzidin). 3.3.7. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học Các mẫu m u được x c định chỉ số sinh lý máu bằng m y đo huyết học 18 chỉ số - Cell Dyn-3700 của hãng Abbott). X c định một số chỉ số sinh hóa máu: Protein huyết thanh tổng số (dùng khúc xạ kế Zena). Các tiểu phần protein huyết thanh x c định theo kỹ thu t điện di trên phiến xelluloza axetat và đọc kết quả trên Denssitomester junior-24. 3.3.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thô được x lý và tính to n trên Excel, số liệu tổng hợp được x lý bằng chương trình thống kê Minitab 16.0. hép th chi bình phương (χ 2) được s dụng để so s nh tỷ lệ dương tính và gi trị < 0,05 được coi là có ý nghĩa. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢO SÁT TỶ LỆ MẮC, TỶ LỆ CHẾT DO TIÊU CHẢY TRÊN LỢN MÁN VÀ LỢN RỪNG NUÔI TẠI TỈNH HÀ GIANG 4.1.1. Kết quả điều tra tình hình nuôi Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang Để đ nh gi tình hình chăn nuôi và mức độ mắc tiêu chảy trên đàn lợn Mán, lợn Rừng ở từng độ tuổi. Chúng tôi tiến hành phát phiếu điều tra tại các trang trại chăn nuôi lợn của 3 huyện: Vị Xuyên, Bắc Quang, Hoàng Su Phì thuộc tỉnh Hà Giang. Nghiên cứu chia ra theo tuần tuổi từ 1-9 tuần tuổi trong khoảng thời gian từ năm 2014 – 2016. S dụng phương ph p điều tra cắt ngang, dựa trên tiêu chí đặc trưng là tiêu chảy. Chúng tôi ghi chép, tổng hợp và x c định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết theo đàn lợn và theo số con tại các trại được nghiên cứu. Mỗi tuần tuổi, tại mỗi huyện 10 đàn (10 đàn lợn M n và 10 đàn lợn Rừng) và tổng hợp theo số con của tất cả c c đàn lợn nghiên cứu. Lợn Mán; huyện Vị Xuyên là: 90 đàn với 766 con; Bắc Quang 90 với 746 con; Hoàng Su Phì 90 với 707 con; tổng số là: 270 đàn với 2219 con. Lợn Rừng: huyện Vị Xuyên là: 90 đàn với 638 con; Bắc Quang: 90 đàn với 645 con; Hoàng Su hì: 90 đàn với 632 con; Tổng đàn là: 270 đàn; tổng số con là: 1915 con. Kết quả điều tra được trình bày tại bảng 4.1. 8 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn Rừng và lợn Mán tại 3 huyện của tỉnh Hà Giang Địa điểm nghiên cứu Vị Xuyên Bắc Quang Hoàng Su Phì Tính chung Lợn Rừng Lợn Mán Lợn Rừng Lợn Mán Lợn Rừng Lợn Mán Lợn Rừng Lợn Mán Số điều tra (con) 638 766 645 746 632 707 1915 2219 Số mắc (con) 184 223 192 222 197 225 573 670 Tỷ lệ mắc (%) 28,84 29,11 29,77 29,76 31,17 31,82 29,92 30,23 Số chết (con) 55 65 62 74 64 76 181 215 Tỷ lệ chết (%) 8,62 8,49 9,61 9,92 10,13 10,75 9,45 9,69 Bảng 4.1 cho thấy, tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn Mán và lợn Rừng và tại 3 huyện tại tỉnh Hà Giang khá cao, chiếm tỷ lệ 30,23% đối với lợn Mán và 29,92 đối với lợn Rừng. Trong c c đàn lợn được điều tra tại huyện Hoàng Su Phì chiếm tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy cao nhất (31,82% ở lợn Mán và 31,17% ở lợn Rừng), tiếp đến là lợn nuôi tại huyện Bắc Quang chiếm tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy ở lợn Mán và lợn Rừng lần lượt là 29,76% và 29,77%. Lợn nuôi tại huyện Vị xuyên chiếm tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn Mán và lợn Rừng thấp nhất (29,11% ở lợn Mán và 28,84% ở lợn Rừng). Sự sai khác về tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn Mán và lợn Rừng khi so sánh giữa các huyện nghiên cứu và giữa lợn Mán và lợn Rừng là không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). 4.1.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy theo tuần tuổi ở lợn Rừng và lợn Mán tại tỉnh Hà Giang Bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết trên lợn Mán, lợn Rừng mắc tiêu chảy theo độ tuổi. Ở tuần thứ nhất: tỷ lệ mắc tiêu chảy trên đàn lợn M n và lợn Rừng lần lượt là 62,68% và 62,17%. Tỷ lệ chết lần lượt là 25,72% và 26,09%. Tỷ lệ lợn mắc, chết do tiêu chảy cao là do: Một là, tất cả các lợn n i đều chưa được tiêm phòng vaccin chống PEDV. Do hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện nên lợn mới sinh ra rất dễ mắc bệnh. Là khả năng của cơ thể đ p ứng lại c c kích thích của mầm bệnh khi x m nh p vào cơ thể. Ở gia súc non, mầm bệnh có nhiều thu n lợi khi x m nh p vào cơ thể. Trong hệ thống tiêu hóa của lợn con lượng enzym tiêu hóa và lượng HCl tiết ra còn ít chưa đủ để đ p ứng cho qu trình tiêu hóa, g y rối loạn trao đổi chất, tiêu hóa và hấp thu kém. Chính vì v y, ở giai đoạn này mầm bệnh như Salmonella, E.coli… dễ dàng x m nh p vào cơ thể qua đường tiêu hóa và g y bệnh. Ghi chú: Các giá trị có các chữ kh c nhau thì sai kh c có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Hai là, các hộ chăn nuôi lợn Mán và lợn Rừng chưa có thói quen tiêm bổ sung sắt cho lợn mới sinh, cho nên lợn con ở tuần tuổi thứ nhất chiếm tỷ lệ 9 mắc, tỷ lệ chết cao. Ngoài ra, ở gia súc non c c yếu tố miễn dịch không đặc hiệu như: Bổ thể, protein liên kết, lymsozim được tổng hợp còn ít, phản ứng của đại thực bào rất yếu, vì thế ở gia súc non không những chưa có kh ng thể đặc hiệu mà kh ng thể phi đặc hiệu cũng rất yếu. Chính vì v y, lợn con bú sữa đầu là rất cần thiết để tăng sức bảo vệ cơ thể, chống lại mầm bệnh. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ mắc tiêu chảy theo tuổi ở lợn Rừng và lợn Mán tại Hà Giang Tuần tuổi Số điều Số mắc Tỷ lệ Số chết Tỷ lệ tra (con) (con) mắc (%)(con)chết (%) 1 Lợn Rừng 230 143 62,17a 60 26,09h a Lợn Mán 276 173 71 62,68 25,72h b 2 Lợn Rừng 224 115 46 51,34 20,54h b Lợn Mán 259 134 55 51,74 21,24h c 3 Lợn Rừng 222 96 33 43,24 14,86i c Lợn Mán 251 108 40 43,03 15,94i d 4 Lợn Rừng 217 80 21 36,87 9,68j d Lợn Mán 251 93 25 37,05 9,96j e 5 Lợn Rừng 215 39 10 18,14 4,65k e Lợn Mán 246 46 12 18,70 4,88k e 6 Lợn Rừng 211 41 5 19,43 2,37l e Lợn Mán 243 48 7 19,75 2,88l f 7 Lợn Rừng 204 24 3 11,76 1,47m f Lợn Mán 236 27 3 11,44 1,27m g 8 Lợn Rừng 200 17 2 8,50 1,00m g Lợn Mán 232 20 1 8,62 0,43n g 9 Lợn Rừng 192 18 1 9,38 0,52n g Lợn Mán 225 21 1 9,33 0,44n d Tổng Lợn Rừng 1915 573 29,92 181 9,45j d số Lợn Mán 2219 670 215 30,19 9,69j Lợn con tuần tuổi thứ 2: Tỷ lệ mắc, tỷ chết trên lợn Mán, lợn Rừng mắc tiêu chảy là 51,74%; 21,24% và ở lợn Rừng là 51,34%; 20,54% Ở độ tuổi này, tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết giảm so với tuần tuổi thứ nhất song vẫn ở mức cao. Do trong thời kỳ này tốc độ sinh trưởng và ph t dục tăng lên nhanh, lúc này chất dinh dưỡng từ sữa mẹ cung cấp không đ p ứng đủ nhu cầu của cơ thể, lượng kh ng thể từ mẹ cũng giảm đi hơn so với tuần đầu; khả năng điều tiết th n nhiệt kém do lớp mỡ dưới da còn mỏng, nên lợn con dễ bị t c động bởi yếu tố nhiệt độ và ẩm độ; lợn con giai đoạn này đã cứng c p hơn, hoạt động nhanh nhẹn, bắt đầu biết ăn, liếm thức ăn rơi vãi, ph n lợn mẹ, gặm khung chuồng, bao lồng úm... Đ y là điều kiện thu n lợi cho vi sinh v t từ môi trường bên ngoài x m nh p vào đường tiêu hóa của lợn con, làm giảm sức đề kh ng, tạo điều kiện cho virus x m nh p và dễ g y bệnh.3 huyện nghiên cứu giữa các tuần tuổi liên tiếp 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7, 8 - 9 đều có ý nghĩa thống kê (P 10 < 0,05), sự sai khác này giữa các tuần liên tiếp 1 - 2 và 7 - 8 không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Như v y, kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với c c nghiên cứu đã công bố trước đ y. Qua nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết do hội chứng tiêu chảy ở lợn M n và lợn Rừng có xu hướng giảm dần qua c c tuần tuổi. Ở thời kì này, lợn con đang dần hoàn thiện về đặc điểm chức năng của c c cơ quan trong cơ thể đặc biệt là bộ m y tiêu hóa và cơ quan điều tiết th n nhiệt. Vì v y lợn con ở tuần thứ 2 tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết thấp hơn so với tuần tuổi thứ nhất. Đối với lợn con ở tuần tuổi thứ 3: lợn con đã bắt đầu biết ăn, hệ thần kinh và hệ tiêu hóa ph t triển hơn, điều hòa được th n nhiệt và sự t c động của c c yếu tố stress bất lợi từ môi trường. Vì v y, lợn con ít mắc bệnh hơn ở 2 tuần tuổi đầu. Chính vì v y, ở giai đoạn này tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết thấp hơn tuần tuổi thứ nhất và tuần tuổi thứ 2. Tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết do tiêu chảy là; trên lợn M n 43,03%; 15,94% và trên lợn Rừng là 43,24%; 9,68%. Sự sai kh c về tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn M n và lợn Rừng tính trên địa bàn 3 huyện nghiên cứu giữa c c tuần tuổi liên tiếp 1 - 2 - 3 - 4, 6 - 7 - 8 đều có ý nghĩa thống kê ( < 0,05), sự sai kh c này giữa c c tuần liên tiếp 5 - 6 và 8 - 9 không có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). Lợn con từ tuần tuổi thứ 4 – 9: giai đoạn này tỷ lệ mắc giảm dần. hệ miễn dịch của cơ thể hoàn thiện nên con v t có khả năng chống được sự tấn công của virus, và t c động xấu từ ngoại cảnh. Ở độ tuổi này ít mắc bệnh hơn. Tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết là: 9,33%; 0,44% trên lợn M n, 9,38%; 0,52% trên lợn Rừng. Sự sai kh c về tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn M n và lợn Rừng tính trung bình tại 3 huyện nghiên cứu giữa c c tuần tuổi liên tiếp 1 - 2; 3 - 4, 5 - 6, 7 - 8 và 9 đều có ý nghĩa thống kê ( < 0,05), sự sai kh c này giữa c c tuần liên tiếp 2 - 3, 5 - 6 và 8 - 9 đều không có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). Sự sai kh c về tỷ lệ chết do mắc tiêu chảy ở lợn Rừng tính trên địa bàn 3 huyện nghiên cứu giữa c c tuần tuổi liên tiếp 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7, 8 - 9 đều có ý nghĩa thống kê ( < 0,05), sự sai kh c này giữa c c tuần liên tiếp 1 - 2 và 7 - 8 không có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). ết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chết ở lợn M n cao hơn so với lợn Rừng. Tuy nhiên, sự sai kh c tỷ lệ chết do tiêu chảy giữa lợn M n và lợn Rừng ở cùng tuần tuổi hay cả giai đoạn từ 1-9 tuần tuổi đều không có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). Sự chệnh lệch này là do lợn Rừng có khả năng thích nghi với điều kiện thời tiết khí h u, môi trường tốt hơn so với lợn M n. Chính yếu tố này giúp cho cơ thể hạn chế rất nhiều khả năng nhiễm mầm bệnh ở môi trường bên ngoài, giúp cho lợn tăng được sức đề kh ng của cơ thể chống đỡ bệnh t t nên tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn M n cao hơn hơn so với lợn Rừng. Tuy nhiên, trên lợn Rừng được đưa vào thuần hóa và nuôi tại nông hộ sau lợn M n nên chúng vẫn mang t p tính hoang dã, chính điều này dẫn đến việc theo dõi và điều trị tiêu chảy cho lợn Rừng khó hơn đối với lợn M n dẫn đến tỷ lệ chết do mắc tiêu chảy của lợn Rừng cao hơn so với lợn M n. Ngoài ra, sự biến đổi về tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết trên lợn M n và lợn Rừng, khi mắc tiêu chảy giữa c c địa 11 phương kh c nhau và giữa c c độ tuổi lợn có xu hướng tỷ lệ thu n với sự biến đổi về tỷ lệ mắc tiêu chảy. Vì v y, để hạn chế t c hại của tiêu chảy đối với lợn giảm thiểu tỷ lệ mắc tiêu chảy ở v t nuôi bằng việc p dụng nghiêm ngặt c c biện ph p phòng bệnh. Nghiên cứu cho thấy, lợn mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh, nhưng g y chết chủ yếu ở lợn con dưới 2 tuần tuổi (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2007). Qua nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết trên lợn M n và lợn Rừng có xu hướng giảm dần theo độ tuổi. Như v y, kết quả nghiên cứu trên hoàn toàn phù hợp với c c nghiên cứu đã công bố trước đ y. 4.2. XÁC ĐỊNH TỶ LỆ MẮC TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TRÊN LỢN MÁN VÀ LỢN RỪNG TẠI TỈNH HÀ GIANG 4.2.1. Kết quả xác định tỷ lệ mắc tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Mán và lợn Rừng bằng kít chẩn đoán nhanh (kít PED-AG test) tại tỉnh Hà Giang Từ kết quả nghiên cứu về tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn Rừng và lợn M n tại tỉnh Hà Giang, chúng tôi đã lựa chọn c c đàn lợn con theo mẹ có triệu chứng l m sàng đặc trưng của ED để lấy mẫu và dùng test th nhanh để chẩn đo n x c định tỷ lệ dương tính với test th , kết quả được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả xác định tỷ lệ dƣơng tính với PEDV của lợn Mán và lợn Rừng bằng kít chẩn đoán nhanh (Kít PED-Ag test) tại tỉnh Hà Giang Địa điểm nghiên cứu 1- 4 > 4 tuẩn Nái nuôi Nái Tổng tuần con (n khỏe hợp (n =10) (n =10) =10)(n =10) (n = 40) Lợn Rừng Dương tính 7 3 6 0 16 Vị n = 40 Tỷ lệ (%) 70 30 60 0 40f Xuyên Lợn Mán Dương tính 10 4 8 2 24 n = 80 n = 40 Tỷ lệ (%) 100 40 80 20 60d Lợn Rừng Dương tính 8 2 7 0 17 Bắc n = 40 Tỷ lệ (%) 80 20 70 0 42,5f Quang Lợn Mán Dương tính 9 3 8 0 20 n= 80 n = 40 Tỷ lệ (%) 90 30 80 0 50e Hoàng Lợn Rừng Dương tính 10 3 10 2 25 Su n = 40 Tỷ lệ (%) 100 30 100 20 62,5d Phì Lợn Mán Dương tính 8 3 9 3 23 n = 80 n = 40 Tỷ lệ (%) 80 30 90 30 57,5d Tổng Lợn Rừng Dương tính 25 8 23 2 58 hợp n = 40 Tỷ lệ (%) 83,3b 26,7g 76,7c 6,7i 48,3e n= Lợn Mán Dương tính 27 10 25 5 67 240 n = 40 Tỷ lệ (%) 96,7a 33,3f 86,7b 16,7h 77,8c Ghi chú: n + là số mẫu dương tính với test th Các giá trị có các chữ khác nhau thì sai kh c có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Bảng 4.3 cho thấy, kiểm tra bằng kít test chẩn đo n nhanh tỷ lệ lợn nhiễm EDV trên tổng số lợn M n, lợn Rừng có triệu chứng nhiễm EDV tại tỉnh Hà Giang khá cao (77,8%; 48,3%). hi xét tỷ lệ dương tính với EDV trên 12 lợn M n và lợn Rừng của 3 huyện tại tỉnh Hà Giang. Nghiên cứu cho thấy, lợn M n và lợn Rừng tại huyện Hoàng Su hì nhiễm EDV chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất lần lượt là 57,5%; 62,5%; tiếp đến là đàn lợn tại huyện Bắc Quang tỷ lệ dương tính thấp hơn 50,0%; 42,5%; cuối cùng là đàn lợn nuôi tại huyện Vị Xuyên tỷ lệ dương tính thấp nhất (60,0%; 40,0%) (bảng 4.3). Sự sai kh c về tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) của giống lợn M n tại huyện Vị Xuyên và Hoàng Su hì với tỷ lệ này ở huyện Bắc Quang là có ý nghĩa thống kê ( < 0,05). Tuy nhiên, sự sai kh c giữa tỷ lệ mắc tiêu chảy thành dịch ( ED) trên lợn M n ở huyện Vị Xuyên và Hoàng Su hì so với huyện Bắc Quang không có ý nghĩa thống kê ( > 005). Sự sai kh c về tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) trên lợn Rừng tại huyện Vị Xuyên so với huyện Bắc Quang là không có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). Tuy nhiên, sự sai kh c giữa tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) trên lợn Rừng ở hai huyện Bắc Quang, Vị Xuyên so với huyện Hoàng Su hì là có ý nghĩa thống kê (P < 005). Đàn lợn nuôi tại huyện Hoàng Su hì tỷ lệ nhiễm EDV cao nhất so với c c huyện kh c có thể là do hầu hết lợn được nuôi tại c c hộ chăn nuôi nhỏ lẻ trong khu d n cư, thức ăn t n dụng, chuồng nuôi và phương thức chăn nuôi, vệ sinh thú y không đảm bảo. Thực tế cho thấy tình trạng chăn nuôi như trên vẫn thấy rải r c tại c c huyện trong tỉnh nên tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) vẫn còn kh phổ biến. Ở huyện Vị Xuyên hầu hết chăn nuôi với qui mô c c trang trại lớn, người d n đã biết p dụng khoa học kỹ thu t vào chăn nuôi, chuồng trại hiện đại và chú ý đến công t c vệ sinh thú y trong chăn nuôi lợn n i và lợn con. Vì v y tỷ lệ mắc tiêu chảy thành dịch ( ED) thấp nhất. ết quả nghiên cứu cho thấy, bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi đều mắc và tỷ lệ mắc kh c nhau. Tỷ lệ lợn mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) tại c c trại là kh cao. Ở giai đoạn lợn từ 1-4 tuần tuổi, tỷ lệ dương tính với EDV trên lợn M n và lợn Rừng chiếm cao nhất (96,7% và 83,3%). Ở giai đoạn lợn > 4 tuần tuổi, tỷ lệ dương tính với EDV trên đàn lợn M n và lợn Rừng lần lượt là 33,3% và 26,7%, giảm thấp so với giai đoạn lợn từ 14 tuần tuổi. Tuy nhiên, trên lợn n i nuôi con, tỷ lệ dương tính với EDV tương đối cao 86,7% trên lợn M n và 76,7% trên lợn Rừng. Chúng tôi tiến hành th test nhanh trên lợn n i khỏe, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với EDV trên lợn M n khỏe là 16,7%; trên lợn Rừng khỏe là 6,7%. Sự sai kh c về tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) tính chung trên cả 3 huyện nghiên cứu giữa c c nhóm lợn từ 1- 4 tuần tuổi; lợn > 4 tuần; lợn n i nuôi con và lợn n i khỏe đều có ý nghĩa thống kê ( > 0,05). Sự sai kh c về tỷ lệ mắc mắc tiêu chảy thành dịch ( ED) tính chung trên cả 3 huyện nghiên cứu giữa lợn Rừng so với lợn M n trong cùng nhóm lợn (1-4 tuần tuổi; lợn > 4 tuần; lợn n i nuôi con hay lợn n i đều có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 13 ết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) trên lợn, mức độ l y lan nghiêm trọng khi PEDV lưu hành trong đàn lợn. Lợn ở mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm và có nguy cơ mắc cao khi dịch xảy ra. Tình trạng mắc bệnh tiêu chảy thành dịch ( ED) xảy ra trên toàn đàn ở tất cả c c nhóm lợn thuộc nhiều độ tuổi kh c nhau, tuy nhiên mức độ trầm trọng ở c c lứa tuổi kh c nhau lại rất kh c nhau. Nghiên cứu đã chỉ rõ ở c c trại nuôi lợn M n và lợn Rừng nhiễm EDV tỷ lệ mắc tiêu chảy kh cao, trên tất cả c c nhóm lợn. Tỷ lệ mắc giữa c c nhóm lợn có sự kh c biệt rõ rệt. Như v y, kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ lợn M n lợn và Rừng 1 - 4 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm EDV cao hơn so với c c nghiên cứu trước đ y. Nguyên nh n chính là do phương thức chăn nuôi, kỹ thu t chăn nuôi và tình hình vệ sinh thú y, sức đề kh ng của lợn con. Đ y là lý do lợn từ 1-4 tuần tuổi chiếm tỷ lệ nhiễm PEDV cao. Trong qu trình nghiên cứu cho thấy, mặc dù lợn n i nuôi con phơi nhiễm EDV, tuy nhiên dấu hiệu l m sàng thường rất nhẹ, thời gian tiêu chảy ngắn, lợn mẹ vẫn ăn uống bình thường và không chết. Nhóm lợn con theo mẹ 1 tuần tuổi thường mẫn cảm nhất với EDV ở lứa tuổi này chiếm tỷ lệ cao nhất (96,3% trên đàn lợn M n, 95,8% trên đàn lợn Rừng). Qua kết quả nghiên cho thấy, tỷ lệ mắc ED xuất hiện trên lợn từ 1-4 tuần tuổi (lợn M n, lợn Rừng) là rất cao (tương ứng 96,7% và 83,3%). Hai tỷ lệ này giảm dần theo độ tuổi. C c yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh giữa c c trại phụ thuộc vào: phương thức chăn nuôi (trại t n dụng nguồn thức ăn có nguy cơ mắc bệnh càng cao), vệ sinh s t trùng (thực hiện trên 2 tuần, một lần có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn so với 1 tuần, một lần), quy mô chăn nuôi (tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở trại có quy mô chăn nuôi nhỏ), và nguồn nước s dụng (tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở trại có nguồn nước chưa qua x lý). Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nguyên nh n một phần là do t p qu n, phương thức chăn nuôi lợn tại tỉnh Hà Giang còn nhỏ lẻ, chủ yếu nuôi chăn thả, chưa p dụng tốt quy trình vệ sinh, phòng bệnh cho đàn lợn. ết quả kiểm tra bằng kít test chẩn đo n nhanh cho thấy tỷ lệ lợn nhiễm EDV trên tổng số lợn M n, lợn Rừng có triệu chứng nhiễm EDV tại tỉnh Hà Giang kh cao (77,8%; 48,3%). Vì v y, việc khuyến c o c c trang trại nuôi lợn M n, lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang cần có kế hoạch phòng chống bệnh là rất cần thiết. ết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với c c nghiên cứu đã công bố trước đ y. 4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ mắc bênh tiêu chảy thành dịch (PED) của lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang bằng phản ứng RT – PCR Trong khuôn khổ của đề tài, để làm nguyên liệu cho ph t hiện virus, chúng tôi tiến hành thu th p mẫu ở c c đàn lợn có triệu chứng của bệnh ED tại huyện Vị Xuyên, Bắc Quang, Hoàng Su phì làm đại cho đàn lợn M n và lợn của tỉnh Hà Giang. Ngoài EDV, ở nước ta đã x c định được sự có mặt và lưu hành của porcine deltacoronavirus (Le et al., 2017) là loại virus mới được chứng minh g y ra triệu chứng và bệnh tích khó ph n biệt về mặt l m sàng với bệnh do EDV g y ra (Ma et al., 2015). Do đó, chúng tôi đã ứng dụng kỹ 14 thu t RT- CR để khẳng định chắc chắn sự có mặt của EDV trong mẫu ph n, ruột, hạch ruột của lợn nghi mắc ED. 4.2.2.1. Hồ sơ mẫu nghiên cứu Trong qu trình nghiên cứu chúng tôi đã thu th p được 35 lợn Rừng dương tính với EDV (trong c c đàn đã th it chẩn đo n nhanh (Kít PEDAg test) tại c c trại chăn nuôi lợn của huyện Vị Xuyên, Bắc Quang, Hoàng Su Phì tỉnh Hà Giang có triệu chứng l m sàng điển hình nghi bệnh ED; Mẫu chúng tôi thu nh n là cả con lợn mắc bệnh điển hình trong lứa tuổi từ 1-4 tuần tuổi, thường là trong một hoặc hai đàn lợn, mỗi đàn lợn từ 1-3 con, kết quả thu nh n mẫu lợn M n, lợn Rừng (Trình bày ở phụ lục). 4.2.2.2. Kết quả chẩn đoán PED bằng phương pháp RT – PCR Sản phẩm RNA của virus thu được sau khi chiết t ch từ bệnh phẩm (ph n, ruột, hạch ruột) bằng kit t ch chiết QIAgen sẽ được khuếch đại bằng kĩ thu t RT – CR với sự tham gia của enzym sao chép ngược (Reverse Transcriptase) và s dụng cặp mồi khuếch đại một phần gen S cho phép xác định đoạn gen của virus ED có kích thước 651bp. Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện di và chụp ảnh. ết quả của phản ứng RT – CR x c định sự có mặt của EDV được thể hiện ở c c bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả xác định tỷ lệ mắc PED của lợn Mán và lợn Rừng tại Hà Giang bằng kỹ thuật RT- PCR Địa điểm Lợn Mán Lợn Rừng (Huyện) n n (+) Tỷ lệ % n n (+) Tỷ lệ % Vị Xuyên 12 9 75,0b 12 10 83,3a a Mẫu Bắc Quang 11 10 90,9 12 8 66,7c b 72,7 72,7b Ruột Hoàng Su Phì 11 8 11 8 b Tổng hợp 34 27 35 26 79,4 74,3b b Vị Xuyên 12 8 66,7 12 7 58,3c c 54,5 50,0c Mẫu Bắc Quang 11 6 12 6 c 54,5 54,5c Phân Hoàng Su Phì 11 6 11 6 c Tổng hợp 34 20 35 19 57,1 54,3c b Vị Xuyên 12 9 75,0 12 10 83,3a b Mẫu Bắc Quang 11 10 75,0 12 8 66,7c a 90,9 72,7b Hạch Hoàng Su Phì 11 8 11 8 b Tổng hợp 34 27 35 26 72,7 74,3b Ghi chú: n + là số mẫu dương tính với phép th . Ghi chú: Các giá trị mang chữ cái a,b,c khác nhau trong cùng một cột cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p. Các giá trị có các chữ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Kết quả xét nghiệm bảng 4.4 cho thấy, sự hiện diện của PEDV ở tất cả các huyện lấy mẫu. Đối với cùng loại mẫu ruột, ở lợn Mán mẫu lấy ở Bắc Quang chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất 90,09%, mẫu lấy ở Vị Xuyên tỷ lệ dương tính 15 là 75,0%, mẫu lấy ở Hoàng Su Phì tỷ lệ dương tính thấp nhất 72,7%. Bằng ph n tích phương sai 1 nh n tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mẫu ruột ở lợn Rừng mẫu lấy tại Vị Xuyên chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất 83,3%, tiếp đến là mẫu lấy ở Hoàng Su Phì có tỷ lệ dương tính là 72,7%, mẫu lấy ở Bắc Quang có tỷ lệ dương tính thấp nhất (66,7%). Sự sai khác về tỷ lệ dương tính với PEDV trên lợn Rừng khi s dụng phản ứng PCR trên cùng loại mẫu ruột ở các huyện kh c nhau đều kh c nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Mẫu phân trên lợn Mán mẫu lấy tại các huyện lần lượt như sau: Vị Xuyên tỷ lệ dương tính là 66,7%, Bắc Quang chiếm tỷ lệ 54,5%, Hoàng Su Phì tỷ lệ 54,5%. Bằng ph n tích phương sai 1 nh n tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mẫu ruột ở lợn Rừng mẫu lấy tại Vị Xuyên chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất 83,3%, tiếp đến là mẫu lấy ở Hoàng Su Phì có tỷ lệ dương tính là 72,7%, mẫu lấy ở Bắc Quang có tỷ lệ dương tính thấp nhất (66,7%). Sự sai khác về tỷ lệ dương tính với PEDV trên lợn Rừng khi s dụng phản ứng PCR trên cùng loại mẫu phân ở các huyện kh c nhau đều kh c nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Mẫu hạch ruột trên lợn Mán mẫu lấy tại các huyện lần lượt như sau: Vị Xuyên tỷ lệ dương tính là 66,7%, Bắc Quang chiếm tỷ lệ 54,5%, Hoàng Su Phì tỷ lệ 54,5%. Bằng ph n tích phương sai 1 nh n tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mẫu ruột ở lợn Rừng mẫu lấy tại Vị Xuyên chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất 83,3%, tiếp đến là mẫu lấy ở Hoàng Su Phì có tỷ lệ dương tính là 72,7%, mẫu lấy ở Bắc Quang có tỷ lệ dương tính thấp nhất 66,7%. Sự sai khác về tỷ lệ dương tính với PEDV trên lợn Rừng khi s dụng phản ứng PCR trên cùng loại mẫu phân ở các huyện khác nhau đều kh c nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Mẫu phân trên lợn Rừng mẫu lấy tại các huyện lần lượt như sau: Vị Xuyên tỷ lệ dương tính là 58,3%,Hoàng Su hì tỷ lệ 54,5%, Bắc Quang chiếm tỷ lệ 50,0%. Bằng phân tích phương sai 1 nh n tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Sự sai khác về tỷ lệ dương tính với PEDV trên lợn Rừng khi s dụng phản ứng PCR trên cùng loại mẫu phân ở các huyện kh c nhau đều kh c nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).Nghiên cứu cho thấy, sự hiện diện của PEDV có ở tất cả c c địa phương lấy mẫu; 27/34 chiếm 72,7% mẫu bệnh phẩm trên lợn Mán; 26/35 chiếm 74,3% mẫu bệnh phẩm trên lợn Rừng thu th p được từ 3 huyện tỉnh Hà Giang cho kết quả dương tính với phản ứng RT-PCR. Nghiên cứu cho thấy, sự hiện diện của PEDV có ở tất cả c c địa phương lấy mẫu; 27/34 chiếm 72,7% mẫu bệnh phẩm trên lợn Mán; 26/35 chiếm 74,3% mẫu bệnh phẩm trên lợn Rừng thu th p được tại tỉnh Hà Giang cho kết quả dương tính với phản ứng RT-PCR. Qua kết quả nghiên cứu, có thể khẳng định sự có mặt của PEDV tại các trang trại nuôi lợn Mán, lợn Rừng được nghiên cứu tại tỉnh Hà Giang. Kết quả thu được từ nghiên cứu này một lần nữa cho thấy dịch tiêu chảy cấp trên lợn - tiêu chảy thành dịch ( ED) đã và đang xuất hiện phổ biến ở Việt Nam. 16 4.3. XÁC ĐỊNH TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH CHỦ YẾU CỦA LỢN MÁN VÀ LỢN RỪNG MẮC TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TẠI TỈNH HÀ GIANG 4.3.1. Xác định triệu chứng lâm sàng của lợn Mán và lợn Rừng mắc bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) tạị tỉnh Hà Giang Triệu chứng l m sàng là những dấu hiệu của c c qu trình biến đổi bệnh lý ở c c cơ quan tổ chức được biểu hiện ra bên ngoài, bằng c c phương ph p kh m l m sàng có thể dễ dàng nh n biết được. Những triệu chứng l m sàng có ý nghĩa rất lớn trong thực hành l m sàng thú y. Nó giúp cho việc ph t hiện ra c c c thể đang mắc bệnh trong đàn hoặc tìm ra c c cơ quan, tổ chức đang mắc bệnh trong cơ thể một c ch nhanh chóng. X c định triệu chứng l m sàng của bệnh ED rất quan trọng, nó giúp cho việc chẩn đo n ph n biệt với c c bệnh tiêu chảy sẽ dễ dàng hơn. Sau khi tiến hành chẩn đo n RT – CR cho kết quả (+), chúng tôi tiến hành hồi cứu dữ liệu thống kê trước đó về triệu chứng l m sàng của lợn Rừng và lợn M n, kết quả được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Triệu chứng lâm sàng của lợn Mán và lợn Rừng mắc bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) tại tỉnh Hà Giang Triệu chứng Ủ rũ, mệt mỏi h n lỏng, tanh, màu vàng Gầy gò Nằm dồn đống Bỏ ăn, giảm ăn Mắt trũng s u Uống nhiều nước Nằm trên bụng mẹ Lười bú Th n nhiệt giảm Thở nhanh Đi đứng siêu vẹo Nôn m a Niêm mạc mắt nhợt nhạt Lợn M n (n = 27) Tỷ lệ ( %) 100 100 a 100 85,2 81,5 81,5 77,8 74,1 66,7 63,0 59,3 55,6 51,8 51,8 Lợn Rừng (n = 26) Tỷ lệ (%) 100 100 b 80,8 76,9 76,9 73,1 69,2 61,5 57,7 53,8 53,8 50,0 46,2 46,2 Ghi chú: (n) là số mẫu thí nghiệm. Các giá trị mang chữ cái a,b khác nhau trong cùng một hàng cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Kết quả bảng 4.5 cho thấy không có sự khác biệt lớn về triệu chứng lâm sàng, giữa lợn Mán và lợn Rừng nuôi mắc PED. Cả hai giống lợn này khi mắc dịch tiêu chảy do virus (PED) đều có c c triệu chứng chủ yếu như: Ủ rũ, mệt mỏi; ph n lỏng, tanh, màu vàng (100%); gầy gò (100% đối với lợn M n và 80,8% đối với lợn Rừng nuôi); nằm dồn đống (81,2% đối với lợn M n và 76,9% đối với lợn Rừng nuôi); bỏ ăn, giảm ăn (81,5% đối với lợn M n và 76,9% đối với lợn Rừng nuôi); mắt trũng s u (81,5% đối với lợn M n và 73,1% đối với lợn Rừng nuôi); uống nhiều nước (77,8% đối với lợn M n và 69,2% đối với lợn Rừng nuôi); nằm 17 trên bụng mẹ (74,1% đối với lợn M n và 61,5% đối với lợn Rừng nuôi); lười bú; th n nhiệt giảm; thở nhanh; đi đứng siêu vẹo; nôn m a, niêm mặc nhợt nhạt. Sau khi theo dõi, quan sát, ghi lại những triệu chứng lâm sàng chủ yếu, chúng tôi tiến hành mổ khám tại phòng thí nghiệm, quan sát các biến đổi bệnh tích đại thể trên c c cơ quan, tổ chức, chụp ảnh bệnh tích, ghi lại hồ sơ mẫu, biên bản mổ kh m và lưu mẫu lại. Sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR và có kết quả, chúng tôi hồi cứu, tổng hợp lại những biến đổi bệnh lý đại thể khi mổ khám của các lợn mắc PED. Kết quả được thể hiện tại bảng 4.6. Bảng 4.6. Kếết quả xác định bệnh tch đại thể chủ yếếu của lợn Mán, l ợn Rừng mắếc PED tại tỉnh Hà Giang Triệu chứng Xác chết gầy, da khô, nhăn nheo Dạ dày căng phồng, chứa sữa chưa tiêu Ruột non căng phồng, thành mỏng, chất chứa có màu vàng lợn cợn và nhiều bọt Hạch lympho màng treo ruột sung huyết, xuất huyết Gan sưng, nhạt màu Hạch bẹn nông sưng to H u môn dính bết ph n màu vàng Phổi viêm, tụ huyết màu đỏ sẫm, có bọt ở phế quản L ch sung huyết Túi m t căng to Sung huyết mạch quản màng treo ruột Tim to, cơ tim mềm Th n tụ huyết màu đỏ sẫm Lợn M n (n = 27) Tỷ lệ ( %) 100 100 100 Lợn Rừng (n = 26) Tỷ lệ (%) 100 100 100 85,2 80,8 81,5 69,2 a a b b 81,5 69,2 77,8 a 74,1 61,5 b 61,5 66,7 59,3 55,6 51,8 51,8 57,7 57,7 53,8 50,0 50,0 a a b b Ghi chú: (n) là số mẫu thí nghiệm. Các giá trị mang chữ cái a,b khác nhau trong cùng một hàng cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Qua nghiên cứu kết quả mổ khám cho thấy tỷ lệ 100% lợn mổ khám xác chết gầy do khi mắc bệnh khả năng chuyển hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng giảm nên lợn gầy còm. Ruột: Tất cả lợn được mổ kh m đều có hiện tượng căng, phồng to, bên trong có chứa nhiều bọt khí. Dạ dày: Căng phồng, niêm mạc dễ nát, bên trong chất chứa đầy sữa chưa tiêu (100%) ở cả lợn Mán và lợn Rừng. Ruột non căng phồng, thành mỏng, chất chứa có màu vàng lợn cợn và nhiều bọt 100%) cả lợn Mán và lợn Rừng. Hạch lympho màng treo ruột sưng to và xuất huyết rõ chiếm 85,2% ở lợn Mán và 80,8% ở lợn Rừng. C c cơ quan nội tạng như phổi, gan, th n, l ch đều có biểu hiện sung huyết, tụ huyết màu đỏ sẫm. Kết quả mổ khám cho thấy, bệnh tích đại thể bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Mán và lợn Rừng, chủ yếu t p trung trên ruột và dạ dày. Lợn Mán, lợn Rừng mắc ED thường chết trong tình trạng gầy mòn với tất cả số 18