Tài liệu Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (bubalus bubalis)

MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu Á và Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới. Tuy nhiên so với một số ngành chăn nuôi khác như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan tâm phát triển đúng mức. Tại Việt Nam, số lượng trâu đang có xu hướng giảm dần (Bảng 1 - Phụ lục). Chính vì thế việc nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh sản trên trâu nhằm nâng cao hiệu quả sinh sản của trâu là cần thiết. Nguồn trứng trâu sử dụng cho các nghiên cứu về công nghệ sinh sản ở trâu thường khá ít và thụ động. Việc tạo ra một nguồn trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là một giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm. Bảo quản lạnh tế bào trứng được xem là một giải pháp hiệu quả cho vấn đề này. So với bảo quản lạnh tinh và phôi thì quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng kém hiệu quả hơn do sự khác nhau về cấu trúc tế bào. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng như: chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục và chất lượng của trứng. Tại Việt Nam, trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về trâu, nhưng hiện nay do sự suy giảm về số lượng cũng như chất lượng đàn trâu nên các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề ứng dụng công nghệ sinh học nhằm nâng cao khả năng sinh sản của đàn trâu. Luận án này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là một lĩnh vực nghiên cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là đông lạnh tế bào trứng trâu. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Đánh giá được ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá được ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá được ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI A. Ý nghĩa khoa học - Lựa chọn được chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh hiệu quả đối với quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu. - Xác định được giai đoạn nuôi thành thục in vitro mang lại hiệu quả cao cho quá trình đông lạnh tế bào trứng. - Bước đầu tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông và tinh trùng đông lạnh. - Đưa ra được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) tại Việt Nam. 1 B. Ý nghĩa thực tế - Sự thành công trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học lạnh đối với việc bảo tồn các loài động vật nuôi có giá trị kinh tế cao, các loại động vật nuôi quý hiếm tại Việt Nam dưới dạng tế bào trứng đông lạnh. - Nguồn tế bào trứng trâu đông lạnh là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các nghiên cứu khác về trâu như: tạo phôi trâu in vitro; tạo phôi trâu nhân bản bằng cấy chuyển gen, cấy chuyển nhân. 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra phương pháp đông lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu (Bubalus bubalis) sau đông lạnh-giải đông. - Các kết quả nghiên cứu của luận án này có thể ứng dụng cho các phòng thí nghiệm về Công nghệ sinh sản trên toàn quốc. 5. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 145 trang. Trong đó bao gồm: Mở đầu 4 trang; tổng quan 43 trang; vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 9 trang, kết quả và thảo luận 57 trang, kết luận và đề nghị 2 trang; các công trình đã công bố của luận án: 1 trang; tài liệu tham khảo 29 trang; phụ lục 2 trang. Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC Tổng quan tài liệu đề cấp đến 8 vấn đề chủ yếu sau: 1. Tế bào trứng trâu: cấu tạo tế bào trứng trâu; thu và phân loại chất lượng trứng trâu. 2. Môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng. 3. Quá trình thành thục nhân của tế bào trứng. 4. Chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông lạnh – giải đông tế bào trứng: các dạng chất bảo vệ lạnh, cơ chế hoạt động của chất bảo vệ lạnh, ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng, ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng, quá trình giải đông và pha loãng. 5. Phương pháp đông lạnh sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng: đông lạnh chậm, thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, đông lạnh cực nhanh. 6. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng: bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm hoặc chưa thành thục, bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII). 7. Một số dạng tổn thương lạnh của tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh. 8. Đánh giá chất lượng tế bào trứng sau bảo quản lạnh: đánh giá dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế bào, đánh giá dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng. 2 Chương II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu - Sử dụng tế bào trứng trâu có nguồn gốc từ buồng trứng lò mổ. - Sử dụng một số hóa chất của Sigma dùng cho đông lạnh tế bào trứng, nuôi thành thục in vitro tế bào trứng và tạo phôi trâu in vitro. - Sử dụng các thiết bị của Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi, hệ thống kính hiển vi huỳnh quang của Bộ môn tế bào, mô phôi; Khoa Sinh học – Trường ĐH KHTN Hà Nội. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng ở lò mổ. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro từ tế bào trứng trâu. 3. Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi thành thục in vitro khác nhau. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu. 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu Buồng trứng trâu thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng trứng, nhiệt độ 30 – 32oC, đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ. Rửa buồng trứng trâu trong dung dịch bảo quản buồng trứng vài lần ở nhiệt độ 30 – 32oC trước khi sử dụng. 2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ Sử dụng phương pháp chọc hút để thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ. 2.3.3. Phân loại tế bào trứng Phân loại tế bào trứng theo mô tả của Goodhand và cs. (2000). 2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân trứng trâu Loại bỏ lớp tế bào nang của tế bào trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở nhiệt độ phòng; tiếp theo rửa lại bằng PBS ba lần, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở 37oC hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát, kiểm tra và xác định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang. 2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu Tế bào trứng trâu được nuôi thành thục theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a). 2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro Sử dụng cả hai phương pháp: quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào để đánh giá tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương pháp quan sát hình thái, tế bào 3 trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là trứng có các lớp tế bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt chẽ. 2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro 2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng Quá trình hoạt hóa tinh trùng được thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a) với dung dịch gốc BO (Brackett và Oliphant, 1975). 2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu Tế bào trứng đã thành thục được chuyển vào giọt thụ tinh có chứa tinh trùng đã được hoạt hóa và được giữ 18 giờ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ ẩm không khí bão hòa để tế bào trứng hoàn thành quá trình thụ tinh. 2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro Trứng trâu sau thụ tinh in vitro sẽ được loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh và chuyển vào giọt nuôi chứa môi trường nuôi phôi in vitro. Các giọt môi trường nuôi này sẽ được phủ dầu khoáng và giữ ở điều kiện 38,5oC; 5% CO2; độ ẩm không khí bão hòa. Kiểm tra, xác định tỷ lệ phân chia (thụ tinh) ở ngày thứ 2 sau thụ tinh, tỷ lệ phôi dâu, nang ở ngày thứ 8-9 sau thụ tinh. 2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng 2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống Các tế bào trứng trâu để trong dung dịch trước cân bằng một thời gian trước khi chuyển sang dung dịch đông lạnh. Tiếp theo khoảng 5-6 tế bào trứng sẽ được nạp vào cọng rạ 0,25ml, hàn kín đầu và để trên hơi nitơ lỏng. Sau 2 phút các cọng rạ này sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng để bảo quản lâu dài. 2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở Trứng trâu được để trong dung dịch pES một thời gian; sau đó chuyển sang môi trường VS, và nạp vào cọng rạ hở bằng lực mao dẫn. Các cọng rạ này sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng mà không cần hàn kín. Để không bị nổi trong nitơ lỏng, các cọng rạ hở thường được cho vào trong cọng rạ 0,5ml không hàn kín. 2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt Trong phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt, trứng trâu cũng trải qua quá trình cân bằng trong dung dịch pES và dung dịch VS tương tự như phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và cọng rạ hở. Tế bào trứng được hút bằng pipet pasteur (3-5 tế bào trứng/giọt) và thả trực tiếp vào trong nitơ lỏng. Các giọt dung dịch đông đặc có chứa mẫu sẽ được chuyển vào trong ống chịu lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng. 2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh Tế bào trứng được giải đông ở 37oC, sau đó chuyển sang môi trường giải đông để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh ra khỏi tế bào trứng. Tiếp theo các tế bào trứng sẽ được rửa 2-3 lần trong môi trường nuôi thành thục để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh cũng như môi trường giải đông. 4 2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông Trứng trâu thu được sau đông lạnh - giải đông sẽ được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có hình thái bình thường nếu có hình cầu cân đối, không méo mó, lớp tế bào nang vẫn còn liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không bị tổn thương (không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc thoái hóa; màng sáng không bị đứt gãy. Trứng có hình thái không bình thường khi xuất hiện các biểu hiện như có hình dạng méo mó, lớp tế bào nang bao xung quanh bị tan rã, màng tế bào chất và màng sáng bị tổn thương, tế bào chất bị thoái hóa. 2.4. Thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm 1: Nghiên cứu số lượng và chất lượng trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 1) - Trứng trâu sau khi thu từ buồng trứng lò mổ được phân loại dựa vào quan sát hình thái. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 2) Tế bào trứng trâu sau phân loại được nuôi thành thục in vitro trong 6 môi trường: TCM 199 + 10% FCS, TCM 199 + 5µg/ml FSH, TCM 199 + 10% FCS + 5µg/ml FSH, Ham’s F-10 + 10% FCS, Ham’s F-10 + 5µg/ml FSH, Ham’s F-10 + 10% FCS + 5µg/ml FSH. Sau nuôi thành thục, các tế bào trứng được thụ tinh in vitro và tạo phôi in vitro. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 3 và 6) Xác định giai đoạn phát triển chủ yếu của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) bằng phương pháp nhuộm nhân, kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Các chất bảo vệ lạnh (Ethylene glycol; Dimethylsulfoxide; 1,2 – Propanediol; Glycerol) được sử dụng kết hợp hoặc riêng lẻ ở cùng nồng độ 6M. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 4, lựa chọn dạng chất bảo vệ lạnh thích hợp sử dụng cho thí nghiệm 5. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh đã lựa chọn ở thí nghiệm 4 với các nồng độ 2M, 4M, 6M và 8M. Dung dịch giải đông là TCM 199. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 5, dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 6. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M 5 sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 bằng ½ bước 1. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 trong thí nghiệm này là 30 giây, 1 phút, 2 phút, 3 phút. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 6, dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 7. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã được lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông gồm hai dạng: dạng I là TCM 199; dạng II là hai dung dịch V1 (TCM 199 + 0,5M sucrose) và V2 (TCM 199 + 0,25M sucrose). Đối với dung dịch giải đông dạng I, tế bào trứng sau giải đông được để 5 phút trong dung dịch giải đông. Còn đối với dạng II: tế bào trứng sau giải đông được chuyển lần lượt vào dung dịch V1 và V2 mỗi lần 5 phút. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 5) Sử dụng 3 phương pháp phổ biến bảo quản lạnh tế bào trứng hiện nay là: thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở, thủy tinh hóa vi giọt. Nghiên cứu này sẽ xác định phương pháp thích hợp nhất với trứng trâu (trong điều kiện tại Việt Nam) khi sử dụng dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc và dung dịch giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6 và 7. Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 6) Dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc, dung dịch giải đông và phương pháp đông lạnh thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trước sẽ áp dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào trứng trâu sẽ được đông lạnh ở các thời điểm nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ). 2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê Số liệu của tất cả các nội dung nghiên cứu trong luận án này được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excell 2007, sự khác nhau có ý nghĩa được kiểm tra bằng χ2 sử dụng hàm CHITEST, sự sai khác có ý nghĩa với P< 0,05. 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm 2013 tại: - Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi. - Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội. 6 Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ Bảng 2: Chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ Số buồng trứng 565 Số tế bào trứng thu được Số tế bào trứng thu được/buồng trứng (M ± SE) Số tế bào trứng loại A, B Số tế bào trứng loại A, B/buồng trứng (M ± SE) Số tế bào trứng loại C, D Số tế bào trứng loại C, D/buồng trứng (M ± SE) 2770 4,9 ± 0.36 1130 2 ± 0,2 1640 2,9 ± 0,33 Kết quả bảng 2 cho thấy trung bình thu được 4,9 tế bào trứng/buồng trứng trâu, trong đó 2 tế bào trứng tốt/buồng trứng. Kết quả này là thấp hơn so với một số gia súc khác như bò, lợn. Nguyên nhân là do: bản thân buồng trứng trâu có số lượng nang trứng nguyên thủy ít, tỷ lệ nang trứng nhỏ và kém chất lượng trên buồng trứng trâu cũng chiếm một tỷ lệ lớn (82 - 92%), tỷ lệ nang thoái hóa ở buồng trứng trâu cũng cao (70,6 82%), chất lượng trâu ở lò mổ, mùa thu buồng trứng, số lượng buồng trứng, kích thước và giai đoạn của chu kỳ buồng trứng và kỹ thuật thao tác của kỹ thuật viên. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu 3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu Kết quả của nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau (P>0,05) khi so sánh tỷ lệ thành thục giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi bổ sung riêng lẻ FCS và FSH (Bảng 3). Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199 thì môi trường Ham’s F-10 cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với TCM 199 (tương ứng là 74,64% và 63,28%; P<0,05). Thậm chí theo kết quả ở bảng 3, khi nuôi tế bào trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi cao nhất (74,64%; P<0,05). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy Ham’s F-10 nâng cao được hiệu quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu hơn TCM 199. 3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu Kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc bổ sung riêng lẻ FSH vào môi trường TCM 199 và Ham’s F-10 cho tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FCS vào hai môi trường này (Bảng 4). Hiệu quả của việc tạo phôi trâu in vitro được nâng cao khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s 7 F-10 và TCM 199. Tỷ lệ phân chia (tương ứng 78,26% và 65%); tạo phôi dâu, phôi nang (tương ứng 29,35% và 18,75%) trong môi trường nuôi có bổ sung kết hợp FSH và FCS cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FSH, FCS (P<0,05; Bảng 4). Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu được thành thục trong môi trường Ham’s F-10 + FCS + FSH là cao hơn so với các môi trường còn lại (tương ứng là 78,26%; 29,35%; P<0,05). Kết quả của chúng tôi cho thấy việc sử dụng môi trường Ham’s F-10 trong quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu mang lại hiệu quả tạo phôi trâu in vitro cao hơn so với môi trường TCM 199 ở cùng điều kiện. Kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 đã chỉ ra rằng tế bào trứng trâu được nuôi thành thục in vitro trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ thành thục, phân chia và tạo phôi hiệu quả hơn các môi trường còn lại. Với kết quả đó chúng tôi sử dụng môi trường nuôi thành thục in vitro Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho các thí nghiệm nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu trong luận án này. Bảng 3: Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi khác nhau Tế bào trứng thành thục Môi trường Số tế bào trứng nuôi thành thục Số tế bào trứng % (M ± SE) TCM 199 + FCS 203 102 50,24c ± 1,38 TCM 199 + FSH 200 103 51,5c ± 1,47 TCM 199 + FCS + FSH 207 131 63,28b ± 1,72 Ham F10 + FCS 213 108 50,7c ± 1,39 Ham,s F10 + FSH 209 112 53,6c ± 1,28 Ham,s F10 + FCS + FSH 209 156 74,64a ± 1,76 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 8 Bảng 4: Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau Tế bào trứng phân chia Môi trường Phôi dâu, phôi nang Số tế bào trứng thụ tinh Số tế bào trứng % (M ± SE) Số phôi dâu, phôi nang % (M ± SE) TCM 199 + FCS 123 51 41,46c ± 1,36 10 8,13c ± 1,55 TCM 199 + FSH 129 67 51,94c ± 1,47 11 8,53c ± 1,75 TCM 199 + FCS + FSH 160 104 65b ± 0,9 30 18,75b ± 0,93 Ham F10 + FCS 127 65 51,18c ± 1,34 11 8,66c ± 1,19 Ham F10 + FSH 138 94 68,12b ± 1,12 25 18,12b ± 1,41 Ham F10 + FCS + FSH 184 144 78,26a ± 1,79 54 29,35a ± 1,25 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau Kết quả nghiên cứu của luận án này cho thấy khi nhuộm nhân các tế bào trứng trâu loại A, B ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (tương ứng với thời gian nuôi in vitro 0 giờ) để kiểm tra, tất cả các tế bào trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV) (100%). Theo kết quả thu được trong nghiên cứu này thì tại thời điểm nuôi thành thục 9 12 giờ và 18 giờ, nhân tế bào trứng trâu chủ yếu tồn tại tương ứng ở kỳ giữa I (95,43%) và kỳ cuối I (64,57%). Đến thời điểm nuôi thành thục 24 giờ: 74,88% tế bào trứng có nhân đạt tới trạng thái thành thục và thể cực thứ nhất đã hình thành xong. Bảng 5: Trạng thái nhân tế bào trứng trâu ở các thời điểm nuôi khác nhau Thời Số tế Số tế bào trứng trâu ở các giai đoạn phát triển nhân tại các thời điểm nuôi khác nhau gian bào % (M ±S E) nuôi trứng in nuôi in vitro vitro 0 giờ 221 Tiền Túi mầm kỳ Kỳ giữa I Kỳ sau I Kỳ cuối I Thành thục giữa I Thoái hóa 221 (100 ± 0) 216 6 giờ 218 1 1 (99,08 ± 0,79) 209 12 giờ 219 1 5 1 3 (95,43 ± 1,13) 59 18 giờ 24 giờ 223 219 1 1 6 6 144 11 2 (26,46 ± 1,12) (64,57 ± 1,41) 18 17 164 (8,22 ± 0,48) (7,76 ± 0,55) (74,88 ± 1,4) 9 4 Sau 6 giờ nuôi thành thục in vitro tỷ lệ tế bào trứng có nhân ở giai đoạn GV vẫn rất cao (99,08%). Điều này cho thấy đối với tế bào trứng trâu thời gian tồn tại của nhân ở giai đoạn túi mầm là khá dài. Kết quả ở bảng 5 cho thấy tại mỗi thời điểm nuôi thành thục in vitro khác nhau, nhân tế bào trứng trâu tồn tại ở các trạng thái khác nhau, và đó có thể là nguyên nhân khiến tế bào trứng sẽ có mức độ chịu đựng những tổn thương lạnh khác nhau ở mỗi giai đoạn nuôi thành thục in vitro. 3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EG là chất bảo vệ lạnh có ảnh hưởng tốt hơn so với DMSO, PROH, Gly kể cả khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong quá 10 trình đông lạnh – giải đông đối với tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục. Tỷ lệ tế bào trứng có hình dạng bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông, tỷ lệ thành thục in vitro trở lại của các tế bào trứng này cao nhất là ở nhóm EG (70,04%; 19,07%; P <0,05) và thấp nhất là ở nhóm EG + Gly (44,81%; 4,63; P<0,05) (Bảng 6). Bảng 6: Khả năng sống và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông trong các dạng chất bảo vệ lạnh khác nhau Số tế bào Chất bảo vệ trứng lạnh đông lạnh Tế bào trứng có hình thái bình Tế bào trứng thành thục thường sau đông lạnh – giải đông % Số tế bào trứng % (M ± SE) Số tế bào trứng % (M ± SE) EG 247 173 70,04a ± 0,46 33 19,07a ± 1,05 DMSO 244 134 54,91bcd ± 0,49 11 8,21b ± 0,59 PROH 238 143 60,08b ± 0,44 12 8,4b ± 0,54 Gly 240 117 48,75ce ± 0,35 8 6,84b ± 1,14 EG + DMSO 240 138 57,5bc ± 0,71 13 9,86b ± 0,82 EG + PROH 239 143 59,83bd ± 0,46 12 8,4b ± 0,57 EG + Gly 241 108 44,81ef ± 0,45 5 4,63b ± 1,39 DMSO + PROH 245 121 49,39cf ± 1,01 9 7,44b ± 0,89 DMSO + Gly 247 142 57,49bcd ± 0,57 14 9,42b ± 0,69 PROH + Gly 246 127 51,63bcdf ± 0,61 12 9,45b ± 0,69 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không có chữ cái giống nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Bảng 6 cho thấy tỷ lệ thành thục in vitro của các nhóm kết hợp dao động từ 4,63% - 9,86%; cao nhất là ở nhóm EG + DMSO và thấp nhất ở nhóm EG + Gly, tuy nhiên sự 11 khác nhau này là không có ý nghĩa (P<0,05). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự kết hợp giữa DMSO với EG hoặc PROH, EG với Gly không có hiệu quả đối với sự thành thục nhân của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông. 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu Bảng 7: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở các nồng độ EG khác nhau Chất bảo vệ lạnh Số tế bào trứng đông lạnh Tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnhgiải đông Số tế bào trứng Tế bào trứng thành thục % (M ± SE) Số tế bào trứng % (M ± SE) EG 2M 244 117 47,95c ± 0,29 7 5,98b ± 0,67 EG 4M 241 145 60,17b ± 0,37 12 8,28b ± 0,95 EG 6M 247 173 70,04a ± 0,46 33 19,07a ± 1,05 EG 8M 246 98 39,84c ± 0,31 6 6,12b ± 0,26 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Dựa vào kết quả của mục 3.4.1, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng chất bảo vệ lạnh là Ethylene glycol để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis. Kết quả thể hiện ở bảng 7. Nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông cao nhất là ở nhóm EG 6M (70,04%; P<0,05); thấp nhất là ở nhóm EG 8M (39, 84%; P<0,05). Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông cao nhất là ở nhóm EG 6M (19,07%; P<0,05) và thấp nhất là ở nhóm EG 2M (5,98%; P<0,05). Kết quả trên cho thấy nếu nồng độ chất bảo vệ lạnh không thích hợp, cho dù là sử dụng phương pháp thủy tinh hóa thì hiệu quả đông lạnh vẫn kém. 12 Mặc dù trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác nhau về tỷ lệ thành thục in vitro giữa các nhóm EG 2M, EG 4M, EG 8M (tương ứng: 5,98%; 8, 28% và 6,12%) nhưng sự khác nhau là không có ý nghĩa (P>0,05). Kết quả ở bảng 7 cho thấy nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông lạnh cho hiệu quả cao nhất là 6M, các nồng độ còn lại đều cho tỷ lệ thấp hơn. Theo kết quả đạt được trong nghiên cứu này nhận thấy có sự giới hạn về nồng độ chất bảo vệ lạnh được sử dụng và nồng độ 8M là giới hạn cuối cùng. Kết quả thể hiện ở bảng 7 cho thấy, tại nồng độ 8M tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông giảm đáng kể, vì vậy không nên sử dụng nồng độ cao hơn nồng độ này trong bảo quản lạnh tế bào trứng trâu. Nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ ảnh hưởng bất lợi đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng. Nguyên nhân lý giải cho điều này là do chất bảo vệ lạnh ngoài vai trò tích cực bảo vệ tế bào trong quá trình đông lạnh thì nó còn có những độc tố có thể gây ảnh hưởng đến tế bào. Khi nồng độ chất bảo vệ lạnh cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và độc tố của chất bảo vệ lạnh, do đó sẽ gây tổn thương đến tế bào trứng khi chúng được tiếp xúc 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu Dựa vào kết quả của mục 3.4.2, trong thí nghiệm này sử dụng EG ở nồng độ 6M để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis (Bảng 8). Bảng 8: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở các thời gian tiếp xúc khác nhau (tiếp xúc 2 bước) Tế bào trứng thành thục Thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng Số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông Số tế bào trứng % (M ± SE) 30 giây 173 33 19,07bc ± 1,05 1 phút 209 64 30,62ab ± 0,45 2 phút 128 26 20,31bc ± 0,39 3 phút 89 9 10,11c ± 1,26 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 13 Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ tế bào trứng có khả năng sống và thành thục in vitro trở lại bị ảnh hưởng bởi các mức thời gian tiếp xúc khác nhau. Theo kết quả của nghiên cứu này thì tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh – giải đông cao nhất ở nhóm tiếp xúc 1 phút (30,62%; P<0,05), thấp nhất là ở nhóm 3 phút (10,11%; P<0,05). Sự khác nhau về tỷ lệ thành thục giữa hai nhóm tiếp xúc 30 giây và tiếp xúc 2 phút là không có ý nghĩa (tương ứng: 19,07% và 20,31%; P>0,05). Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại giảm dần và khác nhau có ý nghĩa theo thời gian tiếp xúc từ mức thời gian 1 phút (P<0,05). Trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng thời gian tế bào trứng tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh là yếu tố rất quan trọng đảm bảo cho sự thành công của quá trình này. Khi thời gian tiếp xúc quá dài sẽ làm cho tế bào trứng chịu nhiều ảnh hưởng bất lợi từ độc tố của chất bảo vệ lạnh dẫn đến những tổn thương không thể hồi phục. Nhưng nếu thời gian tiếp xúc quá ngắn, tế bào trứng không loại bỏ được hết nước nội bào thì sẽ dẫn đến sự hình thành tinh thể đá trong quá trình đông lạnh, do đó sẽ làm tổn thương tế bào trứng và làm giảm hiệu quả của quá trình đông lạnh-giải đông. 3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu Từ kết quả của mục 3.4.1; 3.4.2 và 3.4.3; thí nghiệm này được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis dựa trên cơ sở sử dụng chất bảo vệ lạnh thấm màng EG ở nồng độ 6M, tiếp xúc 2 bước với thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút. Kết quả thể hiện ở bảng 9. Tỷ lệ tế bào trứng thành thục in vitro trở lại được tính dựa trên số tế bào trứng thành thục/số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông. Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu không chỉ phụ thuộc vào quá trình đông lạnh mà còn phụ thuộc vào quá trình giải đông. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 9 cho thấy việc sử dụng sucrose như là chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông có hiệu quả hơn khi không sử dụng sucrose. Tỷ lệ tế bào trứng trâu chưa thành thục có khả năng sống và thành thục in vitro trở lại sau đông lạnh giải đông của nhóm có sucrose là cao hơn nhóm không sucrose (tương ứng: 40,63% và 30,62%; P<0,05). Sucrose là chất bảo vệ lạnh không thấm màng thường được sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng hoặc phôi. Trong môi trường đông lạnh hoặc giải đông chúng hỗ trợ cho sự ổn định cấu trúc màng tế bào. Trong quá trình thủy tinh hóa, succrose có bản chất là đại phân tử nên chúng có thể tạo nên gradien nồng độ thông qua màng tế bào; nhờ đó giúp cho quá trình khử nước nội bào của tế bào xảy ra hoàn thiện hơn. Thêm vào đó sucrose hoạt động giống như đệm thẩm thấu để giảm shock thẩm thấu và những ảnh hưởng bất lợi của chất bảo vệ 14 lạnh đến tế bào trứng trong quá trình giải đông, qua đó giúp cho quá trình đông lạnh – giải đông đạt được sự thành công. Bảng 9: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi giải đông trong dung dịch có hoặc không có Sucrose Giải đông Số tế bào trứng không đông lạnh nuôi thành thục Số tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông Tế bào trứng thành thục Số tế bào trứng % (M ± SE) Không sucrose 209 64 30,62c ± 0,45 Có sucrose 192 78 40,63b ± 0,44 156 74,64a ± 1,76 Đối chứng (Tế bào trứng không đông lạnh) 209 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) Quá trình giải đông là một phần đảm bảo cho sự thành công của quy trình thủy tinh hóa, trong đó chất bảo vệ lạnh không thấm màng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình giải đông. Trong suốt quá trình giải đông, nước được tạo ra bởi sự tan chảy của đá một cách nhanh chóng dẫn đến sự giảm áp suất thẩm thấu nội bào. Shock thẩm thấu có thể xảy ra nếu chất bảo vệ lạnh trong nội bào không thể khuếch tán ra ngoài một cách nhanh chóng đủ để ngăn chặn sự tràn vào của nước tự do, dẫn đến sự gẫy vỡ tế bào. Sự có mặt của các chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong dung dịch giải đông sẽ nâng cao được hiệu quả của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng và phôi. Thêm vào đó việc cho tế bào trứng trâu sau giải đông vào dung dịch có nồng độ sucrose ban đầu cao, tiếp theo là chuyển sang dung dịch có chứa nồng độ sucrose thấp hơn là cần thiết. Bằng cách này các tế bào trứng được chuyển trực tiếp từ dung dịch có chứa các chất bảo vệ lạnh vào dung dịch sucrose đẳng trương với các chất bảo vệ lạnh. Nhờ vào tính không thấm màng của mình, sucrose hỗ trợ quá trình loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh thấm màng ra khỏi tế bào trứng, đồng thời giúp cho tế bào trứng không bị tổn thương về mặt cấu trúc (co rút hoặc sưng phồng) trong quá trình giải đông. 15 Mặc dù có sự cải thiện về tỷ lệ thành thục khi sử dụng chất bảo vệ lạnh không thấm màng trong quá trình giải đông nhưng kết quả vẫn thấp hơn so với đối chứng (tương ứng 40,63% so với 74,64%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào trứng chưa thành thục, sự thành thục trở lại của tế bào trứng sau đông lạnh giải đông bị ảnh hưởng bởi quá trình đông lạnh – giải đông. Kết quả được nêu ra ở mục 3.4.1; 3.4.2; 3.4.3; 3.4.4 của nghiên cứu này cho thấy chất bảo vệ lạnh thấm màng Ethylene glycol có hiệu quả tốt hơn trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy. Việc sử dụng riêng lẻ Ethylene glycol ở nồng độ 6M và cách thức tiếp xúc 2 bước, thời gian tiếp xúc ở bước cuối cùng là 1 phút, kết hợp cùng với sucorose trong quá trình giải đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho tế bào trứng trâu đầm lầy trong nghiên cứu này. 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh –giải đông Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông trong nghiên cứu của chúng tôi ở mỗi nhóm thí nghiệm dao động từ 84,66% đến 93,75% (Bảng 10). Bảng 10: Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông Phương pháp Số tế bào trứng đông lạnh Tế bào trứng thu được sau đông lạnhgiải đông Số tế bào trứng % (M ± SE) Cọng rạ truyền thống 378 320 84,66b ± 2,84 Cọng rạ hở 368 345 93,75a ± 1,44 Vi giọt 372 336 90,32a ± 2,32 Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ýnghĩa (P<0,05) Có nhiều nguyên nhân như: tế bào trứng bị dính vào cọng rạ vì bề mặt cọng rạ rạn hoặc ghồ ghề (hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình giải đông) hoặc tế bào trứng bị tan rã trong quá trình đông lạnh. Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh-giải đông ở nhóm cọng rạ truyền thống là thấp nhất so với nhóm cọng rạ hở và vi giọt (tương ứng 84,66%; so với 93,75% và 90,32%; P<0,05); sự khác nhau giữa nhóm cọng rạ hở và vi giọt là không có ý nghĩa. 16 Cọng rạ truyền thống dễ bị nổ, vỡ hoặc rạn nứt do sự thay đổi áp suất khi chúng được nhúng ngập trong nitơ lỏng hoặc bể ấm (giải đông). Nguyên nhân có thể là do thành cọng rạ dày nên cọng rạ dễ bị vỡ và mất mẫu trong quá trình đông lạnh – giải đông. Sự thay đổi áp suất trong cọng rạ khi được nhúng ngập trong nitơ lỏng trong quá trình đông lạnh hoặc khi đưa vào bể ấm 37oC trong quá trình giải đông có thể làm cho cọng rạ bị nứt hoặc vỡ. Để hạn chế được điều này, trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống, cọng rạ trước khi được nhúng ngập thẳng trong nitơ lỏng sẽ được để trên hơi nitơ lỏng ; hoặc trong quá trình giải đông trước khi chuyển cọng rạ vào bể ấm 37oC cọng rạ sẽ được để trong không khí 5-10 giây. Tuy nhiên do sự thay đổi nhiệt độ của hơi nitơ lỏng và không khí xung quanh mà vẫn xảy ra hiện tượng nổ, vỡ hoặc rạn nứt cọng rạ trong quá trình giải đông. Kết quả ở bảng 10 cho thấy tỷ lệ thu hồi tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông ở nhóm cọng rạ hở là cao hơn so với nhóm cọng rạ truyền thống và vi giọt. 3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh – giải đông Kết quả của nghiên cứu này được thể hiện ở bảng 11. Bảng 11: Chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông Phương pháp Số tbt thu được sau ĐL - GĐ Tế bào trứng có hình thái bình thường thu được sau ĐL - GĐ Tế bào trứng có hình thái không bình thường thu được sau ĐL - GĐ Số tế bào trứng % (M ± SE) Số tế bào trứng % (M ± SE) Cọng rạ truyền thống 320 265 82,81b ± 2,48 55 17,19a ± 2,48 Cọng rạ hở 345 315 91,3a ± 1,73 30 8,7b ± 1,73 Vi giọt 336 302 89,88a ± 2,73 34 10,12b ± 2,73 Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05). Tế bào trứng: tbt. Đông lạnh-giải đông: ĐL-GĐ Kết quả ở bảng 11 cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh-giải đông dao động từ 82,81% đến 91,3% tùy thuộc vào phương pháp đông lạnh. Tỷ lệ tế bào trứng thu được có hình thái bình thường ở nhóm cọng rạ hở và vi giọt đều cao hơn (P<0,05) so với cọng rạ truyền thống cho thấy phương pháp thủy tinh hóa sử dụng cọng rạ hở và vi giọt có hiệu quả hơn so với phương pháp sử dụng cọng rạ 17 truyền thống. Mặc dù cả ba phương pháp này đều sử dụng một loại môi trường pES, VS với cùng một nồng độ chất bảo vệ lạnh nhưng chất lượng tế bào trứng thu được sau đông lạnh – giải đông ở nhóm cọng rạ truyền thống vẫn kém hơn nhóm cọng rạ hở và vi giọt. Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể là do trong phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và vi giọt, vật chứa mẫu có cấu tạo ưu thế hơn nên đã làm tăng tốc độ đông lạnh-giải đông, nhờ đó tế bào trứng vượt qua được vùng nhiệt độ nguy hiểm, giảm thiểu những tác động nguy hiểm do độc tố của chất bảo vệ lạnh và áp suất thẩm thấu gây ra. Cọng rạ truyền thống có thành cọng rạ dày vì vậy nó tạo ra lớp cách nhiệt giữa môi trường chứa tế bào trứng và nitơ lỏng nên làm giảm tốc độ đông lạnh, quá trình thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn nên ảnh hưởng đến chất lượng của tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông. Trong phương pháp cọng rạ hở đường kính và độ dày của thành cọng rạ hở được giảm đi đáng kể so với cọng rạ truyền thống (tương ứng từ 1,7mm xuống 0,8mm và từ 0,15mm xuống 0,07mm). Còn trong phương pháp vi giọt vật chứa mẫu là dạng vi giọt chỉ gồm dung dịch VS và tế bào trứng; giữa dung dịch chứa mẫu và nitơ lỏng không có lớp cách nhiệt do chúng được tiếp xúc trực tiếp; do đó tốc độ đông lạnh-giải đông ở hai phương pháp này được gia tăng đáng kể so với phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ truyền thống. 3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông Tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh-giải đông được đánh giá khả năng sống và phát triển thông qua quá trình nuôi thành thục in vitro, khả năng tạo phôi sau khi được tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm (Bảng 12). Trong nghiên cứu này, chỉ sử dụng những tế bào trứng sau đông lạnh – giải đông có khả năng thành thục (đủ tiêu chuẩn thụ tinh) để đánh giá khả năng tạo phôi tiếp theo. Trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh là trứng sau nuôi thành thục có lớp tế bào nang giãn nở, khối tế bào chất đồng đều. Tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh (30,94%), phân chia (18,29%) và tạo phôi dâu, phôi nang (2,44%) của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh-giải đông ở nhóm cọng rạ truyền thống vẫn thấp hơn so với hai nhóm còn lại (P<0,05). Mặc dù sự khác nhau về tỷ lệ phân chia giữa nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở và vi giọt trong nghiên cứu của chúng tôi là không có ý nghĩa (tương ứng là 37,98% và 30,83%; P>0,05); nhưng sự khác nhau trong việc tạo phôi dâu, nang là có ý nghĩa (tương ứng là 10,08% so với 3,31%; P<0,05). Trong nghiên cứu này tỷ lệ tế bào trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia cũng như tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông ở nhóm thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là cao hơn so với hai nhóm còn lại có thể là do ở trong phương pháp cọng rạ hở lượng thể tích được giảm thiểu đáng kể (1-2µl so với 15-20µl đối với vi giọt và 150µl đối với cọng rạ truyền thống). Việc giảm thể tích dung dịch thủy tinh hóa chứa mẫu đông lạnh làm tăng tốc độ đông lạnh-giải đông; nhờ đó làm giảm đi những ảnh hưởng bất lợi cho tế bào trứng. 18 Bảng 12: Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông Phương pháp Số tế bào trứng có hình thái bình thường sau ĐL – GĐ được nuôi in vitro Tế bào trứng đủ tiêu chuẩn dùng cho thụ tinh Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang Số tế bào trứng % (M ± SE) Số tế bào trứng % (M ± SE) Số phôi dâu, phôi nang % (M ± SE) Cọng rạ truyền thống 265 82 30,94c ± 2,68 15 18,29c ± 3,26 2 2,44c ± 4,6 Cọng rạ hở 315 129 40,95b ± 1,33 49 37,98b ± 2,52 12 10,08b ± 3,9 Vi giọt 302 120 39,73b ± 1,7 37 30,83b ± 2,06 4 3,31c ± 3,56 Đối chứng (Tế bào trứng không đông lạnh) 351 263 74,93a ± 1,54 205 77,95a ± 2,24 78 29,66a ± 1,66 Ghi chú: Các giá trị có chữ cái khác nhau trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 19 Khả năng phân chia, tạo phôi của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnhgiải đông ở phương pháp vi giọt vẫn kém hơn so với phương pháp cọng rạ hở. Nguyên nhân có thể là do lượng thể tích dung dịch chứa mẫu trong phương pháp thủy tinh hóa vi giọt vẫn lớn hơn so với cọng rạ hở (15-20µl so với 1-2µl). Thêm vào đó khi giọt dung dịch VS có chứa tế bào trứng được thả thẳng vào trong nitơ lỏng sẽ hình thành xung quanh nó một lớp áo khoác hơi. Giải thích cho hiện tượng này khá đơn giản: điểm sôi của nitơ lỏng là -196oC, chính vì thế bất kỳ một vật gì ấm hơn nó và liên kết với nó sẽ gây ra hiện tượng sôi và bốc hơi mạnh trên bề mặt của nó, do đó sẽ hình thành xung quanh vi giọt một lớp áo khoác hơi bao xung quanh nó. Dạng áo khoác hơi này không chỉ có chức năng như một lớp cách nhiệt mà còn làm chậm quá trình chìm xuống nitơ lỏng của giọt dung dịch VS này, do đó nó cũng làm giảm tốc độ đông lạnh và ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh. Theo kết quả thể hiện ở bảng 12, mặc dù phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp cọng rạ truyền thống và vi giọt nhưng tỷ lệ trứng đủ tiêu chuẩn thụ tinh, phân chia, tạo phôi của nhóm cọng rạ hở vẫn thấp hơn so với đối chứng (tương ứng là 74,93%; 77,95%; 29,66%; P<0,05). Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là các tế bào trứng ở giai đoạn chưa thành thục. Dựa trên kết quả của mục 3.5.1; 3.5.2; 3.5.3 cho thấy khi đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ hở mang lại hiệu quả tốt hơn so với phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và vi giọt. Thủy tinh hóa bằng cọng rạ hở là một phương pháp đông lạnh đơn giản, hiệu quả trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu mà không ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông. 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh-giải đông dao động từ 91,3% đến 98,31% tùy thuộc vào giai đoạn nuôi thành thục (Bảng 13). Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau giữa các nhóm 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ (tương ứng 91,3%; 92,28%, 91,87%, P>0,05) và giữa nhóm 18giờ, 24 giờ (97,72%, 98,31%, P>0,05) về tỷ lệ tế bào trứng có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông. Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông ở nhóm 24 giờ trong nghiên cứu này là cao hơn so với các nhóm còn lại (P<0,05). 20