Tài liệu Tham gia trong nghiên cứu phân lập một số hợp chất từ dịch chiết nước của củ đinh lăng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA HÓA HỌC VIÊN ̣ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN ------------ BÁO CÁO THỰC TẬP NGHỀ NGHIỆP “THAM GIA TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT NƯỚC CỦA CỦ ĐINH LĂNG” Sinh viên thực tập: MSSV: Lớp: Đà Lạt, tháng 5 năm 2019 Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo quý Công ty đã tiếp nhận em vào thực tập tại Nhà máy chế biến số 2 – Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận Tại Ninh Thuận. Cảm ơn tất cả các Chị trong phòng Kiểm nghiệm đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình viết bài báo cáo mà còn là hành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin để thực hiện công việc sau này. Em kính chúc Ban lãnh đạo Công ty và các Chị trong phòng Kiểm nghiệm dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Phan Rang, tháng 12 năm 2017 Người thực hiện Nguyễn Nghiêm 2 MỤC LỤC Lời cảm ơn......................................................................................................................... 1 I. GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THÔNG THUẬN.................................................2 II. KHÁNG SINH..............................................................................................................4 2.1.Khái niệm kháng sinh...............................................................................................4 2.2. Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân và tác hại.........................................................4 2.2.1. Dư lượng kháng sinh.........................................................................................4 2.2.2. Nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh.......................................5 2.2.3. Tác hại dư lượng kháng sinh..............................................................................5 2.3. PHƯƠNG PHÁP ELISA.........................................................................................6 2.3.1. Khái niệm:.........................................................................................................6 2.3.2. Phân loại:...........................................................................................................7 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA..................................7 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA.........................................................7 2.3.5. Ứng dụng:..........................................................................................................8 2.4. KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA........................8 2.4.1.Kiểm Enrofloxacin bằng phương pháp Elisa......................................................8 2.4.2. Kiểm Doxycyline bằng phương pháp Elisa.....................................................11 2.4.3.Kiểm Chloramphenicol bằng phương pháp Elisa.............................................13 2.4.4. Kiểm Sulfonamide bằng phương pháp Elisa....................................................16 2.4.5. Kiểm Nitrofuran AOZ bằng phương pháp Elisa..............................................19 3 LỜI MỞ ĐẦU 4 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG TY TNHH THÔNG THUẬN 1.1. Thông tin về đơn vị thực tập Công ty TNHH Thông Thuận được thành lập theo giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh số 004339/GP-TLDN do sở kế hoạch và đầu tư tỉnh Bình Thuận cấp ngày 11 tháng 08 năm 1999. Tiền thân của Công ty TNHH Thông Thuận là một cơ sở sản xuất tôm giống hình thành từ năm 1990, do ông Trương Hữu Thông gầy dựng nên tại xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận. Trong tiến trình lịch sử đầy thăng trầm, công ty đã phát triển ngày càng lớn mạnh và vững chắc cho đến hôm nay và đã khẳng định thế mạnh dẫn đầu cả nước trong ngành sản xuất tôm giống; nuôi tôm thương phẩm, chế biến thủy sản xuất khẩu, sản xuất gạch tuynel và sản xuất muối công nghiệp. Hoạt động sản xuất Công ty bao gồm: 1) 2) 3) 4) 5) Sản xuất tôm giống Thông Thuận Sản xuất tôm thương phẩm Sản xuất gạch Tuynel Chế biến thủy sản xuất khẩu Nuôi bò giống thịt, bò sữa công nghệ cao Công ty phát triển như ngày hôm nay phần lớn nhờ sự nổ lực không ngừng của người sáng lập đầu tiên, Ông Trương Hữu Thông - Chủ tịch Hội Đồng Quản Trị kiêm Tổng Giám đốc công ty và hơn 5.000 tập thể cán bộ, công nhân viên của các đơn vị trong Tổng công ty Thông Thuận, cộng với sự đồng thuận của lãnh đạo các địa phương, các khách hàng trong và ngoài nước đã quan tâm ủng hộ. Sản xuất tôm giống chất lượng: Công ty có 7 khu sản xuất tôm giống, với trên 100 trại giống hiện đại (đạt các chứng nhận GlobalGAP, ACC của châu Âu và Mỹ). Hàng năm, Công ty sản xuất và cung ứng hơn 5 tỷ con giống đạt chất lượng cao, phù hợp với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng tại Việt Nam, sau nhiều năm tìm tòi và chọn lọc từ các nguồn tôm bố mẹ tốt nhất trên thế giới; Công tác sản xuất giống đều tuân thủ theo các quy trình nghiêm ngặt và được thực hiện bởi đội ngũ công nhân lành nghề và cán bộ kỹ thuật trình độ cao, nhiều kinh nghiệm Nuôi tôm thương phẩm: Ngoài ra, Thông Thuận còn có các xí nghiệp tôm thương phẩm với số lượng farm nuôi lớn, đặt tại 4 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận và Kiên Giang. Đạt được các chứng chỉ GlobalGAP, ACC với sản lượng 10.000 - 12.000 tấn/năm. Tôm thương 5 phẩm của Công ty TNHH Thông Thuận luôn được nuôi và cho ăn theo quy trình công nghệ vi sinh hiện đại, tuân thủ nghiêm ngặt theo các tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm khắt khe. Với số lượng farm nuôi lớn trải dài dọc khắp miền Trung và Tây Nam bộ, hằng năm, Công ty cung cấp nguyên liệu cho hệ thống nhà máy chế biến của Công ty và thị trường cả nước. Tôm thương phẩm của Thông Thuận luôn được thị trường đánh giá tốt về chất lượng và độ an toàn. Với các xí nghiệp tôm được đầu tư hiện đại, sản xuất hiệu quả: Xí nghiệp nuôi tôm Ninh Hòa: với 30 ha diện tích nuôi và 30 ao nuôi. Sản lượng hơn 400 tấn/ năm; Xí nghiệp nuôi tôm Cam Ranh: với 75 ha diện tích nuôi và 106 ao nuôi. Sản lượng 1.400 tấn/năm; Xí ngiệp nuôi tôm Phan Rang: với 16 ha diện tích nuôi và 16 ao nuôi. Sản lượng 260 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Núi Tào: với 160 ha diện tích nuôi và 170 ao nuôi. Sản lượng 2.500 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Phước Thể: với 31 ha diện tích và 50 ao nuôi. Sản lượng 650 tấn/năm; Xí nghiệp nuôi tôm Kiên Giang: hiện đang nuôi với 300 ha diện tích tại 3 xí nghiệp nuôi như sau :  Xí nghiệp nuôi tôm số 1: 75 ha với 80 ao. Sản lượng 1.000 tấn/năm  Xí nghiệp nuôi tôm số 2: 90 ha với 137 ao. Sản lượng 1.500 tấn/năm  Xí nghiệp nuôi tôm số 3: 135 ha với 244 ao. Sản lượng 2.500 tấn/năm. . Thông Thuận - Kiên Giang sẽ có diện tích nuôi lên đến 1.200 ha với 1.000 ha nuôi tôm và 200 ha nuôi cá rô phi. Sản lượng tôm lúc đó tại Kiên Giang sẽ tăng lên 13.000 tấn tôm thương phẩm/năm. Chế biến, xuất khẩu sản phẩm thủy sản: Với thế mạnh trong lĩnh vực nuôi tôm giống, tôm thương phẩm và nguồn nguyên liệu chủ động, chất lượng, Thông Thuận đã mạnh dạn đầu tư vào lĩnh vực chế biến xuất khẩu thủy sản. Đến nay, Công ty đã có hai nhà máy đang hoạt động với sản phẩm đầu ra đạt các tiêu chuẩn quốc tế, đáp ứng những yêu cầu khắt khe của nhiều thị trường khó tính trên thế giới như EU, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Đông. Chi nhánh Công ty TNHH MTV Thông Thuận - Kiên Giang: hoạt động mạnh trong lĩnh vực nuôi tôm thương phẩm. Đạt được các chứng chỉ GlobalGAP 3 sao, ACC với sản lượng hơn 4.500 tấn/năm. Hiện, Công ty đang đầu tư mở rộng farm nuôi và nhà máy chế biến thủy sản. Gồm 2 phân xưởng: Phân xưởng chế biến tôm xuất khẩu với sản lượng tới 7.000 - 8.000 tấn thành phẩm/năm và đang hoạt động rất hiệu quả. Phân xưởng cá với sản lượng 7.500 - 8.000 tấn/năm, sẽ đi vào hoạt động năm 2015 với năng lực chế biến tới 20 triệu USD/năm. Khi đi vào hoạt động sẽ tạo việc 6 làm ổn định cho 3.000 lao động địa phương, đảm bảo đầu ra cho sản phẩm tại các farm nuôi của Thông Thuận. Chi nhánh Công ty TNHH Thông Thuận - Ninh Thuận: hoạt động trên lĩnh vực sản xuất, chế biến thủy sản xuất khẩu. Đạt được các chứng chỉ GlobalGAP 3 sao, ACC 3 sao, HACCP, IFS, HALA… hằng năm cung cấp ra thị trường sản lượng hơn 3.000 tấn thành phẩm. Doanh số 20 triệu USD/năm, tạo việc làm ổn định cho hơn 2.000 lao động địa phương. Công ty CP Thủy sản Thông Thuận - Cam Ranh: hoạt động trên lĩnh vực sản xuất chế biến thủy sản xuất khẩu. Nhờ thế mạnh chủ động nguồn nguyên liệu, quy trình chế biến tuân thủ theo các chứng chỉ GlobalGAP, ACC 3 sao, HACCP, IFS, HALA. Doanh số trên 30 triệu USD/năm. II. KHÁNG SINH: 2.1.Khái niệm kháng sinh Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. 2.2. Dư lượng kháng sinh, nguyên nhân và tác hại 2.2.1. Dư lượng kháng sinh. Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh vẫn còn trong thực phẩm như thịt,tôm, cá, trứng, sữa, v.v… ở dạng nguyên chất hay đã chuyển hóa, vì thế có thể gây tác hại đối với người sử dụng. 2.2.2. Nguyên nhân cơ bản gây nhiễm dư lượng kháng sinh.  Mô ̣t là, do một số bô ̣ phâ ̣n nhỏ người dân chưa nắm được danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng hoặc vì lợi nhuận kinh tế đã lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong  phòng chống dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh và không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch tôm. Hai là, do một số cơ sở thu mua, sơ chế, chế biến thực hiện chưa tốt hệ thống quản lý chất lượng, chưa kiểm soát các mối nguy tới hạn tại các công đoạn sản xuất, kiểm soát chưa đầy đủ các loại hóa chất, kháng sinh trong khâu tiếp nhâ ̣n nguyên liê ̣u hoặc vô ý gây nhiễm trong quá trình sơ chế, chế biến. 7 2.2.3 Tác hại của dư lượng kháng sinh Tác hại đối với môi trường nuôi trồng thủy sản Do mô ̣t số người dân còn lạm dụng hóa chất trong xử lý nước, cải tạo ao nuôi đã tiêu diệt cả vi khuẩn có hại và vi khuẩn có lợi, gây mất cân bằng hệ sinh thái trong môi trường nuôi; sử dụng kháng sinh không đúng cách trong nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, gây nên hiện tượng lờn thuốc, khi tôm có bệnh xảy ra sẽ rất khó điều trị. Tác hại đối với người tiêu dùng Khi người tiêu dùng ăn phải sản phẩm thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe, gây ngộ độc, suy tủy, suy gan, suy thận, nếu tích tụ lâu ngày có thể dẫn đến ung thư, đột biến gen. Tác hại đối với quá trình xuất khẩu Nếu các thị trường trên thế giới không nhập khẩu tôm nuôi của Việt Nam do nhiễm dư lượng kháng sinh, khi đó thị trường trong nước sẽ không thể tiêu thụ hết sản phẩm tôm nuôi trong dân, dẫn đến giá thành tôm nguyên liệu giảm mạnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế của nước ta, đặc biệt đối với lĩnh vực thủy. 2.3. PHƯƠNG PHÁP ELISA. 2.3.1 Khái niệm Elisa (Enzyme-linked immunoSorbent Assay): Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với Enzyme. Dựa trên sự kết hợp giữ kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu.phản ứng tạo ra sản phẩm có màu hay phát sáng.trong đó tính chất hoạt hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi. Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp Elisa là độ nhạy cao có thể phát hiện được phức hợp nhỏ,cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm. Nhanh, thao tác đơn giản. Rẻ tiền. Nhược điểm: Độ chính xác không cao 2.3.2 Phân loại 8 ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase), gồm các phương pháp: ELISA trực tiếp (direct ELISA) ELISA gián tiếp (indirect ELISA) ELISA sandwich ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp ELISA  Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng  Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên.  Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên. 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA  Giếng không lên màu hoặc không xuất hiện chuẩn: Thao tác thiếu bước, không theo thứ tự, sử dụng sai hộp của Conjugate HRP, TMB bị hỏng.  Mật độ quang thấp: thuốc thử hết hạn hoặc sử dụng chung với một số lô khác, pha nước rữa không chính xác, rữa nhầm bộ Kit, rữa quá nhiều, thời gian ủ ngắn, nhiệt độ phòng thấp.  Mật độ quang cao: Nguồn nước cất pha đệm rữa không được đảm bảo, nhiệt độ phòng quá cao. 2.3.5 Ứng dụng  Pháp hiện được chất kháng sinh như chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ... ( chất không được phép có trong tôm,cá ,và các thủy sản khác)  Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu… 2.3.6 Dụng cụ,thiết bị:  Micropipette và Handstep  Ống đựng mẫu và ống eppendort  Tủ hút  Máy Vortex  Máy ly tâm  Máy đọc chỉ số  Tủ ấm  Bể điều nhiệt thổi khí Nito 9  Bộ kit và hóa chất tùy theo mỗi phương pháp 2.4. KIỂM NGHIỆM KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA  Nguyên lý của phương pháp  Dựa trên cơ chế cạnh tranh miễn dịch giữa chất kháng sinh (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) và cộng hợp Conjugate đánh dấu lên kháng thể đặc hiệu. Nồng độ (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) sẽ được hiển thị dựa trên mức độ phát quang của Conjugate. Do đó, chỉ cần căn cứ vào cường độ hiện màu của giếng thử là có thể xác định được mẫu thủy sản có nhiễm (Enrofloxacin, Chloramphenicol, Sulfonamide, Nitrofuran AOZ, Doxycycline) hay không và nhiễm với nồng độ bao nhiêu. Tất cả các quy trình từ đưa mẫu vào phân tích đến cho ra kết quả chỉ mất 3090 phút, nhanh hơn rất nhiều so với các phương pháp khác. 2.4.1 Kiểm Enrofloxacin bằng phương pháp ELISA Hóa chất và cách pha chế: - Microtiter plate: (12 x 8 well) 96 giếng - Enrofloxacin Antibody #1: (1 x 14ml) - 100X HRP Conjugate: (1 x 0.15ml) * 99 Enrofloxacin Antibody #1 : 1 100X HRP Conjugate - 10X Sample Extraction Buffer: (1 x 25ml) ở dạng cô đặc trước khi dùng phải được pha với nước cất. - 1ml 10X Sample Extraction Buffer : 9 nước cất - TMB Substrate : (1 x 12ml) sẵn để dùng - Stop Buffer: (1 x 14ml) sẵn để dùng - 20X Wash Solution: (1 x 28ml) đệm pha loãng/ rửa ở dạng cô đặc phải pha loãng với nước cất • 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất Cách tiến hành: 10 Cân 1g mẫu cho vào 4ml methanol 70% (CH3OH) Vortex 5 phút Ly tâm 15 phút 7000 vòng Hút 500 µl dịch trong bên trên cho và 500 µl 1X sample Extration (tỉ lệ 1:9) vào các ống eppendorf đã đánh dấu số thứ tự mẫu Lên giếng 50µl chuẩn cho vào 5 giếng Hút 50 µl mẫu cho vào các giếng Cho 100µl Conjugate cho vào tất cả các giếng Ủ trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa 3 lần bằng dung dịch đệm WE Cho 100 µl One shot substrate Ủ 20 phút Cho 100 µl stop solution Đọc kết quả Thuyết minh qui trình: Lấy lượng mẫu thích hợp khoảng 200g đem nghiền ( đồng nhất mẫu ) bằng máy nghiền mẫu ( mẫu chỉ lấy phần thịt tôm, loại bỏ đầu, vỏ, chỉ tôm…). Ý nghĩa của việc lấy mẫu: Là khâu đầu tiên trong phân tích kiểm nghiệm, nhưng có vai trò rất quan trọng, nếu lấy mẫu đúng nguyên tắc, sẽ đại diện cho lô hàng cần kiểm tra, làm cho kết quả phân tích và kết luận về lô hàng chính xác và ngược lại. 11 Cân 1g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, hút 4ml Methanol 70%, trộn mẫu bằng máy vortex trong 5 phút. Ly tâm ở 7000 vòng/phút, ly tâm 15 phút ở nhiệt độ phòng 250C. Hút 500µl lớp dịch trong bên trên và 500 µl 1X Sample Extration vào các ống eppendorf đã danhd dấu số thứ tự mẫu . Phân tích: Mẫu sau khi được pha loãng sẽ cho lên giếng phân tích, tất cả hóa chất và giếng có trong Kit phải được để ở nhiệt độ phòng khoảng 2 giờ trước khi sử dụng. Ghi nhãn các hóa chất, thứ tự các chuẩn, mẫu tránh nhầm lẫn. Lấy đủ các giếng cần thiết để lên giếng. Cho 50µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) Enrofloxacin có các nồng độ … vào các giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng bắt đầu từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích cho vào giếng tiếp theo. Hút 100µl dung dịch Conjugate cho vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây. Ủ 30 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (20-250C). Rửa sạch các giếng 3 lần với 250µl dung dịch đệm rửa đã pha loãng ( Wash Buffer). Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm và đập nhẹ, thực hiện bước tiếp theo ngay lập tức, tránh để các giếng khô giữa các bước thực hiện. Thêm 100µl dung dịch One Shot Substrate vào tất cả các giếng, lắt nhẹ trong vài giây. Ủ 20 phút trong bóng tối, ở nhiệt độ phòng. Thêm 100µl Stop solution vào lắt nhẹ vài giây. Đọc kết quả. 2.4.2 Kiểm Doxycyline bằng phương pháp ELISA Hóa chất và cách pha chế - Oxytetracyline Microtiter plate: (12 x 8 well) 96 giếng 6 chai Oxytetracyline Standards (6 x 1.2ml): sẵn để dùng 1 chai Oxytetracyline Antibody (1 x 6ml): sẵn để dùng - 1 chai 5X Oxytet Extraction Buffer (2 x 25ml): đậm đặc 5 lần 12 * Pha 1 thể tích 5X Oxytet Extraction Buffer : 4 thể tích nước cất - 1 chai 10X Tet Sample Diluent (1 x 28ml): đậm đặc 10 lần * Pha 1 thể tích 10X Tet Sample Diluent : 9 thể tích nước cất - 1 chai 20X Wash Solution (1 x 28ml): pha khoảng 20 lần * Pha 1 thể tích 100 20X Wash Solution : 19 thể tích nước cất . - 1 chai Stop Buffer (1 x 20ml): sẵn để dùng 1 chai TMB Substrate (1 x 12ml): sẵn để dùng Cách tiến hành: Cân 1g mẫu cho vào 3ml 1X Oxy tet Extration Vortex 10 phút , ly tâm 10 phút 5000 vòng Hút 60µl mẫu và 820µl 1X Sample Diluent, 20 µl Balance vào các ống eppendorf đã đánh dấu số thứ tự mẫu, vortex trong 1 phút Hút 75 µl chất chuẩn cho vào 5 giếng, 75µl mẫu vào giếng các giếng còn lại Cho 100 µl Antibody vào các giếng mẫu và chuẩn Ủ 30 phút, Nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa 3 lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 100 µl TMB Substrate Ủ trong tối 20 phút Cho 100 µl Stop Buffer Đọc kết quả Thuyết minh qui trình: Cân 1g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 3ml 1X OXYTET Extraction Buffer bằng máy vortex trong 3 phút. 13 Ly tâm 5000 vòng/phút, ly tâm 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút 60µl dịch trong bên trên cho vào eppendorf cho vào 820µl 1X Sample Diluen và 20 µl Balance trộn đều bằng máy vortex trong 1 phút. Phân tích: Mẫu sau khi được pha loãng sẽ cho lên giếng phân tích. Lấy đủ các giếng cần lên giếng. Cho 75µl dung dịch chuẩn ( 1, 2, 3, 4, 6) Doxycycline có các nồng độ … vào các giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng bắt đầu từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Cho 75µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng tiếp theo. Thêm 100µl Antibody vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây. Ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C). Rửa sạch các giếng 3 lần với 250µl dung dịch đệm rửa đã pha loãng ( Wash Buffer). Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm và đập nhẹ, thực hiện bước tiếp theo ngay lập tức, tránh để các giếng khô giữa các bước thực hiện. Trình tự rửa: Đổ dung dịch rửa ra khỏi giếng, cho 250µl dung dịch rửa vào mỗi giếng rồi đổ ra ngoài, lập lại 3 lần, giũ sạch các giọt dung dịch còn sót lại trong giếng bằng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm . Thêm 100µl chất tạo màu TMB Substrate vào lắt nhẹ vài giây. Ủ trong bóng tối 20 phút ở nhiệt độ phòng. Cho 100µl Stop Buffer vào các giếng, lắt nhẹ vài giây. Đọc kết quả 2.4.3.Kiểm Chloramphenicol bằng phương pháp Elisa Hóa chất và cách pha chế - Microtiter plate (12 x 8 well) 96 giếng - Chloramphenicol chuẩn (6 x 1.8ml): gồm 6 lọ, mỗi lọ chứa 1.8ml dung dịch CAP chuẩn, được đánh dấu theo số thứ tự từ 1 đến 6: 0 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.15 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1.5 ng/ml, 4.5 ng/ml, sẵn để dùng - 20X Wash Solution (28ml): đệm pha loãng/ rửa ở dạng cô đặc, phải pha loãng với nước cất * 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất 14 - CAP-HRP Conjugate (8ml): sẵn để dùng -10X Sample Extraction Buffer (25ml): ở dạng cô đặc, phải được pha trước khi dùng với nước cất * 1ml 10X Sample Extraction Buffer : 9 nước cất - TMB Substrate (12ml): sẵn để dùng - Stop Buffer (14ml): sẵn để dùng Tiến hành: Cân 3g mẫu cho vào 6ml ethyl axetat Vortex 10 phút , ly tâm 15 phút 2000 vòng Hút 4000µl lớp dịch trong bên trên cho vào ống ly tâm 15ml, thổi khí 600C trong 15 phút Hút 2000µl n- hexan và 500 µl Tissue ( tỉ lệ 1:400) vào ống vừa thổi khí Vortex trong 1 phút, ly tâm 15 phút 2000 vòng Hút 100 µl lớp dịch trong vào eppendorf (bỏ giọt đầu và giọt cuối) Thêm 25 µl chất chuẩn cho vào 5 giếng, 25µl mẫu vào giếng còn lại Cho 100 µl Conjugate vào tất cả các giếng chuẩn và mẫu Ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa 6 lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 125 µl One shot substrate, ủ 20 ± 2 phút Cho 100 µl Stop solution Đọc kết quả Thuyết minh qui trình: 15 Cân 3g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 6ml ethyl axetat bằng máy vortex trong 3 phút. Ly tâm 10 phút 6000 vòng ở nhiệt độ phòng. Hút 4000µl lớp dịch trong bên trên cho vào ống ly tâm 15ml đem thổi khí đến khi khô ở 600C trong 15 phút. Hút 2000µl n- hexan và 500 µl Tissue vào ống vừa thổi khô và vortex 1 phút. Ly tâm 15 phút 2000 vòng. Hút 100µl dịch trong cho vao eppendorf Phân tích: Mẫu sau khi được pha loãng sẽ cho lên giếng phân tích. Lấy đủ các giếng cần lên giếng. Hút 25µl dung dịch chuẩn (1, 2, 3, 4, 6) Chloramphenicol có các nồng độ … vào các giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng bắt đầu từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Hút 25µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng tiếp theo. Sau đó cho 100µl Conjugate vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây. Ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C). Rửa sạch các giếng 6 lần với 250µl dung dịch vào mỗi giếng rồi đổ ra ngoài, giũ sạch các giọt dung dịch còn sót lại trong giếng bằng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm. Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm và đập nhẹ, tránh để các giếng khô giữa các bước thực hiện. Thêm 125µl One shot substrate vào tất cả các giếng, lắt nhẹ trong vài giây. Ủ trong bóng tối 20 ± 2 phút ở nhiệt độ phòng. Cho 100µl Stop Buffer vào các giếng, lắt nhẹ vài giây. Đọc kết quả. 2.4.4. Kiểm Sulfonamide bằng phương pháp Elisa Hóa chất và cách pha chế - Microtiter plate (12 x 8 well) 96 giếng - Sulfonamide Antibody #1 (1 x 12ml): sẵn để dùng - 100X HRP Conjugate Antibody #2 (1 x 0.25ml) 16 - Sulfonamide Antibody #2 (1 x 20ml) * 99 Sulfonamide Antibody #2 : 1 100X HRP Conjugate Antibody #2 - 10X Sulfonamide Extraction Buffer (1 x 25ml): ở dạng cô đặc trước khi dùng phải được pha với nước cất * 1ml 10X Sulfonamide Extraction Buffer : 9 nước cất - TMB Substrate (1 x 12ml): sẵn để dùng - Stop Buffer (1 x 14ml): sẵn để dùng - 20X Wash Solution (1 x 28ml): đệm pha loãng/ rửa ở dạng cô đặc phải pha loãng với nước cất * 1ml 20X Wash Solution : 19 nước cất Tiến hành Cân 2g mẫu cho vào 5ml ethyl axetat Vortex 5 phút, ly tâm 5 phút 5000 vòng Hút 3000µl lớp dịch trong bên trên cho vào ống ly tâm 15ml, thổi khí 600C trong 15 phút Hút 600µl n- hexan và 600 µl 1X sample (tỉ lệ 1:9) Vortex 1 phút , ly tâm 5 phút 5000 vòng Hút 100 µl lớp dịch trong bên dưới cho vào eppendorf Cho 50 µl chất chuẩn cho vào 5 giếng, 50µl mẫu vào giếng còn lại Cho 100 µl Antibody # 1 vào các giếng mẫu và chuẩn Ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa 3 lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 125 µl Antibody # 2, ủ 30 phút, nhiệt độ phòng Rửa 3 lần, 250 µl 1X Wash Solution Cho 100 µl TMB substrate, ủ 30 phút, nhiệt độ phòng 17 Cho 100 µl Stop solution Đọc kết quả Thuyết minh qui trình: Cân 2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 15ml, trộn 5ml ethyl axetat bằng máy vortex trong 3 phút. Ly tâm 10 phút 6000 vòng ở nhiệt độ phòng. Hút 3000µl lớp dịch trong bên trên cho vào ống ly tâm 15ml đem thổi khí đến khi khô ở 600C trong 15 phút. Hút 600µl n- hexan và 600 µl 1X sample vào ống vừa thổi khô và vortex 1 phút. Ly tâm 5 phút 5000 vòng. Hút 100 µl lớp dịch trong bên dưới cho vào eppendorf Phân tích: Mẫu sau khi được pha loãng sẽ cho lên giếng phân tích. Lấy đủ các giếng cần lên giếng. Hút 50µl dung dịch chuẩn Sulfonamide có các nồng độ … vào các giếng tương ứng, nên cho chuẩn vào giếng bắt đầu từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Hút 50µl dung dịch mẫu phân tích vào giếng tiếp theo. Sau đó cho 100µl Atibody # 1 vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây. Ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C). Rửa sạch các giếng 3 lần với 250µl dung dịch vào mỗi giếng rồi đổ ra ngoài, giũ sạch các giọt dung dịch còn sót lại trong giếng bằng cách úp ngược đĩa microplate lên giấy thấm. Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm và đập nhẹ, tránh để các giếng khô giữa các bước thực hiện. Sau đó cho 150µl Atibody # 2 vào tất cả các giếng, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa giếng trong vài giây. Ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20-250C). Rửa sạch các giếng 3 lần với 250µl dung dịch vào mỗi giếng rồi đổ ra ngoài, giũ sạch các giọt dung dịch còn sót lại trong giếng bằng cách úp ngược đĩa microplate lên 18 giấy thấm. Sau lần rửa cuối cùng làm khô bằng cách lật ngược đĩa giếng lên giấy thấm và đập nhẹ, tránh để các giếng khô giữa các bước thực hiện. Thêm 100µl TMB substrate vào tất cả các giếng, lắt nhẹ trong vài giây. Ủ trong bóng tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. Cho 100µl Stop Buffer vào các giếng, lắt nhẹ vài giây. Đọc kết quả. 2.4.5 Kiểm Nitrofuran AOZ bằng phương pháp ELISA Hóa chất và cách pha chế - Microtiter plate (12 x 8 well) 96 giếng - Dung dịch K2HPO4 1M: Hòa tan 11.4g K2HPO4.3H2O trong 500ml nước. - Dung dịch HCl 1M: Pha loãng 8.6ml HCl đậm đặc : 91.4ml nước cất. - Dung dịch NaOH 1M: Hòa tan 4g NaOH trong 100ml nước cất. - Reconstitution Buffer: Pha loãng 2X Reconstitution Buffer với nước cất theo tỷ lệ 1:1. Bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tháng. - Wash buffer: Pha loãng 20X Concentrated Wash Buffer với nước cất, theo tỷ lệ 1:19 Tiến hành Cân 1g mẫu cho vào 4ml nước cất, 500 µl HCL, 75 µl 4- Nitrobenzendehyde 19 Cân 1g mẫu cho vào 4ml nước cất, 500 µl HCL, 75 µl 4- Nitrobenzendehyde Vortex 1 phút, ủ 500C trong 2 giờ 500 µl K2HPO4 , 400 µl NaOH, 6ml ethyl axetat Vortex 1 phút, ly tâm 10 phút 6000 vòng Hút 3ml dịch trong bên trên, thổi khí 600C trong 10 phút 1ml n- hexan, 1ml đệm pha loãng (WA), vortex 1 phút Ly tâm 10 phút 6000 vòng Hút 100 µl lớp dịch trong bên dưới cho vào eppendorf Hút 50µl chuẩn cho vào 5giếng, 50 µl mẫu cho vào các giếng Cho 75µl Conjugate cho vào các giếng Ủ trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 – 250C) Rửa 6 lần bằng đệm pha loãng (WA) Cho 125 µl One shot substrate, ủ 20 ± 2 phút Cho 100 µl stop solution Đọc kết quả 20