Tài liệu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) của thuốc natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Trung tâm Học Edwardsiella liệu ĐH Cầnictaluri Thơ @ liệu họchydrophila tập và nghiên cứu VÀTài Aeromonas LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................... 1 DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... 3 DANH SÁCH BẢNG..................................................................................... 4 LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ 5 TÓM TẮT...................................................................................................... 6 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU........................................................................... 7 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 9 Trung tâm 2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ..................................................................9 2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri.......................................................9 2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri ....................................................................9 2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila .......................................................10 2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila...................................10 2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc....................................................................................10 2.2.3 Hình dạng tế bào .........................................................................................10 2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila.............................................................11 2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila .................................................11 2.3 Cây thảo dược ................................................................................................12 2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược.............................................................................12 2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và công dụng phòng trị bệnh thủy sản.............12 2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản 13 2.4 Natsol.............................................................................................................14 2.5 Chloramphenicol ............................................................................................14 2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc kháng sinh Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu thảo dược .............................................................................................................14 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................................16 3.1.1 Thời gian nghiên cứu...................................................................................16 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................16 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................16 3.2.1 Hoá chất và môi ttrường ..............................................................................16 3.2.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................16 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .....................................................................................16 3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm ....................................................................................17 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17 3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu.................................................................17 3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn.....................................................................................17 3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh ......................................................18 3.3.2 Thực hiện nghiên cứu ..................................................................................20 3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò .................................................................................20 3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ ................................................................21 3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch (Lila Ruangpan, 2004): ........................................................................................22 3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002):..............................................................................23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN......................................................25 4.1 Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra ..........................................................25 4.2 Xác định nồng độ MIC ...................................................................................26 1 4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila............................................................................................................27 4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp pha loãng.........................................28 4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A. hydrophila............................................................................................................28 4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri .................................................................................................................30 4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp thạch. ..............................................32 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................35 5.1 Kết luận .........................................................................................................35 5.2 Đề xuất...........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................36 Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn.......................................41 Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn .......................................42 Phụ lục C: Pha môi trường ..........................................................................43 Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý và pha môi trường NB .........................44 Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol và natsol ....................45 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm – hình que) ........................................... ............................................................10 Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram âm – hình que)................................... ............................................................11 Hình 4.3: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)).............34 Hình 4.4: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)).............34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần ...................... ............................................................18 Bảng 3.2: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần ............................................................19 Bảng 3.3: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) .. ............................................ ............................................................19 Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) .. ............................................ ............................................................20 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc Natsol trên vi khuẩn E. ictaluri......... ............................................................26 Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc chloramphenicol trên E. coli ...27 Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy của thuốc natsol bằng đĩa kháng sinh tự chế .............................. ............................................................28 Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh natsol trên vi khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF2 .. ............................................................29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF133 ............. ............................................................29 Bảng 4.6: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 6 và 7 ở độ pha loãng 105 trên vi khuẩn A. hydrophila .......................... ............................................................30 Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở chủng vi khuẩn E.3B3 ....................... ............................................................31 Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở chủng vi khuẩn E.223........................ ............................................................31 Bảng 4.9: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 8 và 9 ở độ pha loãng 104 trên vi khuẩn E. ictaluri................................ ............................................................32 Bảng 4.10: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila với các đĩa môi trường 5, 6, 7 ứng với các nồng độ 1500; 750; 375ppm ...............32 Bảng 4.11: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn E. ictaluri với các đĩa môi trường 6, 7, 8 ứng với các nồng độ 750; 375; 187,5ppm ....................33 4 LỜI CẢM TẠ Tôi đặc biệt biết ơn cô Từ Thanh Dung và Nguyễn Thị Như Ngọc đã ân cần hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt đẹp. Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập – cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã nhiệt tình dạy dỗ và dẫn dắt lớp và tôi thời gian qua. Tôi xin cảm ơn tất cả thầy cô của Khoa thuỷ sản nói chung và thầy cô của Bộ môn Sinh học và bệnh thuỷ sản nói chung đã truyền dạy cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt 4 năm học vừa qua và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này. Cảm ơn bạn bè trong lớp cũng như bạn bè khác lớp đã tận tình trao đổi với tôi những kiến thức khiếm khuyết và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã nuôi dạy tôi và tạo điều kiện cho tôi ăn học. Tôi có được thành quả như ngày hôm nay thì không thể kể hết công ơn trời biển của cha mẹ đã dành cho tôi. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 5 TÓM TẮT Thí nghiệm thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và xác định được khoảng nồng độ ức chế của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 50-100ppm. Thực hiện nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật natsol bằng ba phương pháp:  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp lập kháng sinh đồ, nhưng qua thí nghiệm trên thuốc natsol không cho kết luận gì.  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng, xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 93,75ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 375ppm.  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp thạch, xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 187,5ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 750ppm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 6 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Trung Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Từ những năm 1998-2000 thành công trong nghiên cứu “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá tra thương phẩm” của Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ, đẩy mạnh phong trào nuôi cá tra thương phẩm phát triển ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng. Theo Dương Nhật Long (2006) thì sản lượng cá tra năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 đạt 220.000 tấn, năm 2004 đạt trên 300.000 tấn, năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn. Song bên cạnh mặt thuận lợi còn tồn tại những vấn đề khó khăn, đó là tình hình bệnh trên cá tra nuôi. Trong nhiều năm qua người nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do dịch bệnh xảy ra, như bệnh đốm đỏ, trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh do ký sinh trùng ngoại ký sinh…(Ferguson & ctv, 2001). Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) bệnh trắng gan (còn gọi là bệnh mủ gan) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây ra là bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra, gây thiệt hại nghiêm trọng trong nuôi cá thâm liệu canh. Mặt bệnh đốm@ đỏ (còn là bệnh huyết) vi khuẩncứu tâmtraHọc ĐHkhác, Cần Thơ Tàigọi liệu họcxuất tập và do nghiên Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) gây ra trên nhiều loài cá nước ngọt trong đó có cá tra nuôi (Từ Thanh Dung, 2005). Từ Thanh Dung (1996) cho rằng bệnh vi khuẩn là một vấn đề quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản, việc điều trị chủ yếu bằng hoá chất hoặc sử dụng thuốc kháng sinh penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracylin, tetracylin.... Tuy nhiên sử dụng hoá chất phòng và trị bệnh vi khuẩn trong thời gian dài, đặc biệt là kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, như giá thành các loại thuốc kháng sinh cao, lại gây ra hiện tượng kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh, làm giảm hiệu quả phòng và trị bệnh về sau. Thêm vào đó là vấn đề ô nhiễm môi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản… ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ người tiêu dùng. Theo Direkbusarakom (1995), một giải pháp phòng trị khác là sử dụng cây thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn trong thuỷ sản, tuy hiệu quả không nhanh chóng nhưng khắc phục được những khó khăn đã gặp khi sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh. Vì vậy, ở Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ… kể cả Việt Nam, một vài cây thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dùng làm dược phẩm cho người và gia súc, cũng được thử nghiệm làm thuốc trị bệnh trong ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994). Chất chiết cây đậu (Clinacanthus nutans) ức chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) 7 (Direkbusarakom & ctv, 1995). Theo Kamei (1988) cho rằng chiết suất thảo dược từ cây ổi (Psidium guajava) phòng trị được bệnh vi rút như IHNV, IPNV, OMV trên cá. Từ Thanh Dung (1996) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của cây thảo dược lên vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai (Clarias macrocephalus x C.gariepinus). Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra bằng thảo dược. Vì vậy, để làm phong phú thêm cho phương pháp điều trị cũng như làm đa dạng danh mục thuốc phòng trị bệnh cho cá là lý do chính để đề tài “Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Nội dung nghiên cứu Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng và môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 8 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra 2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri Theo Hawke & ctv (1981) E. ictaluri là loài thuộc Enterobacteriaceace, gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,75x1,5-2,5µm, di động yếu ở 25-30 0C, không di động khi nhiệt độ cao hơn. Catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính và lên men glucose. Không sinh H2S và indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA (trypton soya agar) chậm 36-48 giờ tại 18-280C. Giống vi khuẩn Edwardsiella còn phát triển tốt trên môi trường BHI (brain heart infusion) và môi trường TSA, vi khuẩn có dạng khuẩn lạc nhỏ màu xanh có nhân đen trên môi trường EIA (E. ictaluri agar) (Từ Thanh Dung, 2005). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm – hình que) 2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri E. ictaluri có thể truyền bệnh qua môi trường nước, đất và các động vật khác. Vi khuẩn E. ictaluri là mầm bệnh nguyên thuỷ trong ngành nuôi cá nheo Mỹ. Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri được chuẩn đoán ở vùng nuôi cá da trơn tại Mississippi, Arkanas, Alabana, Louisiana, Georgia và Florida. Theo Hawke & ctv (1998), bệnh cũng thường xuyên xảy ra ở Virginia, Texas, Idaho, Kentucky, California, Arizona và Maryland. Ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó, bệnh lây lan sang các 9 vùng lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh ven biển mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng (Từ Thanh Dung & ctv, 2004). Bệnh mủ gan chủ yếu xuất hiện trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển), thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại lớn nhất về kinh tế ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung & ctv, 2004). 2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila A. hydrophila là vi khuẩn gram âm hình que, được tìm thấy trong môi trường nước, gây bệnh trên động vật có xương sống máu lạnh và động vật hữu nhũ, tồn tại tự do trong nước (Ho & ctv, 1990). A. hydrophila là mầm bệnh chủ yếu của động vật thủy sản vùng nước ngọt, động vật trên cạn và kể cả con người (Bùi Quang Tề, 2006). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram âm – hình que) 2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc A. hydrophila có thể sống đơn độc trong hầu hết các môi trường. Khuẩn lạc của vi khuẩn A. hydrophila là những cụm màu vàng, hình tròn, như mặt trăng, nổi (Từ Thanh Dung, 2005). 2.2.3 Hình dạng tế bào A. hydrophila có những đặc trưng sau: gram âm, que thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4-4,0µm, có roi ở cực cơ thể, kỵ khí, lên men cacbonat hình thành acid hoặc khí gas, sản phẩm của 2,3-butandiol, oxydase dương tính, khử nitrat. (Shotts & Rimler, 1973). 10 2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila Thông thường, bệnh rất dễ phát sinh do kết quả tương tác giữa vật chủ, mầm bệnh và môi trường. Mặc dù khi điều kiện môi trường không thích hợp là nguyên nhân chính của tác nhân gây bệnh nhiễm trùng, thì tác nhân ngẫu nhiên và tác nhân cơ hội chỉ có thể là nguyên nhân mầm bệnh khi cả hai yếu tố tình trạng sinh lý của vật chủ và điều kiện môi trường của hệ thống nuôi không thích hợp (Subasingha, 1995). Bệnh xuất huyết do A. hydrophila có thể lây truyền qua nước, từ cá bệnh sang cá khỏe, cá tạp làm thức ăn nhân tạo, và kết hợp động thực vật ký sinh bên ngoài và bên trong cơ thể (Newman, 1993). Các yếu tố gây sốc như mật độ nuôi cao, thức ăn thừa, áp suất nước cao, nồng độ oxy hòa tan thấp, nghèo dinh dưỡng là nguyên nhân cá dễ mắc bệnh (Shotts & ctv, 1972). Vi khuẩn A. hydrophila tồn tại trong môi trường nuôi, đặc biệt ở trong nước có hàm lượng hữu cơ cao (Snieszko & Axelrod, 1971). Vi khuẩn có thể tồn tại bên ngoài cơ thể cá khỏe (Trust & Sparrow, 1974). Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ độc của vi khuẩn. Giống A. hydrophila sống đơn độc trong nước lây truyền với hàm lượng vi khuẩn thấp trong cá bệnh và mồi câu tôm nước ngọt. Một vài chủng vi khuẩn của A. hydrophila có độc tố ngoại lệ đối với cá, không có độc khi vi khuẩn yếu đi. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu A. hydrophila có thể xâm nhập qua những tổn thương do ký chủ trung gian. Nhiều trường hợp bệnh bộc phát có liên quan đến yếu tố gây sốc, chẳng hạn hàm lượng oxy hoà tan thấp kết hợp với khí ammonia và khí cacbonic cao, làm tăng áp suất nước và nồng độ nitrat. Cá càng trở nên nhạy cảm với A. hydrophila (Pai & ctv, 1995). 2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila Triệu chứng của bệnh này giống triệu chứng của các bệnh xuất huyết do vi khuẩn khác, chỉ khác ở bốn điểm phổ biến: nhạy với độ độc thấp, hình dạng phù và hình dạng vết loét. Biểu hiện bệnh xuất huyết ở cá chép (Cyprinus carpio) là những đốm đỏ trên thân, ở cá trê lai thì bị phù (Rogers & Burke, 1981). A. hydrophila gây bệnh trên nhiều loài cá: cá lóc (Ophicephalus striatus) (Bloch), cá trê (Clarias batrachus), cá diếc (Glossogobius giurus) (Hamilton), cá hồi đốm đen (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum) (Lio-Po & ctv, 1992). Bệnh phù xảy ra ở cá trê lai cỡ nhỏ. Tonguthai & ctv (1993) tìm thấy nguyên nhân của bệnh này là A. hydrophila, Vibrio sp, và Pseudomonas sp với các triệu 11 chứng lâm sàng: xuất huyết, phù, sưng tấy ở vây ngực, tác nhân quan trọng nhất là vi khuẩn A. hydrophila, gây thiệt hại nhiều cho người nuôi thủy sản. 2.3 Cây thảo dược 2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược Thảo dược là những cây có hương thơm ở chồi, lá, hoa, hạt và rễ được dùng làm hương liệu, gia vị hoặc làm thuốc theo từng mục đích (Eisenbrand & ctv, 1992). Cây thảo dược là một cây mềm, mộng nước, hầu hết phát triển từ hạt, không phát triển từ thân gỗ, xơ cứng dai. Một vài thảo dược như hương liệu làm nước giải khát có thể tìm thấy trong tự nhiên nhưng hầu hết thảo dược được trồng và rất sạch. Chúng được sấy khô và dự trữ làm hương liệu cho năm. Thảo dược làm thuốc chữa bệnh cả cây hoang dã lẫn cây được trồng đều tốt và được sấy khô hoặc chế biến kỹ. Từ xưa đến nay, trong thủy sản đã sử dụng thuốc từ thực vật (Sivarajan & ctv, 1994). Cách đây hàng ngàn năm khai hóa, từ Ai Cập, Trung Quốc, Ấn Độ, Ả Rập, Ba Tư, các tài liệu đã ghi chép các bằng chứng về sự hiểu biết tinh vi và lý luận truyền thống với việc trồng những cây thảo dược và cây gia vị. Trung Đặc biệt là trong chế biến làm thức ăn, vì chúng giàu dinh dưỡng và có tính sát cho ĐH sức khỏe. trăm thảo dược và gia đượcnghiên dùng làmcứu tâmkhuẩn Họctốtliệu CầnHàng Thơ @cây Tài liệu học tậpvị và thuốc và mỹ phẩm, dùng trong giặt rửa và tắm gội, hun khói trong nhà và theo mục đích tín ngưỡng (Eisenbrand & ctv, 1992). Theo Đỗ Tất Lợi (1991) có trên 600 loài cây thuốc ở Việt Nam, Hà (1993) báo cáo kết quả ban đầu trên cây thuốc là phòng và điều trị được bệnh trên cá và tôm ở Việt Nam. Hầu hết chiết suất thảo dược cho kết quả chống lại vi khuẩn ở một vài bệnh cá và tôm nhưng phương thức chiết suất, cô đặc cho điều trị chưa hoàn thiện. 2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và công dụng phòng trị bệnh thủy sản + Cây đinh hương (Eugenia caryophyllus) Cây đinh hương được sử dụng làm hương liệu kích thích như là vị cay của ớt, làm gia vị nêm và làm dầu xông hơi. Cây đinh hương dùng làm thuốc chữa bệnh. Dầu đinh hương dùng trong công nghiệp hương thơm và làm xà phồng, cũng như làm thuốc giảm đau, đặc trị đau răng (Trease & Evans, 1973). + Cây xuyên tâm liên (Andrographus panicullata) Cây xuyên tâm liên có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thủng, ức chế vi khuẩn, tăng cường hiện tượng thực bào của tế bào bạch cầu, dùng trị bệnh viêm ruột cho cá trắm cỏ (Bùi Quang Tề, 2006) 12 + Cây nhọ nồi (Eclipta alba) Cỏ nhọ nồi có tác dụng cầm máu, không gây tăng huyết áp, không làm giản mạch ở người, điều trị viêm gan (Dixit & Achar, 1979). Eclipta alba có tác dụng trong điều trị tổn thương gan và vết bổng (Từ Thanh Dung, 1996). Kết quả thử tác dụng của cao tách chiết thảo dược cao nhọ nồi có tác dụng với 3 vi khuẩn V. harveyi, V. alginolyticus và A. hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006). + Cây chó đẻ (Phyllathus debilis) Cây chó đẻ có tác dụng kháng sinh, chữa đinh râu, đau mắt, mụn nhọt… ở người. Đã thử nghiệm tác dụng kháng sinh với vi khuẩn A. hydrophila, E. tarda gây bệnh hoại tử ở cá trê, vòng kháng khuẩn 11-20mm (Bùi Quang Tề, 2006). + Cây tỏi (Allium sativum) Kết quả thử cao tách chiết thảo dược từ tỏi có tác dụng với 6 loài vi khuẩn: Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi, V. alginolyticus, A. hydrophila, E. tarda, Hafnia alvei) gây bệnh cá nước ngọt, lợ mặn. Tỏi tách chiết thành cao dầu phối chế thành thuốc chữa bệnh tôm cá, có tác dụng phòng trị bệnh xuất huyết, hoại tử nội tạng (bệnh đốm trắng) do vi khuẩn cho cá tra nuôi. Kết quả chế phẩm phối chế từ hoạt chất tách chiết của tỏi và sài đất có tác dụng phòng trị bệnh ăn mòn vỏ kitin do vi khuẩn Vibrio spp cho tôm nuôi (Bùi Quang Tề, 2006). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản Từ Thanh Dung (1996) đã kiểm tra tính nhạy của 8 loài chiết suất thảo dược trên 6 chủng vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá trê lai (Clarias batrachus x C.gariepinus). Kết quả chỉ có 2 loại thảo dược nhạy: Phyllanthus debitis (PD) và Eugenia caryophyllus (EC). Đồng thời đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao bột PD là 10.000µg/l, của chiết dầu EC là 1.000µl/l. Căn cứ vào kết quả MIC và nồng độ gây chết LC50, thử nghiệm được tiến hành trên bể nuôi để đánh giá khả năng ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng huyết do Aeromonas trên cá trê bằng cách ngâm vào thức ăn hoặc phương pháp tắm. Đối với EC, dễ dàng ngâm thuốc vào thức ăn với hàm lượng dưới 10ml/kg thức ăn, vì vậy hàm lượng EC cô đặc trong thức ăn là 1ml/kg thức ăn (khoảng giá trị nồng độ nhỏ nhất MIC). Còn PD, khoảng giá trị MIC trong thức ăn là 10g/kg thức ăn và khoảng MIC trong phương pháp tắm giảm 10 lần chỉ dùng 1.000µg/ml. Theo Goujun Yin và ctv (2005) đã kiểm tra ảnh hưởng của 2 loại thảo dược Astragalus radix và Scutellaria radix lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu ở cá rô phi (Oreochromis niloticus). Cả Astragalus radix và Scutellaria radix đều có khả năng điều chỉnh hệ thống miễn dịch bẩm sinh của cá rô phi. Thức ăn 13 chứa 0,1% và 0,5% Astragalus radix trong 1 tuần đều làm tăng hoạt động của lisozyme và kích thích thực bào sau 3 tuần, tuy nhiên hoạt động hô hấp của tế bào thực bào không tăng. Khi cho cá rô phi ăn Scutellaria radix với liều lượng cao thì hoạt động hô hấp và thực bào bị ức chế, lisozym không hoạt động. Kết quả thí nghiệm sai khác không đáng kể giữa 2 loại thức ăn với những nồng độ khác nhau của cả 2 loại cây thảo dược. Liều tốt nhất của Astragalus radix là 0,1% và 0,5% trong 3 tuần. Việc cần làm là xác định liều kích thích và thời gian cho ăn tốt nhất của Scutellaria radix. 2.4 Natsol Natsol là chất chiết suất từ cây tự nhiên, là sản phẩm của công ty BIOFLAVONOIDS. Natsol là dung dịch dạng tinh dầu, trong, hơi vàng như mật ong. Natsol có tác dụng ngăn chặn các bệnh khác nhau của vi khuẩn và nấm. Natsol được mở rộng sử dụng ở Ấn Độ 3 năm trước và thành công trong bước đầu điều trị bệnh thối chủy, thối mang, cụt phụ bộ. Ngoài ra Natsol còn dùng điều trị bệnh vi rút trên tôm cá. Thành phần gồm flavonon sinh học và không có chứa kim loại, hóa chất hay độc tố. 2.5 Chloramphenicol Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học hay do con người tổng hợp nên. Có tác động một cách riêng biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn, nấm và vi rút (Lê Thị Kim Liên, 2007). Ngoài ra, theo Bùi Thị Tho (2003) cho rằng kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn ngừa vi khuẩn nhân lên bằng tác động ở mức độ phân tử hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa. Chloramphenicol là thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao, nhanh, và mạnh, đặc biệt phổ kháng khuẩn đã được mở rộng với cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Edwardsiella (gram âm) và Aeromonas (gram âm), Pseudomonas (gram âm), Streptococcus (gram dương)) (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2006). 2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc kháng sinh thảo dược Mullika & ctv (2005) tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 19 loại thảo dược (andrographic paniculata, azadirachta indica, barleria lupulina, carthamus tinctorius, centella asiatica, clinacanthus nutans, 14 cymbopogon citrates, eupatorium odoratum, garcinia mangostana, hibiscus sabdariffa, houttuynia cordata, lawsonia inermis, lycopersicon esculentum, murdennia lorifomis, psidium guajava, senna alata, senna occidentalis, senna siamea, tagetes erecta) lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch. Kết quả cho thấy 13 loại thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên môi trường thạch. Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất, với giá trị MIC nhỏ nhất (39ppm). Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược này trên cả hai loài vi khuẩn thì bằng nhau. Kumar & ctv (2007) cũng tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus, eclipta alba, coscinium fenestratum, curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha piperita, pongamia pinnata, symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale. Qua phương pháp thạch có 7 loại thuốc cho kết quả ức chế sự phát triển của hai loài vi khuẩn này trên môi trường thạch. Và qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất. Giá trị MIC trên hai loài vi khuẩn là 49ppm. & ctvĐH (2005) kiểm tra tác ethylhọc acetate n-butanol chiếtcứu Trung tâmSupayang Học liệu Cần Thơ @dụng Tàicủaliệu tậpvàvà nghiên suất từ vỏ quả Punica granatum lên E. coli O157:H7, E. coli O26:H11, E. coli O111:NM và E. coli O22 bằng phương pháp thạch. Xác định được giá trị MIC của cả hai chiết suất này lên E. coli O157:H7 là nhỏ nhất (50ppm). Giá trị MIC của ethyl acetate chiết suất từ Centaurea lên vi khuẩn Staphylococcus aureus là 62,5ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125ppm), nghĩa là ethyl acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn Staphylococcus aureus (Kiymet & ctv, 2005). Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli, salmonella infantis. Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng giá trị MIC của các chiết suất này từ 165-2640mg/ml. B. cereus nhạy với hầu hết các chiết suất từ cinnamomum cassia, azadirachta indica, ruta graveolén, rumex nervosus với khoảng MIC từ 165-660mg/ml. Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ có hiệu quả trên vi khuẩn E.coli, S. infantis ở giá trị MIC cao nhất (2640mg/ml) (Mohan & ctv, 2004). 15 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu: Bắt đầu từ tháng 04/2008 đến tháng 05/2008 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học và bệnh thuỷ sản, khoa Thuỷ sản, trường đại học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Hoá chất và môi ttrường  Trung Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nutrient agar (NA, Merck), nutrient broth (NB, Merck), muller hinton agar (MHA, Merck).  Các loại hoá chất nhuộm Gram: dd I (ammonium oxalate, crystal violet), dd II (iodine), dd III (cồn tuyệt đối, ethanol (Merck)), dd IV (safranin).  NaCl.  Dầu xem kính hiển vi.  Glycerol. tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Nước cất. 3.2.2 Thuốc kháng sinh   Thảo dược: natsol. Chloramphenicol. 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm         Que cấy, pel, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy vệ sinh, bút lông, kính hiển vi, lame, đèn cồn, hột quẹt. Cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, que trãi thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, ống nghiệm. Pipet 1-5ml, 100-1000µl, 10-100µl, 5-40µl. Đầu col 5ml, 1ml, 100µl; ống falcon 50ml thanh trùng. Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy li tâm, máy so màu quang phổ, cuvette 3ml, máy lắc, máy trộn mẫu, máy đếm khuẩn lạc. Giấy lọc làm đĩa kháng sinh. Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy, nồi chưng cất (water-bath). Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày. 16 3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm Vi khuẩn E. coli LMG8223 từ nguồn Đại học Ghent, vương quốc Bỉ. Vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila được phân lập trên cá tra, nguồn cung cấp từ Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. Tất cả vi khuẩn được trữ ở -800C trong môi trường BHI lỏng + glycerol. Hai chủng vi khuẩn E. ictaluri: E.223 và E.3B3 Hai chủng vi khuẩn A. hydrophila: CAF2 và CAF133 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu 3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn Nuôi cấy và phục hồi vi khuẩn Trung Vi khuẩn trữ được phục hồi bằng cách cho vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10ml dung dịch NB lỏng, ủ trong tủ ấm 28-300C hoặc lắc đều trên máy lắc (200 vòng/phút) 18-24 giờ, rồi cấy sang đĩa môi trường kiểm tra tính thuần (dựa vào các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, kết quả nhuộm gram). Hai loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila được cấy phục hồi và tách ròng tâmtrên Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu môi trường thạch NA, ủ ở 280C trong 24 giờ đối với A. hydrophila và 48 giờ đối với E. ictaluri. Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường NB lỏng, ủ trong tủ ấm ở 280C hoặc lắc đều trên máy lắc từ 18-24 giờ (Rahman & Kawai, 2000). Ly tâm vi khuẩn Cho vi khuẩn vào ống falcon 50 ml, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút, ly tâm trong 15 phút, sử dụng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) tiệt trùng để rửa vi khuẩn. Lặp lại thao tác 2 – 3 lần. Sau lần ly tâm cuối cùng cho môi trường NB vào và trộn đều mẫu. Xác định mật độ vi khuẩn Ly tâm xong, cho môi trường NB vào đánh tan phần vi khuẩn lắng, rồi tiến hành so màu bằng máy so màu quang phổ. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590nm, với OD=0,1±0,02 tương đương với mật độ vi khuẩn A. hydrophila là 1x108cfu/ml và OD=0,01±0,002 tương đương vớimật độ vi khuẩn E. ictaluri là 1x107cfu/ml (Lương Trần Thục Đoan, 2006). Sau đó mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường NA để kiểm tra thao tác kỹ thuật chuẩn bị dung dịch vi khuẩn trước khi thực hiện nghiên cứu. 17 3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh Natsol: được cung cấp từ công ty BIOFLAVONOIDS của Ấn Độ. Chuẩn bị dung dịch gốc (stock) Natsol như sau: hòa tan 5ml Natsol trong 100ml nước cất được nồng độ 50000µl/l, sau đó pha loãng theo phương pháp pha loãng hai lần (double dilution method) để được các nồng độ 24000; 12000; 6000; 3000; 1500; 750; 375;187,5; 93,75; 46,875 và 26,4375µl/l (Bảng 3.1). Trong đó, các nồng độ 24000ppm và 1500ppm được pha từ nồng độ 50000ppm. Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần Ống Nồng độ cần pha nghiệm (ppm) Thể tích Thể tích thuốc kháng sinh natsol nước cất (ml) (ml) 1 24000 6 (50000ppm, dung dịch gốc 1) 6 2 12000 6 (24000ppm) 6 3 6000 6 (12000ppm) 6 4 3000 6 (6000ppm) 6 5 liệu ĐH1500 (3000ppm, dunghọc dịch tập gốc 2)và nghiên 6 Trung tâm Học Cần Thơ6@ Tài liệu cứu 6 750 6 (1500ppm) 6 7 375 6 (750ppm) 6 8 187,5 6 (375ppm) 6 9 93,75 6 (187,5ppm) 6 10 46,875 6 (93,75ppm) 6 11 23,4375 6 (46,875ppm) 6 * Chú ý:      Ống nghiệm có nồng độ thuốc 24000 và 1500ppm sẽ được pha loãng từ dung dịch gốc 50000ppm với natsol và ở chloramphenicol thì các nồng độ 512 và 128ppm pha loãng từ dung dịch gốc 1.024ppm (Bảng 3.3). Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các nồng độ tiếp theo. Nồng độ thuốc sẽ giảm đi phân nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ thuốc trước khi bắt đầu thí nghiệm. Phải lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Điều cần chú ý là ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng thuốc giảm đi phân nửa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.2 và Bảng 3.4). 18