Tài liệu ảnh hưởng của fructooligosaccharidse lên một số chỉ tiêu sinh lý của cá tra giống (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN === VÕ VĂN ĐẠO ẢNH HƯỞNG CỦA FRUCTOOLIGOSACCHARIDSE LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN === VÕ VĂN ĐẠO ẢNH HƯỞNG CỦA FRUCTOOLIGOSACCHARIDSE LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ CỦA CÁ TRA GIỐNG (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. TS. ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG 2013 LỜI CẢM TẠ Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGs.Ts. Đỗ Thị Thanh Hương đã quan tâm, động viên và hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian triển khai thí nghiệm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp; đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàng thành đề tài. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Nguyễn Thị Kim Hà về hướng dẫn nhiệt tình trong quá trình học tập và thực hiện đề tài Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp Nuôi trồng Thủy sản liên thông k37 đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực đề tài. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Xin Chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Ảnh hưởng của fructooligosaccharide lên các chỉ tiêu sinh lý trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống có trọng lượng 10-15 g/con được thực hiện tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 5/2013. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục, mật độ: 50 con/bể 500 L. Cá được cho ăn thức ăn có chứa fructooligosaccharide (FOS) với liều lượng 0, 0,5%, 1%, 1.5% và 2% khối lượng thức ăn, cho cá ăn liên tục trong 30 ngày. Các chỉ tiêu huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, hematocrit, hemoglobin) và glucose được thu tại các thời điểm 0 ngày (chưa ăn FOS); 1, 3, 7, 10, 30 và 60 ngày (sau khi cho cá ăn FOS). Kết quả cho thấy fructooligosaccharide làm số lượng hồng cầu hồng cầu tăng ở nghiệm 0,5% và 1% là cao nhất. Số lượng bạch cầu cũng tăng lên ở các nghiệm thức 0,5% và 1%, tỷ lệ huyết sắc tố (hematocrit) trong máu tăng lên cao nhất là nghiệm thức 2%, hemoglobin tăng lên ở nghiệm thức bổ sung 1% FOS. Hàm lượng glucose ở nghệm thức 0,5% và 1% giảm thấp hơn Đối chứng và các nghiệm thức 1,5% và 2%. Vậy bổ sung FOS vào thức ăn cho cá tra ăn ở nồng độ 0,5% và 1% giúp cá giảm stress. ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày 06 tháng 09 năm 2013 Ký tên Võ Văn Đạo iii MỤC LỤC CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................1 1. 1 Giới thiệu .................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài .................................................................................2 1.3 Nội dung của đề tài ................................................................................2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài.......................................................................2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .........................................................3 2.1 Đặc điểm sinh học..................................................................................3 2.1.1 Phân Loại.........................................................................................3 2.1.2 Dinh dưỡng......................................................................................3 2.1.3 Sinh Trưởng.....................................................................................4 2.1.4 Sinh sản ...........................................................................................4 2.2 Đặc điểm của FOS .................................................................................4 2.2.1 Cấu tạo của FOS ..............................................................................4 2.2.2 Công dụng của FOS .........................................................................5 2.2.2.1 FOS thúc đẩy quá trình hấp thu calcium.....................................5 2.2.2.2 FOS trong quá trình chuyển hóa carbohydrat .............................6 2.2.2.3 FOS lên hệ vi sinh đường ruột....................................................6 CHƯƠNG III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................9 3.1 Địa điểm và vật liệu nghiên cứu .............................................................9 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: .......................................................................9 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu: .........................................................................9 3.2 Phương pháp nghiên cứu: ......................................................................9 3.2.1 Thí nghiệm ảnh hưởng của FOS lên một số chỉ tiêu huyết học của cá Tra:...........................................................................................................9 3.2.2 Phương pháp phân tích mẫu ...........................................................10 3.2.2.1 Phương pháp định lượng hồng cầu...........................................10 3.2.2.2. Phương pháp định lượng bạch cầu ..........................................11 3.2.3.3 Phương pháp đo hàm lượng hemoglobin..................................11 3.2.3.4 Phương pháp xác định chỉ số hematocrit ..................................12 3.2.3.5 Phương pháp phân tích Glucose...............................................12 3. 3 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................13 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................14 iv 4.1 Kết quả theo dõi các yếu tố môi trường...................................................14 4.1.1 Nhiệt độ, pH và Oxy hoà tan...........................................................14 4.1.2 Nitrite và tổng đạm amon ................................................................15 4.1.2.1 Tổng đạm amon (TAN) ............................................................15 4.1.2.2 Nitrite (NO2-) ...........................................................................15 4.2. Ảnh hưởng của FOS đến một số chỉ tiêu huyết học...............................16 4.2.1. Số lượng hồng cầu. ........................................................................16 4.2.2. Số lượng bạch cầu..........................................................................17 4.2.3. Tỷ lệ huyết cầu (Hematocrit) ..........................................................18 4.2.4. Số lượng huyết sắc tố (Hemoglobin)...............................................19 4.2.5. Hàm lượng glucose huyết tương......................................................20 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .....................................................21 5.1 Kết luận ................................................................................................21 5.2 Đề xuất.................................................................................................21 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................22 PHỤ LỤC .....................................................................................................24 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Biến động nhiệt độ, oxy, pH trong thí nghiệm ...............................14 Bảng 4.2: Hàm lượng TAN (mg/L) và NO2 (mg/L) của các nghiệm thức trong thời gian thí nghiệm ......................................................................................15 Bảng 4.3. Số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu (đơn vị: 106tb/mm3) .........16 Bảng 4.4: Số lượng bạch cầu (đơn vị: 103tb/mm3) .........................................17 Bảng 4.5. Số lượng Hematocrit (%)...............................................................18 Bảng 4.6. Số lượng Hemoglobin (đơn vị:g/100ml) ........................................19 Bảng 4.7. Hàm lượng glucose (đơn vị: mg/100mL) .......................................20 vi CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1. 1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) hiện nay vẫn đang là một trong các đối tượng nuôi chủ lực ở Đồng bằng sông Cửu Long. Số liệu thống kê cho thấy sản lượng xuất khẩu cá tra, cá basa 7 tháng đầu năm 2012 chiếm 29% trong 7 nhóm xuất khẩu chính, chiếm khoảng 1000 triệu USD (Tạp chí thương mại thuỷ sản, 2012). Trước những giá trị lợi nhuận do cá tra mang lại dẫn đến mức độ nuôi thâm canh tương đối cao và diện tích nuôi nhanh chóng được mở rộng. Dịch bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại chính của mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh (Kohler, 2000). Để điều trị bệnh do vi khuẩn, người nuôi thường sử dụng kháng sinh, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh trong việc điều trị bệnh tạo ra một hệ luỵ nghiêm trọng là tồn dư của kháng sinh trong thịt cá ảnh hưởng đến người tiêu dùng , đễ tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc và có thể làm tác động đến môi trường, hệ sinh thái khu vực (Sarter et al., 2007). Vì vậy, Trong nuôi cá hiện nay, vấn đề chăm sóc sức khoẻ tốt cho cá là một trong những khâu quan trọng. Trong khoảng hai thập kỷ qua đã có một sự hiểu biết về tầm quan trọng của hệ vi sinh vật trong ruột cá. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về các chất kích thích miễn dịch lên động vật thuỷ sản trong đó có prebiotics. Prebiotics là carbohydrate không tiêu hoá được mà có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng hay số lượng các vi khuẩn trong đường ruột (Roberfroid, 1993; Gibson and Roberfroid, 1995; Manning and Gibson, 2004). Prebiotics phổ biến trong cá hiện nay bao gồm inulin, fructooligosaccharides (FOS), fructooligosaccharides chuỗi ngắn (scFOS), mannanoligosaccharides (MOS), galactooligosaccharides (GOS), xylooligosaccharides (XOS),… Nghiên cứu về prebiotic đối với động vật thuỷ sản chủ yếu trên các chỉ số: tốc độ tăng trưởng, hệ số chuyển đổi thức ăn, hệ vi sinh đường ruột, sự tổn thương của tế bào hình thái, hệ miễn dịch, hệ số huyết cầu, hoạt động của lysozyme, hô hấp, thực bào… (Ringo, 2010). Một trong các prebiotics được nghiên cứu nhiều là fructooligosacharide (FOS). FOS có thể được lên men bằng vi khuẩn như Lactobacillus và Bifidobacteria (Sghir et al., 1998; Manning and Gibson, 2004). Đây là những vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hoá, được dùng trong các chế phẩm sinh học. Chế độ ăn bao gồm FOS sẽ hỗ trợ sự tăng trưởng và sự sống của vi khuẩn trong đường ruột của động vật. Khi đó làm tăng sự tăng trưởng, hiệu quả thức ăn và nâng cao khả năng phòng bệnh như nghiên cứu trên cá hồi Đại Tây Dương, cá rô phi lai, ấu trùng cá bơn (Ringo, 2010). Ở Việt Nam hiện nay có rất ít nghiên cứu về các chất prebiotic lên động vật thuỷ sản. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch như FOS 1 lên cá là cần thiết để tìm hiểu ảnh hưởng của chúng như thế nào lên sự tăng trưởng cũng như khả năng chịu đựng stress hay lên một số chỉ tiêu huyết học ở cá. Từ những lý do trên đề tài “Ảnh hưởng của fructooligosaccharide trong thức ăn lên một số chỉ tiêu sinh lý của cá tra giống (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu những ảnh hưởng của FOS lên cá tra thông qua một số chỉ tiêu sinh lý trong máu của cá nhằm góp phần vào việc nâng cao năng suất, hiệu quả của nghề nuôi cá tra. 1.3 Nội dung của đề tài Tìm hiểu ảnh hưởng của FOS trong thức ăn với các hàm lượng bổ sung khác nhau lên một số chỉ tiêu sinh lý như hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin, hematocrit, glucose trong máu cá tra. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài Từ tháng 05/2013 đến tháng 07/2013. 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học 2.1.1 Phân Loại Bộ cá nheo Siluriformes Họ cá tra Pangasiidae Giống cá tra dầu Pangasianodon Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878). 2.1.2 Dinh dưỡng Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột. Ngoài ra khi khảo sát cá bột vớt trên sông, còn thấy trong dạ dày của chúng có rất nhiều phần cơ thể và mắt cá con các loài cá khác. Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục. Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt. Ngay khi vừa hết noãn hoàng cá thể hiện rõ tính ăn thịt và ăn lẫn nhau, do đó để tránh hao hụt do ăn nhau trong bể ấp, cần nhanh chóng chuyển cá ra ao ương (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Trong quá trình ương thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại động vật phù du có kích thước nhỏ và thức ăn nhân tạo. Khi cá lớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả và thức ăn có nguồn gốc động vật như tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại loại thức ăn khác nhau như: thức ăn tự chế, thức ăn công nghiệp, cám, tấm, rau muống... Thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá lớn nhanh hơn (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). Khi ương nuôi trên bể cá có thể sử dụng nhiều loại thức ăn khác nhau như ấu trùng Artemia, trùng chỉ, moina, protifer, thức ăn chế biến,…Tuy nhiên, cho cá bột ăn Artemia và trùng chỉ thì tỉ lệ sống cao và sinh trưởng của cá tốt nhất (Lê Thanh Hùng, 2000). 3 2.1.3 Sinh Trưởng Cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài, cá sẽ bước vào thời kỳ tích lũy mỡ khi đạt 2,5kg. Bên cạnh đó, tốc độ tăng trưởng của cá phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường, mật độ thả nuôi, đặc biệt là chất lượng của thức ăn được sử dụng (Dương Nhựt Long, 2003). Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối cao, là một trong hai loài có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất trong 10 loài thuộc giống Pangasius (Lazard. 1998). Cá tra lớn nhanh trong ao nuôi, sau 1 năm cá đạt khối lượng 1-1,5 kg/con, trong những năm sau cá lớn nhanh hơn, cá nuôi trong ao có thể đạt khối lượng đến 25 kg ở cá 10 tuổi (Nguyễn Văn Kiểm, 2004). 2.1.4 Sinh sản Cá tra không sinh sản tự nhiên ở Việt Nam, mà thành thục và sinh sản ở Campu-chia. Hàng năm, Cá tra bột xuôi dòng sông Mê-kông đến Việt Nam vào khoảng tháng 5-7 dương lịch. Hiện nay, các trại cá giống đã thực hiện được sinh sản nhân tạo ở cá tra (Phạm Thanh Liêm và Nguyễn Thanh Phương, 2003). 2.2 Đặc điểm của FOS 2.2.1 Cấu tạo của FOS FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân tử đường sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết β2,1-glucoside. Công thức tổng quát của đường FOS là GFn, trong đó n là số nhóm n = 2, 3, 4 (G là gốc đường glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là các đường 1-kestose (GF2), nystose (GF3) và fructofuranosylnystose (GF4). Tuy nhiên, nhiều nhà nghiên cứu khác cũng gộp cả các loại đường khác như fructan, glucofructosan và inulin vào nhóm đường FOS. Trong tự nhiên, FOS được hình thành dưới tác dụng của enzyme chuyển hóa fructose. Quá trình trích ly FOS từ những loại thực vật này ở quy mô công nghiệp không có tính kinh tế do nồng độ rất thấp, lượng enzyme lại bị giới hạn bởi điều kiện thời tiết. Vì vậy, FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hoặc thủy phân. 4 Cấu tạo của FOS (Yun, 1996) 2.2.2 Công dụng của FOS 2.2.2.1 FOS thúc đẩy quá trình hấp thu calcium Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng FOS có thể tăng cường hấp thụ calcium của tế bào. Quá trình hấp thụ calcium của FOS xảy ra ở ruột già. Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định một cách rõ ràng, nhưng có một kết luận chung là do ba yếu tô sau: (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004) Đường FOS trong ruột già bị các vi sinh vật acid lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối calcium (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). Trong ruột già vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có chứa FOS sinh ra các acid mạnh ngắn, các acid này khuếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ calcium (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). Sự dịch chuyển của FOS trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất calcium-protein, nhờ đó calcium được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thụ vào máu. Ngoài calcium, FOS đồng thời thúc đẩy hấp thụ cả Magie. Điều nầy thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng calcium trong xương (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). 5 2.2.2.2 FOS trong quá trình chuyển hóa carbohydrat FOS không hoặc rất ít bị phân hủy bởi các enzyme đường ruột, nên khi ăn lượng đường trong máu không bị biến động. trái với sucrose, khi ăn FOS, trong cùng một thời gian. (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). Những biến đổi có tính tích cực phát sinh khi chuyển hóa glucose và chất béo trong quá trình trao đổi chất với sự hiện diện của FOS. Nguyên nhân của các hiệu ứng này là do FOS không bị tiêu hóa ở ruột non bởi tác dụng của các hệ enzyme, mà bị lên men trrong ruột già dưới tác dụng của vi khuẩn Bifidobacterium. Kết quả của quá trình là sinh ra các acid béo đoản mạch như acid acetic, acid propionic và acid putyric. Các chất này sau đó được thấm vào thành ruột già hoặc chuyển lên gan ức chế sự gia tăng của glucose và chất béo trong máu (Santos, 2007). FOS không chỉ làm thay đổi hàm lượng chất béo trong máu mà còn có thể điều chỉnh sự tạo ra các enzyme tổng hợp acid béo. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sucrose nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự cung ứng của FOS. Như vậy FOS có vai trò khá tích cực trong việc phòng ngừa và chửa bệnh tiểu đường một góc bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế FOS hiện nay được dùng như một chất ngọt thấp năng lương đặc biệt cho các đối tượng mắc bệnh tiểu đường. (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). 2.2.2.3 FOS lên hệ vi sinh đường ruột Tác động của FOS đến hệ vi sinh vật đường ruột đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Các nòi Bifidobacterium spp. và Bacteroides spp có thể phát triển mạnh trong môi trường dinh dưỡng có chứa FOS, ngược lại Escherichia coli và Clostridium perfringens lại bị tiêu diệt trong môi trường này. Cả hai đối tượng người và động vật ở các lứa tuổi khác nhau sau khi ăn FOS cho thấy số lượng vi sinh vật Bifidobacterium và Lactobacilli trong đại tràng tăng lên, trong khi đó số lượng vi sinh vật Clostridium perfringens lại giảm xuống. Hiện nay Bifidobacterium được đặc biệt quan tâm trong lĩnh vực sinh học bởi nó mang nhiều lợi ích cho cơ thể sống. Vi khuẩn Bifidobacterium tồn tại và phát huy tác dụng ngay trong cơ thể chủ, điều này rất có ý nghĩa vì nó có thể phòng chống các bệnh tật về đường ruột, do Bifidobacterium có khả năng sản sinh các acid mạch ngắn như acid acetic, acid lactic trong quá trình lên men đường. Sự gia tăng hàm lượng acid sẽ có tác dụng giảm pH trong đường ruột, giữ gìn hoạt động trao đổi chất của các vi sinh vật đường ruột khác ổn định, đúng quy luật, hạn chế hoặc ngăn ngừa sự phát triển của 6 các vi sinh vật gây bệnh và các vi sinh vật gây thối rữa. ở mức độ cao hơn. Ngoài ra vi khuẩn Bifidobacterium còn có khả năng tạo vitamin, nhất là vitamin nhóm B, giảm cholesterol trong máu và tái sinh hệ vi sinh vật đường ruột sau khi dùng nhiều kháng sinh điều trị bệnh (Trịnh Thị Kim Vân và ctv, 2004). 2.3 Một số nghiên cứu về FOS Nghiên cứu được tiến hành đánh giá tác dụng của việc bổ sung chế phẩm Sangrovit®, là sản phẩm thương mại có chứa hoạt chất isoquinoline alkaloid sanguinarine vào khẩu phần ăn lên tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng kháng bệnh của cá tra. Sangrovit® được bổ sung vào khẩu phần ăn cho cá tra trong vòng 16 tuần ở cá nồng độ 25, 50, 75 và 100 ppm. Sau đó cá được gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong vòng một giờ. Mật độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là 3,39 x 105 CFU/ml sau khi ngâm theo dõi tỷ lệ chết trong vòng 14 ngày. Nghiên cứu này chứng minh rằng bổ sung Sangrovit® có ảnh hưởng tích cực đến việc cải thiện đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, nhưng không có tác dụng rõ ràng lên mật độ của bạch cầu và tỷ lệ sống của cá tra sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Lê Hồng Ngọc và nguyễn Như Trí, 2012). ActigenTM do công ty Alltech sản xuất, thành phần của mannan oligosaccharide được ly trích từ tế bào nắm men Saccharomyces cerevisiae. Tác dụng chính của sản phẩm giúp điều chỉnh khả năng đáp ứng miễn dịch, cải thiện tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn. Trong thí nghiệm ActigenTM được bổ sung vào thức ăn với tỷ lệ khác nhau (không bổ sung, 400 g/tấn, 800 g/tấn, 1200 g/tấn) theo dõi trong vòng 10 tuần, sau đó được gây cảm nhiễm vói vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong vòng 1 giờ. Mật độ vi khuẩn gây nhiễm là 106 CFU/ml. sau đó theo đõi tỷ lệ chết 2 lần/ngày trong vòng 14 ngày. Bổ sung ActigenTM giúp tăng hệ miễm dịch không đặc hiệ trên cá tra: 1200 g Actigen/tấn thức ăn giúp gia tăng hoạt lực của lysozyme và 800 g Actigen/tấn thức ăn sẽ hoạt hóa bạch cầu tốt hơn (Đào Ngọc Thủy và ctvd 2012). Thử nghiệm 8 tuần về chế độ ăn đã được tiến hành để điều tra tác động của Fructo-oligosaccharides chuỗi ngắn (ScFOS, Profeed®, 95%) lên hệ vi sinh đường ruột, tỷ lệ chết và tăng trưởng của cá rô phi lai Oreochromis aureus ♂ × O. niloticus ♀. ScFOS được bổ sung ở 0, 0,8 hoặc 1,2 g/kg trong khẩu phần ăn và được cho ăn đến khi no bằng tay bốn lần mỗi ngày, khối lượng ban đầu 5,55 ± 0,02 g được nuôi trong một hệ thống nước chảy. Nghiên cứu này chỉ ra rằng lượng ScFOS bổ sung trong chế độ ăn có thể có tác dụng có lợi vào tăng trưởng, chuyển hóa thức ăn và hệ vi sinh đường ruột trong cá rô phi. Kết quả 7 cho thấy, ScFOS tối ưu là 1,2 g/kg thức ăn cho cá rô phi lai (Hui-yuan et al., 2007). 8 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh lý cá tôm, bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ. Từ tháng 05/2013 đến 07/2013. 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu: + Cá tra giống: kích cỡ khoảng 10 – 15 g, cá được mua từ trại sản xuất giống cá tra, cá được thuần dưỡng khoảng 2 tuần để thích nghi với môi trường bể nuôi. + Thức ăn sử dụng cho cá tra là thức ăn công nghiệp 30% đạm. + FOS: được đặt của hãng Meji của Nhật + Bể composite 500 lít. + Máy so màu quang phổ. + Hóa chất cần thiết cho thí nghiệm: K3Fe(CN)6, KHCO3, KCN, MnSO4… 3.2 Phương pháp nghiên cứu: 3.2.1 Thí nghiệm ảnh hưởng của FOS lên một số chỉ tiêu huyết học của cá Tra: Fructooligosaccharide (FOS) được cung câp bỡi công ty Namsiang. Chứa 95% FOS, 190000 DVN/kg thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong bể composite thể tích 500 lít với 5 nghiệm thức mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thời gian thí nghiệm là 60 ngày. - Nghiệm thức 1: đối chứng (không bổ sung FOS). - Nghiệm thức 2: bổ sung 0,5 % FOS trong thức ăn. - Nghiệm thức 3: bổ sung 1 % FOS trong thức ăn. - Nghiệm thức 4: bổ sung 1,5 % FOS trong thức ăn. - Nghiệm thức 5: bổ sung 2 % FOS trong thức ăn. Cá tra giống được mua từ các trại giống ở Cần Thơ. Cá thí nghiệm được chọn từ những con khỏe mạnh, có kích thước đồng đều, không bị dị tật, dị hình. Mật độ thí nghiệm 70 con/bể. FOS được trộn vào thức ăn theo tỉ lệ như trên. 9 Phương pháp trộn FOS vào thức ăn như sau: pha FOS vào nước theo tỉ lệ 400 ml/5kg thức ăn của mỗi nghiệm thức và trộn vào thức ăn sau đó áo dầu cho thức ăn với tỉ lệ khoảng 2%. Thức ăn sau khi trộn FOS được bảo quản trong tủ lạnh. Cá được cho ăn theo nhu cầu và cho ăn 2 lần/ngày (sáng lúc 8 giờ và chiều lúc 17 giờ). Hàng tuần thay khoảng 50% lượng nước trong bể. Thời gian thí nghiệm là 60 ngày. Thời gian thu mẫu vào các ngày: trước khi bố trí thí nghiệm 1 ngày, ngày thứ 1, 3, 7, 10, 30, 60 sau khi bố trí thí nghiệm. Các chỉ tiêu phân tích: Lấy mẫu máu để phân tích một số chỉ tiêu sinh lý như số lượng hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin, chỉ số hematocrit, hàm lượng glucose trong huyết tương (3 con/bể). Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, oxy ghi nhận 2 lần/ngày bằng máy đo oxy. Các yếu tố như pH, NH3, NO2 theo dõi 1 lần/tuần. pH được đo bằng máy YSI 556 MPS. NO2 được phân tích theo phương pháp Griess lossway, NH3 bằng phương pháp Indo-phenol blue 3.2.2 Phương pháp phân tích mẫu 3.2.2.1 Phương pháp định lượng hồng cầu Hồng cầu được định lượng theo phương pháp thông thường, dùng buồng đếm hồng cầu Neubauer. Nhuộm mẫu trong dung dịch Natt - Herrick. Pha loãng mẫu máu 200 lần trong dung dịch Natt – Herrick: cho 5 µL máu 950 µL dung dịch Natt – Herrick. Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm (thao tác phải nhanh (khoảng 5-10 giây) để tránh hiện tượng máu bị đông lại). Dưới kính hiển vi quang học (40X). Đầu tiên xem ở vật kính Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ C), đưa vào giữ thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 2 lần lập lại. Cách tính mật độ hồng cầu: HC = (a x 200)/0,02 (tế bào/mm3) Trong đó: a là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm. 200: độ pha loãng hồng cầu 0,02: thể tích của 5 vùng đếm. 10 3.2.2.2. Phương pháp định lượng bạch cầu Bạch cầu được định lượng theo phương pháp Hurbec et. al, 2000. Trãi mẫu: nhỏ một giọt máu lên một góc lame và dùng một miếng lamelle đặt trước giọt máu; cho lamelle chạm vào giọt máu và đẩy lamelle ngược về phía trước; nhanh chóng làm khô mẫu máu bằng cách đặt trước gió; sau đó cố định mẫu máu bằng cách ngâm mẫu trong methanol 1 – 2 phút; và để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh. Nhuộm mẫu: mẫu máu đã được cố định trên lame sẽ nhuộm bằng dung dịch nhuộm Wright & Giemsa: Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút. Ngâm trong dung dịch có pH 6,2-6,8 trong 5-6 phút. Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20-30 phút. Ngâm trong dung dịch pH trong 15-30 phút. Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Số lượng tổng bạch cầu được xác định bằng cách đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1500 tế bào trên lame nhuộm và tính theo công thức: W = H x h/(1500 - h). W: tổng số bạch cầu. h: số bạch cầu đếm được trong tổng số 1.500 tế bào trên lame nhuộm H: mật độ hồng cầu trong mẫu máu tươi. 3.2.3.3 Phương pháp đo hàm lượng hemoglobin Hemoglobin được đo bằng thuốc thử Drabkin (Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư, 2010). Thuốc thử Drabkin gồm thuốc thử I (Reagent I,HR I) được pha từ 20g K3Fe(CN)6 trong 1000mL nước cất và thuốc thử II (Reagent II, HR II) được pha từ 75g KHCO3 và KCN trong 1000mL nước cất. Lấy 10mL HR I và 10 mL HR II pha với nước cất thành 1000mL. Pha loãng 10 µL máu cá thu được với 2,5mL thuốc thử trong cuvet và đem so màu ở bước sóng 540nm. Thuốc thử chuyển huyết sắc tố thành chất Cynomethemoglobin có màu vàng theo 2 phản ứng: 11 Hemoglobin (Fe++) Otassium ferrcyanide Methemoglobin (Fe+++) Potassium cyanide Methemogobin (Fe+++) Cyanomethemoglobin Do mức độ hấp thu ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 540nm, nhiệt độ 2025oC bằng máy hấp thu quang phổ (UV spectrophotometer). Mỗi mẫu máu được đo lập lại 2 lần (2 cuvet). Số lượng huyết sắc tố tính theo công thức: Khối lượng huyết sắc tố (mmol/L). A = (0,019 + 37,74 a) x 0,621. Trong đó: a: mức độ hấp thu ánh sáng trung bình của mẫu đo. Khối lượng huyết sắc tố (g/100mL). B = (A x 1,6125). 3.2.3.4 Phương pháp xác định chỉ số hematocrit Xác đinh chỉ số hematocrit theo phương pháp của Larsen and Snieszko (1961). Mẫu máu cá cho vào ependorf, sử dụng tuýp thủy tinh chuyên biệt lấy mẫu máu đem ly tâm trong 6 phút bằng máy ly tâm sigma 201m với tốc độ là 12.000 vòng/phút; đo chiều dài tổng và chiều dài đoạn huyết sắc tố để tính phần trăm huyết sắc tố. 3.2.3.5 Phương pháp phân tích Glucose Phân tích glucose theo phương pháp của Hugget and Nixon (1957). Enzyme glucose oxidase biến glucose thành glucose peroxide, glucose peroxide phản ứng với ABTS (2,2 Azino-di- (3-ethylbenxoline sulfonate)) tạo thành hợp chất màu xanh và đo ở bước sóng 463 nm. Dung dịch đệm phosphate 0,6 M; 0,1 M; acid perchloric (0,33 M); và dung dịch glucose chuẩn, dung dịch phản ứng. Cho 25 µL huyết thanh hoặc mẫu chuẩn vào eppendorf 500 µL. Thêm 50 µL acid perchloric. Trộn đều và ly tâm 3000 vòng trong 10 phút. 12