Tài liệu Đề tài: Quy trình định lượng S.Aureus bằng phương pháp đếm đĩa

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN MÔN:MÔN: MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH NHÓM THỰC HIỆN: 7 1. Tổng quan về vi khuẩn staphylococcus aureus: Đặc điểm: - Hiếu khí hay kị khí tùy ý - Cầu khuẩn, Gram (+), chùm nho - Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese - Khả năng lên men đường manitol, trehalose, sucrose - Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tương Phân bố: - Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng,…qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến. Ngoài ra còn có trên lông, mụn nhọt, vết thương,… - Có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. - Hầu hết các vòng tan máu đều tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. - Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt. staphylococcus aureus Quy trình định lượng S.aureus 2.1 Phạm vi áp dụng: - Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005 ( ISO 6888-1 : 1999) - *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc ( môi trường Baird-Packer) ở 350C – 370C. 2.2 Nguyên tắc: - Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc, một lượng mẫu qui định (sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù). - Ủ các đĩa ở điều kiện hiếu khí ở 37oC và kiểm tra 24h hoặc 48h. - Tính số lượng Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính. 2.3 Môi trường và hóa chất: Môi trường Công dụng Dung dịch Saline Peptone Water (SPW) Dung dịch đẳng trương để pha loãng mẫu Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus Môi trường Baird – Parker Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Brain heart broth (BHI) Huyết tương thỏ HCl 10% NaOH 10% Bảo quản và phục hồi vsv trong quá trình nuôi cấy Dùng để khẳng định S.aureus Chỉnh pH môi trường 2.5 Qui trình phân tích: Chương 3: Thuyết minh qui trình Bước 1: chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Lấy 10g ( mẫu rắn) hoặc hút 10ml ( mẫu lỏng) 90ml dung dịch pha loãng SPW ( hoặc túi nhựa vô trùng ) Cho vào máy dập mẫu (mẫu rắn) hoặc lắc đều (mẫu lỏng) Đồng nhất mẫu Bước 2: Pha loãng mẫu DD 10 -2 Hút 1ml dd 10 -1 9ml SPW Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10 4, 10 -5,… cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp. Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc Hút 0.1ml dd mẫu BPA Bước 4: quan sát, đếm số khuẩn lạc Sau 24h Sau 24h tiếp theo Đánh dấu khuẩn lạc điển hình Khuẩn lạc S.aureus dương tính,đánh dấu khuẩn lạc không điển hình Bước 5+6: Phục hồi và khẳng định Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ BPA sang các ống nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI Ủ 37 ± 1oC trong 24 ± 3h Hút 0,1 ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm × 75mm đã chứa 0,3 ml huyết tương thỏ ( hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất) Kiểm tra sự động tụ của huyết tương sau 4, 6, 8, 24h Xác định tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Báo cáo kết quả - Âm tính: không có khối đông, hỗn hợp dung dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. - Dương tính: có khối động tụ huyết tương chiếm ¾. Âm tính Dương tính Bước 7: báo cáo kết quả Ví dụ Nồng độ pha loãng Nt Ht 5 5/5 5 2 5 30 Số phản ứng coagulase (+) 5 Na Số khuẩn lạc thử nghiệm phản ứng coagulase 5 5 1 Ha 10-2 47 5 2/5 5/5 10-3 8 1/5 Kết quả