Tài liệu Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm

Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM – KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC – THỰC PHẨM MÔN HỌC: Hóa Học Thực Phẩm Đề tài: ENZYME LÀM SẪM MÀU TRONG THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: ThS. Đặng Thị Ngọc Dung Nhóm thực hiện: STT Họ tên sinh viên MSSV 1 Đinh Ngọc Loan 12116043 2 Nguyễn Thị Thanh Trúc 12116084 3 Đặng Thanh Bình 12116006 4 Nguyễn Thị Ánh Tuyết 12116034 TP. Hồ Chí Minh Tháng 04/2014 1 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Trường Đại Học Sư Phạm – Kỹ Thuật Tp.Hcm Khoa Công Nghệ Hoá Học – Thực Phẩm MÔN HỌC: Hóa Học Thực Phẩm Đề tài: ENZYME LÀM SẪM MÀU TRONG THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Đặng Mỹ Duyên Nhóm thực hiện: STT Họ tên sinh viên MSSV 1 Đinh Ngọc Loan 12116043 2 Nguyễn Thị Thanh Trúc 12116084 3 Đặng Thanh Bình 12116006 4 Nguyễn Thị Ánh Tuyết 12116034 TP. Hồ Chí Minh Tháng 04/2014 2 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... Điểm số: TP.HCM, ngày…..tháng…..năm…… Chữ ký của giảng viên .............../........... LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên nhóm xin cảm ơn Khoa công nghệ hóa học – thực phẩm đã mơ môn học Hóa Học Thực Phẩm để tạo điều kiê ên cho chúng tôi học hỏi và tổng hợp 3 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm những kiến thức, kỹ năng đã được học để có thể thực hiện một bài báo cáo hoàn chỉnh. Đồng thời, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô ThS. Đặng Thị Ngọc Dung viên bộ môn công nghệ chế biến lương thực. Cô đã mang đến cho chúng tôi rất nhiều kiến thức và kinh nghiê êm thực tế bổ ích. Hơn thế nữa, Cô rất nhiệt tình giúp nhóm giải quyết những vấn đề, thắc mắc gặp phải và cho chúng tôi nhiều ý kiến đánh giá, nhận xét rất quý giá. Nhờ đó, nhóm có thể thực hiê nê bài báo cáo này mô êt cách tốt nhất và hoàn thành đúng thời hạn. Tuy nhiên, do kiến thức chuyên môn còn hạn chế và cách hành văn chưa tốt nên không thể tránh khỏi những thiếu sót, chúng tôi xin chân thành đón nhâ nê ý kiến đóng góp của giảng viên để cuốn báo cáo sau hoàn thiê ên hơn. 4 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm LỜI MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày càng phát triển thì nhu cầu về thực phẩm của con người càng tăng lên. Nếu như trước kia, công nghệ bảo quản thực phẩm chỉ cần đảm bảo chỉ thực phẩm không bị hư hỏng, đảm bảo hàm lượng chất dinh dưỡng là được thì nay đòi hỏi công nghệ làm sao cho thực phẩm vẫn giữ chất lượng trong quá trình bảo quản vận chuyển mà còn đảm quản về mặt cảm quan, hình thức tươi ngon. Trong số các sản phẩm yêu cầu cần thiết là rau quả và hải sản phải tươi. Nhưng các sản phẩm này thường có xu hướng sẫm màu nhanh chóng sau khi thu hoạch. Có hai nguyên nhân dẫn đến sự sẫm màu đó là do sự oxi hóa bơi enzyme và oxi hóa bỏi các tác nhân không bơi enzyme. Mà thực chất yếu tố chủ yếu là do enzyme, bơi vì các phản ứng do enzyme nhanh, gây tác động tức thì. Hiểu về bản chất, nguyên nhân và cách ức chế enzyme sẫm màu này là cần thiết trong bảo quản. Qua bài này chúng ta sẽ biết được đó là enzyme gì, cơ chế và ứng dụng chúng trong công nghệ thực phẩm và các ngành liên quan. 5 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Hóa sinh công nghiệp – Lê Ngọc Tú www.fao.org www.wikipedia.org http://www.food-info.net/uk/colour/enzymaticbrowning.htm http://www.buzzle.com/articles/enzymatic-browning.html http://videosdigitals.uab.es/cr-vet/www/21254/Enzymatic%20Browning.htm www.wholefoodsmagazine.com www.biomedcentral.com/1471-2164/13/395 MỤC LỤC Contents NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN__________________________________________________3 LỜI CẢM ƠN_________________________________________________________________4 LỜI MỞ ĐẦU________________________________________________________________5 TÀI LIỆU THAM KHẢO________________________________________________________6 MỤC LỤC____________________________________________________________________6 Chương 1: Giới thiệu vềề enzyme__________________________________________________7 1.1 Giới thiệu về enzyme______________________________________________________7 1.2 Enzyem làm sẫm màu trong thực phẩm______________________________________10 1.3 Cơ chất của phản ứng sẫm màu(Polyphenol)_________________________________10 1.4 Tác hại của enzyme làm sẫm màu___________________________________________13 6 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm 1.5 Lợi ích của enzyme làm sẫm màu___________________________________________13 Chương 2: Tính chấất, cơ chềấ và phấn loại enzyme làm sấẫm màu________________________15 2.1 Tính chất và cơ chế_______________________________________________________15 2.2 Phân loại_______________________________________________________________16 2.3.1 Monophenol oxidase(Tyrosinase)..............................................................................................................17 2.2.2 O-diphenol oxidase(Catechol oxidase)......................................................................................................17 2.2.3 Laccase.......................................................................................................................................................17 Chương 3: Vai trò sinh lý của enzyme làm sấẫm màu(PPO)____________________________18 3.1 Đối với thực vật__________________________________________________________18 3.2 Đối với động vật__________________________________________________________18 Chương 4: Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sẫm màu của enzyme___________________20 3.1 Nhiệt độ________________________________________________________________20 3.2 pH_____________________________________________________________________21 3.3 Nồng độ oxy_____________________________________________________________21 Chương 5: Các biện pháp công nghệ kiềm hãm sự sẫm màu do tác dụng của enzyme trong quá trình chế biến và bảo quản__________________________________________________22 5.1 Các phương pháp vâ ât ly___________________________________________________23 5.1.1 Phương pháp chần.....................................................................................................................................23 5.1.2 Phương pháp làm lạnh................................................................................................................................26 5.1.3 Phương pháp đông lạnh..............................................................................................................................26 5.1.4 Phương pháp làm mất nước........................................................................................................................27 5.1.5 Phương pháp chiếu xạ................................................................................................................................29 5.1.6 Phương pháp chế biến bằng áp suất cao.....................................................................................................30 5.1.7 Xử lý băng phương pháp siêu lọc (UF)......................................................................................................32 5.1.8 Xử lý bằng sóng siêu âm...........................................................................................................................33 5.2 Các phương pháp hóa học_________________________________________________34 5.2.1 Tác động đến các enzyme..........................................................................................................................34 5.2.2 Loại bỏ kim loại.........................................................................................................................................35 5.2.3 Loại bỏ oxi.................................................................................................................................................36 5.2.4 Ức chế sự tạo thành melanin......................................................................................................................39 Chương 6: Ứng dụng của enzyme làm sẫm màu PPO trong thực phẩm và các ngành công nghiệp khác__________________________________________________________________41 6.1 Trong ngành công nghiệp thực phẩm________________________________________41 6.2 Trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy____________________________________41 6.3 Trong công nghệ môi trường_______________________________________________41 7 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm 6.4 Trong lĩnh vực y tế_______________________________________________________42 6.5 Trong ngành công nghiệp dệt may__________________________________________42 6.6 Trong các ngành công nghiệp khác__________________________________________42 Câu hỏi______________________________________________________________________43 Chương 1: Giới thiệu vềề enzyme 1.1 Giới thiệu về enzyme Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất cao, mặc dù ơ điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sơ dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzym. Enzym là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein. Như vậy, enzym là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), enzym sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác bơi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bơi enzym. Hoạt tính của enzym chịu tác động bơi nhiều yếu tố. Chất ức chế là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzym.  Tính chất của enzyme: Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.  Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực.  Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động.  Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ơ các dạng: cation, anion hay trung hòa điện. 8 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm  Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase... và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)  Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần  Apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặc hiệu)  Coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.  Trung tâm hoạt động của enzyme:  Trong quá trình xúc tác của enzym vùng cấu trúc không gian đặc biệt tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động".  Cấu tạo đặc biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của enzym.  Trong "enzym 1 cấu tử", các acid amin thường phân bố trên những phần khác nhau của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành trung tâm hoạt động. Sự kết hợp của các nhóm chức của các acid amin, thường gặp là -SH của cysteine, -OH của serine, vòng imidazol của histidine, w-COOH của aspartie và acid glutamic, -COOH của các acid amin cuối mạch...  Trong "enzym hai cấu tử" ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức kết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzym và các nhóm ngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động  Ở enzym chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạo trung tâm hoạt động  Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt hai nhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzym) và "nền tiếp xúc" (giúp enzym kết hợp đặc hiệu với cơ chất)  Một enzym có thể có 2 hoặc nhiều trung tâm hoạt động, tác dụng của các trung tâm hoạt động không phụ thuộc vào nhau.  Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzym-cơ chất (ES) E + S → ES->ES → E + P S: cơ chất 9 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm P: sản phẩm Yêu cầu: E và S phải bổ sung về mặt không gian và hợp nhau về mặt hóa học, có khả  năng hình thành nhiều liên kết yếu với nhau. Chúng liên kết sao cho có thể tạo ra và cắt đứt sự dính nhau được gây nên do biến động nhiệt ngẫu nhiên ơ nhiệt độ thường. Trong một số enzym còn có "trung tâm dị không gian" - những phần enzym khi kết hợp  với các chất có phân tử nhỏ nào đó sẽ làm biến đổi cấu trúc bậc ba của toàn bộ phân tử enzym làm cấu trúc trung tâm hoạt động thay đổi → biển đổi hoạt tính của enzym.  Tính đặc hiệu của enzyme: Enzym chỉ tác dụng lên một số cơ chất và một số kiểu nối hóa học nhất định trong phản ứng→tính đặc hiệu  Đặc hiệu lập thể: chỉ tác dụng lên một dạng đồng phân quang học. Enzym cũng thể hiện tính đặc hiệu với các đồng phân hình học: chỉ tác dụng lên một dạng đồng phân cis hoặc trans  Đặc hiệu tuyệt đối: Enzym chỉ có khả năng tác dụng lên một cơ chất nhất định. Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym phải kết hợp chặt chẽ với cấu trúc của cơ chất, một khác  biệt nhỏ về cấu trúc của cơ chất cũng làm enzym không xúc tác được. Đặc hiệu tương đối: enzym có tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào bản chất hóa học của các cấu tử tham gia tạo thành liên kết đó  Đặc hiệu nhóm: Enzym có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết nhất định khi một hay hai cấu tử tham gia tạo thành liên kết này có cấu tạo nhất định.  Enzyme được chia thành 6 nhóm lớn:  Oxydoreductaza: Xúc tác cá phản ứng oxi hóa khử.  Transferaza: Chuyển vị một nhóm nào đó từ chất này sang chất khác.  Hydrolaza: Xúc tác phản ứng thủy phân  Isomeraza: Chuyển hóa giữa hai dạng đồng phân của một cơ chất.  Liaza: Xúc tác qua trình phân cắt một nhóm nào đó ra khối hợp chất mà không có sự tham gia của H2O.  Ligaza: Xúc tác phản ứng kết hợp của hai phân tử kèm theo sự cắt đứt mối liên kết pirophosphat cao năng lượng ATP. 10 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm 1.2 Enzyem làm sẫm màu trong thực phẩm Hình thức bề ngoài, hương vị, kết cấu và giá trị dinh dưỡng bốn thuộc tính được coi là người tiêu dùng khi đưa ra lựa chọn thực phẩm. Trong đó hình thức bề ngoài, màu sắc là yếu tố đầu tiên mà người tiêu dùng đánh giá chất lượng sản phẩm. Màu sắc có thể bị ảnh hương bơi các sắc tố tự nhiên như chlorophyll, carotenoid và anthocyanin trong thực phẩm, hoặc bơi các các phản ứng từ enzyme và các phản ứng không enzym. Sẫm màu do enzyme là một trong những phản ứng màu quan trọng nhất ảnh hương đến các loại trái cây, rau quả và hải sản. Sẫm màu do enzyme là một quá trình hóa học, thường xảy ra trong trái cây và rau quả vì nhóm nhỏ enzyme polyphenol oxidase, thuộc nhóm lớn enzyme oxydoreductaza, có khả năng xúc tác quá trình oxi hóa phenolic để tạo thành melanin, gây sẫm màu thực phẩm. Sự tác động sẫm màu do enzyme này được nghiên cứu nhiều nhất trong trái cây, rau và hải sản. Ngoài ra, các nhà khoa học về thực phẩm(rau quả, thực vật và sinh lý sau thu hoạch), vi sinh vật và thậm chí về cả sinh lý côn trùng và động vật giáp xác đã và đang nghiên cứu phản ứng này vì sự tác động nhiều mặt của nó. 1.3 Cơ chất của phản ứng sẫm màu(Polyphenol) Polyphenol , còn được gọi là hợp chất phenolic, là nhóm các chất hóa học có trong thực vật (rau quả) đóng vai trò quan trọng trong quá trình nâu hóa bơi enzyme, bơi vì nó là chất nền cho màu nâu. Các hợp chất phenolic chịu trách nhiệm cho màu sắc của nhiều loài thực vật, chẳng hạn như táo, nó là một phần của hương vị và hương vị của đồ uống (nước táo, trà), và rất quan trọng chống oxy hóa trong các nhà máy. Polyphenol là những chất hữu cơ thường phức tạp, có chứa nhiều nhóm phenol (acid carbolic): Cấu trúc 1: Phenol 11 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Hình 4: Cấu trúc 2 Theaflavin, một polyphenol trong trà ( Nguồn ) Polyphenol có thể được chia thành nhiều loại phụ khác nhau, chẳng hạn như anthocyans (màu sắc trong trái cây), flavonoid (catechin, tannin trong trà và rượu) và không flavonoid thành phần (axit galic trong lá chè). Flavonoid được hình thành trong các nhà máy từ các axit amin thơm phenylalanine và tyrosine. Hình 5 : Màu sắc của táo là do polyphenol Bảng 1:Cơ chất của phản ứng sẫm màu thực phẩm có trong các loại rau quả (Nguồn từ FAO) Nguồn Chất phenolic Táo axit chlorogenic (thịt), catechol, catechin (vỏ), axit caffeic, 3,4dihydroxyphenylalanine (DOPA), axit benzoic 3,4-dihydroxy, p- cresol, 4-methyl catechol, leucocyanidin, p- coumaric axit, flavonol glycosides Bơ 4-metyl catechol, dopamine, pyrogallol, catechol, acid chlorogenic, axit caffeic, DOPA Chuối 3,4-dihydroxyphenylethylamine (Dopamine), leucodelphinidin, leucocyanidin 12 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Cacao catechin, leucoanthocyanidins, anthocyanins, tannin phức tạp Hạt cà phê axit chlorogenic, axit caffeic Cà tím axit chlorogenic, axit caffeic, axit coumaric, dẫn xuất của acid cinnamic Nho catechin, axit chlorogenic, catechol, acid caffeic, DOPA, tannin, flavonol, axit protocatechuic, resorcinol, hydroquinone, phenol Tôm tyrosine Xoài dopamine HCl, 4-methyl catechol, acid caffeic, catechol, catechin, axit chlorogenic, tyrosine, DOPA, p- cresol Nấm tyrosine, catechol, DOPA, dopamine, adrenaline, noradrenaline Đào axit chlorogenic, pyrogallol, 4-methyl catechol, catechol, axit caffeic, axit galic, catechin, dopamine Lê axit chlorogenic, catechol, catechin, axit caffeic, DOPA, axit benzoic 3,4dihydroxy, p- cresol Nho khô axit chlorogenic, catechin, axit caffeic, catechol, DOPA Khoai tây axit chlorogenic, axit caffeic, catechol, DOPA, p- cresol, p- hydroxyphenyl axit propionic, p- hydroxyphenyl acid pyruvic, m- cresol Tôm tyrosine Khoai lang Axit chlorogenic, axit caffeic, caffeylamide Trà flavanol, catechin, tannin, dẫn xuất của acid cinnamic 1.4 Tác hại của enzyme làm sẫm màu Sự hóa nâu do enzyme là một trong những phản ứng tác động nghiêm trọng đối với nhiều loại trái cây và rau quả, đặc biệt là giống nhiệt đới và cận nhiệt đới. Người ta ước tính rằng hơn 50% tổn thất là kết quả của enzyme gây nâu hóa (Whitaker và Lee, 1995). Những sự tổn thất này đáng quan ngại và khiến người ta muốn biết rõ về enzyme này và cách kiểm soát chúng trong thực phẩm. Rau diếp, khoai tây, khoai lang, nấm, táo, lê, chuối, nho, đào,… và một loạt các loại trái cây và rau quả nhiệt đới và cận nhiệt đới khác, rất nhạy cảm với màu enzyme gây nâu hóa và do đó gây ra thiệt hại kinh tế cho nông học. Màu nâu cũng có thể ảnh hương xấu đến hương vị và 13 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm giá trị dinh dưỡng. Vì vậy sự kiểm soát của màu nâu từ thu hoạch đến người tiêu dùng là rất quan trọng để giảm thiểu thiệt hại và duy trì giá trị kinh tế trong nông học và thực phẩm. Hình 1: Quả bị sẫm màu do enzyme Ngoài ra sự hóa nâu do enzyme còn xảy ra trong các loại thủy sản đặc biệt là động vật giáp xác như tôm, cua,… Đặc biệt như các sản phẩm có giá trị cao như tôm hùm thì càng dễ bị tác động xấu bơi enzyme này. Mặc dù các sản phẩm bị nâu hóa này không có hại và không ảnh hương đến hương vị và mùi hương, nhưng người tiêu dùng sẽ không chon các sản phẩm này, vì họ thường nghỉ nó bao hàm sự hư hỏng. Có rất nhiều ví dụ về các sản phẩm thủy sản nhập khẩu vào Hoa Kỳ, trị giá hàng triệu đô la, bị giảm đáng kể hoặc mất hoàn toàn giá trị do enzyme gây nâu. Thật không may, đa số các ản phẩm này có nguồn gốc ơ các nước đang phát triển, nơi mà thiếu cả khoa học kỹ thuật lẫn cơ sỡ hạ tầng để ngăn chặn, ức chế enzyme này. 1.5 Lợi ích của enzyme làm sẫm màu Khi nhắc tới enzyme gây sẫm màu trong thực phẩm, người ta thường có cái nhìn tiêu cực về nó và thường suy nghĩ tới những ảnh hương có hại. Tuy nhiên, một số phản ứng enzyme gây sẫm màu rất có lợi cho các sản phẩm trà, café, cacao,… và các sản phẩm trái cây khô như nho, mận. Các sản phẩm này sau khi enzyme polyphenol oxidase kích hoạt phản ứng phát triển màu nâu đặc trưng, đến một ngưỡng màu theo yêu cầu, sau đó sẽ cho ức chế enzyme để giữ màu nâu, giảm thiểu mất màu. 14 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Hình 2: Màu nâu đặc trưng của socola. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng sản phẩm melanin của quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic nhờ enzyme PPO có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư và là chất chống oxy hóa. Vì vậy theo các chuyên gia thì khuyến khích chúng ta sử dụng các sản phẩm có các hợp chất phenolic và các sản phẩm oxi hóa từ nó nhờ enzyme PPO. Chương 2: Tính chấất, cơ chềấ và phấn loại enzyme làm sấẫm màu 2.1 Tính chất và cơ chế Polyphenol oxidase là một tetramer có chứa bốn nguyên tử đồng trên mỗi phân tử, liên kết giữa chất thơm và oxy. Enzyme xúc tác quá trình o-hydroxyl của monophenols (phân tử phenol trong đó vòng benzen có chứa một nhóm thế hydroxyl đơn) tạo thành o-diphenols (phân tử phenol có chứa hai nhóm thế hydroxyl). Chúng tiếp tục xúc tác quá trình oxy hóa của odiphenol để tạo ra o-quinon. Đây là quá trình polyme hoá nhanh o-quinon để tạo ra sắc tố đen, nâu hoặc đỏ (polyphenol) là nguyên nhân của màu nâu trái cây. Axit amin tyrosine có chứa một vòng phenolic duy nhất mà có thể bị oxy hóa do tác động của PPO để hình thành o-quinone. Do đó, PPO cũng có thể được gọi là tyrosinases.(Nguồn Wikipedia) PPO là được phát hiện đầu tiên ơ nấm và phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong plastic và lục lạp của thực vật, mặc dù tồn tại tự do trong tế bào chất của senesing hoặc trái cây chín. PPO được đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng chống vi khuẩn, virus và điều kiện khí hậu bất lợi. Ngoài ra, PPO cũng được tìm thấy ơ động vật và được cho là làm tăng khả năng kháng bệnh ơ côn trùng và động vật giáp sát. 15 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Hình 2: Hình thành màu nâu Khi sự có mặt của oxy không khí, các enzyme xúc tác những bước đầu tiên trong việc chuyển đổi sinh hóa của phenol để sản xuất quinon và trải qua trùng hợp để mang lại một dạng polyme màu tối, không hòa tan gọi là melanin. Các melanin hình thành rào cản và có đặc tính kháng khuẩn, ngăn chặn sự lây lan của sự nhiễm trùng hoặc bầm tím trong mô thực vật. Ở thực vật, những giống chịu được điều kiện khắc nhiệt có mức PPO cao hơn rất nhiều so với các giống mẫn cảm hơn. Một ví dụ về sự hình thành của melanins từ một polyphenol đơn giản, tyrosine, được thể hiện trong hình bên dưới: 16 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm Hình 3 : Hình thành melanins từ tyrosine (nguồn Hình ảnh Nguồn: fao.org). Polyphenoloxidase xúc tác hai phản ứng cơ bản: hydroxyl hóa và quá trình oxy hóa. Cả hai phản ứng sử dụng oxy phân tử (không khí) như là một đồng chất nền.Phản ứng không chỉ phụ thuộc vào sự hiện diện của không khí, mà còn về độ pH (độ axit). Phản ứng không xảy ra tại acid (pH <5) hay kiềm (pH> 8) điều kiện. 2.2 Phân loại PPO bao gồm monophenol oxidase, diphenol oxidase bao gồm o-diphenol oxidase và pdiphenol oxidase(laccase). Monophenol oxidase giúp thủy phân gốc monophenol tạo thành gốc o-diphenol. Oxidase diphenol oxy hóa diphenol để cho benzoquinones. Tỉ lệ của oxidase monophenol và diphenol trong cây thường là 1:10 hoặc thấp hơn 1:40. 2.3.1 Monophenol oxidase(Tyrosinase) Monophenol oxidase xúc tác quá trình thủy phân o-diphenols tạo thành monophenols. Enzyme được gọi là tyrosinase ơ động vật, L-tyrosine là chất nền monophenolic 17 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm lớn. Trong cây, các enzyme đôi khi được gọi là cresolase do khả năng của các enzyme để sử dụng oxi hóa các chất nền monophenolic, cresol. 2.2.2 O-diphenol oxidase(Catechol oxidase) Quá trình oxy hóa của chất diphenolic để tạo quinon với sự có mặt của oxy được xúc tác bơi diphenol oxidase. Oxidase diphenol đã nhận được nhiều sự chú ý do tỷ lệ xúc tác cao và liên kết của nó với sự hình thành của quinon, để hình thành các sắc tố màu nâu, melanin. Khi sự có mặt của đủ ba yếu tố oxi, diphenol và enzyme diphenol oxidase thì một quá trình phản ứng xảy ra tạo thành quion(màu sẫm), tiếp tục qua quá trình trùng hợp tạo thành melanin. Cơ chế của phản ứng oxidase diphenol vẫn còn chưa biết vì không có trung gian các gốc tự do được hình thành và oxy liên kết với các enzyme trước khi ràng buộc của o chất nềndiphenolic. 2.2.3 Laccase Laccase ( p -diphenol oxidase, EC 1.10.3.2) (DPO) là một loại có chứa đồng polyphenol oxidase. Nó có khả năng độc đáo của oxy hóa p -diphenols, do đó cho phép nó được phân biệt với o- diphenol oxidase như catechol oxidase. Laccases là màu xanh đậm màu trong trạng thái tinh khiết. Laccases là các glycoprotein có trọng lượng phân tử khác nhau, từ 60 đến 80 kDa, và một hàm lượng carbohydrate khác nhau từ 15-41%. Laccases tìm thấy trong nhiều loại nấm phytopathogenic và trong một số thực vật bậc cao (Mayer và Harel, 1991). Laccases từ thực vật bậc cao và laccases từ nấm được biết đến có trong tế bào chất. Ngoại trừ đào (Harel et al . 1970) và mơ (Dijkstra và Walker, 1991), laccases không xảy ra trong trái cây và rau quả. Laccase là một thành phần của hệ thống tổng hợp lignin trong mô gỗ (Bảo et al . 1993). Tuy nhiên nó là không liên quan đến ligninolysis trong một số nấm. Laccase từ Aspergillus nidulans có liên quan đến sự tổng hợp sắc tố (Hermann et al . 1983). Laccase sản xuất bơi các loại nấm Botrytis cinerea cũng liên quan đến bệnh tật truyền nhiễm mà dẫn đến nhiễm trùng thối mềm trong dưa chuột (Viterbo et al . 1993). Chương 3: Vai trò sinh lý của enzyme làm sấẫm màu(PPO) Để cho các nhà khoa học thực phẩm để hiểu rõ hơn làm thế nào để ngăn chặn enzyme nâu hóa, điều quan trọng là phải hiểu lý do tại sao polyphenol oxidase hiện diện trong mô thực vật và động vật. Mặc dù biết và giả thuyết một số chức năng của PPO trong các mô, các nhà nghiên cứu vẫn đang cố gắng giải đáp chức năng của enzyme này trong cả hai hệ thống động vật và thực vật. 18 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm 3.1 Đối với thực vật Polyphenol oxidase lần đầu tiên được phát hiện ơ nấm và thực tế thì chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng được tồn tại trong platid và lục lạp của thực vật, đồng thời tồn tại tự do trong tế bào chất quả trái cây chín(Vaughn và Duke, 1984). PPO đóng vai trò quan trọng giúp cho cây phòng chống bị nhiễm trùng do vi khuẩn, virus và điều kiện khí hậu bất lợi. Phenolics như axit chlorogenic, axit caffeic và scopolin,… các chất nền của enzyme này đã được chứng minh có biểu hiện tính diệt nấm. PPO tồn tại trong lục lạp còn hợp chất phenolic tích lũy trong không bào, khi cây bị tổn thương các chất này kết hợp với nhau, dưới sự có mặt của oxi không khí tạo quion và sau đó là tạo melanin giúp đông tụ mủ cây, tạo thành rào cản và có đặc tính kháng khuẩn, ngăn chặn sự lây lan của nhiễm trùng hoặc bầm tím trong mô thực vật. Mức độ nhiều hay ít PPO thể hiện tính chống chịu của cây đó trước những điều kiện bất lợi. Ở các cây mà sự chống chọi với những điều kiện bất lợi có chứa PPO nhiều hơn gấp nhiều lần so với các giống cây mẫn cảm hơn. Hệ thống các enzyme khác trong cây như chitinase, peroxidase, lipoxygenase, phenylalanine ammonia lyase, b -1,3-glucanase,… cũng có biểu hiện tăng khi cây bị stress. 3.2 Đối với động vật Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC22812/ Polyphenol oxidase tồn tại trong cả côn trùng và động vật giáp xác như một zynogen hoặc hình thức propolyphenol oxidase và cũng được cho là có khả năng kháng bệnh. Enzyme này cho là liên quan tới miễn dịch và nhận thức. Khi xâm nhập vào cơ thể động vật, các vi sinh vật tiết protease, gây phân hủy protein, gây bệnh cho cơ thể. Khi đó, propolyphenol oxidase được kích hoạt bơi protease tạo thành PPO, chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật này. Chất chuyển hóa thứ cấp khác được sản xuất bơi các vi sinh vật, chẳng hạn như glucans, glycoprotein, laminarins, lipopolysaccharides,… cũng có thể gây ra sự kích hoạt propolyphenol oxidase. Ngoài tác dụng là kháng khuẩn, PPO trong động vật giáp xác và côn trùng cũng liên quan tới quá trình làm cứng lớp vỏ kitin trong chu trình tăng trương. Các enzyme này còn nằm trong lớp biểu bì và hemolymph dưới dạng propolyphenol oxidase. Khi lột xác, lúc đó cơ thể yếu nhất, các prophenol oxidase được kích hoạt cho PPO. Các diphenols bị oxy hóa để tạo các quion tương ứng. Quinon hình thành phản ứng với các nhóm phân tử protein liền kề liên kết chúng lại với nhau tạo một màng cứng, giúp bảo vệ cơ thể trước những tác động xấu từ bên ngoài. PPO trong động vật giáp xác phân bố chủ yếu trong các mai, tiếp theo là bộ xương ngoài bụng, đầu ngực,… PPO có liên quan đến sự hình thành đốm đen của động vật giáp xác sau khi chết. Hình thành đốm đen là một trong những các vấn đề quan trọng của động vật giáp xác, nó 19 Enzyme làm sẫm màu trong thực phẩm làm giảm đáng kể thị hiếu của người tiêu dùng và chất lượng sản phẩm. Cường độ hắc tố hình thành trong động vật giáp sát thay đổi theo loài, do sự khác biệt của chất nền và nồng độ enzyme. Do đó, cần có một sự hiểu biết rõ ràng đặc tính sinh hóa và động học của PPO là cần thiết để kiểm soát và hạn chế hoạt động của nó. Chương 4: Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sẫm màu của enzyme Phản ứng sẫm màu do enzyme xúc tác là phản ứng rất thường xảy ra trong quá trình chế biến các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc thực vật như rau quả các sản phẩm đồ hộp rau quả, các sản phẩm chè thuốc lá... Có nhiều yếu tố ảnh hương đến phản ứng này như các nhân tố sau :  Nồng độ cơ chất phenol  Hàm lượng và trạng thái của polyphenoloxydase  Nồng độ oxy  Nồng độ quinon  pH  Nhiệt độ  … 3.1 Nhiệt độ - Tỷ lệ phản ứng của các enzyme polyphenoloxydase được kiểm soát bơi nhiệt độ - Khi nhiệt độ tăng, tăng năng lượng động học ( tần số va chạm phát triển) tần số phức hợp enzyme - cơ chất phát triển trên một đơn vị thời gian do đó tốc độ phản ứng tăng  quá trình sẫm màu của enzyme diễn ra nhanh hơn. - Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 100 0C sẽ làm bất hoạt enzyme polyphenoloxydas  hạn chế quá trình làm sẫm màu của enzyme. - Ví dụ ơ quả vải: Hoạt động polyphenoloxidase cao nhất ơ 20 º C, và giảm liên tục khi nhiệt độ tăng cao cho đến khi ngừng hoạt động hoàn toàn ơ 20