Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y dirinaria applanata (fée) d. d. awasthi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA ­­­­­­­­­­ LÂM VĨNH PHÚ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA ­­­­­­­­­­ LÂM VĨNH PHÚ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN Cần Thơ, 2014 Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN  Trong suốt những năm đại học, em vô cùng biết ơn quý Thầy, Cô trường Đại học Cần Thơ nói chung và Khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức nghề nghiệp, nền tảng cuộc sống vô giá, là hành trang để em vững bước trên con đường tương lai. Học kỳ cuối, em thực sự đã tiếp thu được thêm những kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn vô cùng bổ ích từ những khó khăn vấp phải trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, những vấn đề này bổ sung và củng cố cho lý thuyết em đã được học một cách trọn vẹn nhất. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Trọng Tuân đã tin tưởng giao đề tài cho em, cùng ThS. Nguyễn Thế Duy không ngại khó khăn, bỏ thời gian và công sức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ khi bắt đầu đến khi hoàn thiện luận văn. Nhờ sự chỉ bảo và những kinh nghiệm học hỏi từ các Thầy, em đã hoàn thành luận văn của mình. Em cũng xin cảm ơn những người bạn ở lớp Hóa Dược K37 đã đồng hành và trải qua nhiều khó khăn cùng em trong suốt quãng đời sinh viên, các anh, chị và các bạn cùng thực hiện luận văn ở phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1 đã hỗ trợ, giúp đỡ và mang lại nhiều niềm vui trong suốt thời gian cùng thực hiện luận văn. Cuối cùng, không thể dùng từ ngữ nào để thể hiện lòng biết ơn vô bờ của con đối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nấng, tạo mọi điều kiện tốt nhất để con được học hành đến nơi đến chốn, tiếp cận tri thức khoa học, trở thành người có ích cho xã hội. Cảm ơn cha mẹ đã luôn bên con, là chỗ dựa cho con về mọi mặt để con bước tiếp đến tương lai tốt đẹp. Xin chân thành cảm ơn! i Luận văn tốt nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc Bộ Môn Hóa Học ­­­­­­­­­­­­ NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân. 2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”. 3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú MSSV: 2112069 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37. 4. Nội dung nhận xét: a) Nhận xét về hình thức của LVTN: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài: .............................................................................................................................. ..............................................................................................................................  Những vấn đề còn hạn chế: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có): .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. d) Kết luận, đề nghị và điểm: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Cán bộ hướng dẫn TS. Nguyễn Trọng Tuân ii Luận văn tốt nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc Bộ Môn Hóa Học ­­­­­­­­­­­­ NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1. Cán bộ phản biện: …………………………………………………………… 2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”. 3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú MSSV: 2112069 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 4. Nội dung nhận xét: a) Nhận xét về hình thức của LVTN: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài: .............................................................................................................................. ..............................................................................................................................  Những vấn đề còn hạn chế: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có): .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. d) Kết luận, đề nghị và điểm: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cán bộ phản biện iii Luận văn tốt nghiệp TÓM TẮT Luận văn này được thực hiện với mục đích khảo sát thành phần hóa học trong phân đoạn cao chiết petroleum ether từ loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, được thu mẫu ngay ở khuôn viên Đại học Cần Thơ. Tiếp theo là đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao tổng methanol, các phân đoạn cao với độ phân cực khác nhau như cao petroleum ether, cao ethyl acetate và cao nước cùng các chất tinh khiết phân lập được từ loài địa y này. Từ phân đoạn cao petroleum ether đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết là methyl haematommate (HP1). Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như 1H­NMR, 13C­NMR, DEPT, HMBC và đối chiếu với các tài liệu đã công bố. Hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao chiết từ địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi được đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH (2,2­diphenyl­1­picrylhydrazyl) qua giá trị IC50. Từ khóa: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methyl haematommate, DPPH, IC50. iv Luận văn tốt nghiệp ABSTRACT The aim of this thesis is to investigate chemical composition of petroleum ether extract of the lichen Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, which is collected in Can Tho University’s campus. Next, evaluate antioxidant ability of methanol total extract; three different polarity extracts: petroleum ether extract, ethyl acetate extract, water extract and pure compounds were isolated from this lichen. From petroleum ether extract, one pure compound were isolated: methyl haematommate (HP1). Its structures were determined by modern spectroscopic method: 1H­NMR, 13C­NMR, DEPT, HMBC, which were compared with some of previously published data. Antioxidant activitity of extracts of the lichen Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi were evaluated by DPPH free radical method (2,2­diphenyl­1­ picrylhydrazyl) through IC50 value. Keywords: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methyl haematommate, DPPH, IC50. v Luận văn tốt nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc Bộ Môn Hóa Học ­­­­­­­­­­­­ ĐỀ TÀI KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi, các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác và đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến và góp ý của các Thầy, Cô phản biện và hội đồng chấm bảo vệ luận văn. Cần Thơ, ngày …. tháng .… năm …….. Lâm Vĩnh Phú Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Cử Nhân Hóa Dược Đã bảo vệ và được duyệt Hiệu trưởng………………………………..... Trưởng khoa……………………………….... Trưởng chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn ……………………... TS. Nguyễn Trọng Tuân vi Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC Lời cảm ơn ……………………………………………………………………..i Nhận xét đánh giá của cán bộ hướng dẫn ……………………………………..ii Nhận xét đánh giá của cán bộ phản biện ……………………………………..iii Tóm tắt ……………………………………………………………………….iv Abstract ………………………………………………………………………..v Trang cam kết kết quả ………………………………………………………..vi Mục lục ………………………………………………………………………vii Danh sách bảng ……………………………………………………………….ix Danh sách hình ……………………………………………………………….x Danh mục từ viết tắt ..………………………………………………………..xi Chương 1: Giới thiệu ………………………………………………………..1 1.1 Đặt vấn đề ………………………………………………………………1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………………2 1.3 Nội dung nghiên cứu …..……………………………………………….2 Chương 2: Tổng quan tài liệu ………………………………………………3 2.1 Tổng quan về địa y .……………………………………………………3 2.1.1 Tên gọi ……………………………………………………………3 2.1.2 Đặc điểm sinh học …………………………………………………3 2.1.3 Công dụng …………………………………………………………4 2.1.4 Thành phần hóa học ………………………………………………5 2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi …………8 2.2.1 Tên gọi …………………………………………………………….9 2.2.2 Phân loại thực vật học …………………………………………….9 2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật ……………………………………….9 2.2.4 Phân bố …………………………………………………………..10 2.2.5 Thành phần hóa học ……………………………………………10 2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm ……………….10 2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn ­ lỏng) ………………………10 2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng ­ lỏng ……………………………………….. 11 2.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở) ………………………….11 2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột ………………………………11 2.3.3.2 Nạp mẫu chất cần phân tích vào cột ………………………...12 2.3.3.3 Chọn dung môi và giải ly cột ………………………………..12 2.3.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột ……………………………….13 2.3.4 Sắc ký lớp mỏng …………………………………………………13 2.3.4.1 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng ………………………………14 vii Luận văn tốt nghiệp 2.3.4.2 Cách hiện hình vết sau khi giải ly bản mỏng ………………..15 2.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thử nghiệm sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………16 2.3.5.1 Giới thiệu về gốc tự do ……………………………………..16 2.3.5.2 Giới thiệu về gốc tự do DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm16 2.3.5.3 Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH ……………………….16 Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ……………………………………..18 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện …………………………………...18 3.1.1 Địa điểm và thời gian …………………………………………….18 3.1.2 Dụng cụ ………………………………………………………….18 3.1.3 Hóa chất …………………………………………………………18 3.2 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………..18 3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên từ thực vật ...…………18 3.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết ……18 3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được ………………………………………………………….19 3.3 Thực nghiệm điều chế các loại cao ...…………………………………19 3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu địa y……………………………………….. 19 3.3.2 Điều chế cao methanol tổng ……………………………………..19 3.3.3 Điều chế cao petroleum ether ……………………………………19 3.3.4 Điều chế cao ethyl acetate ……………………………………….20 3.3.5 Điều chế cao nước ……………………………………………….20 3.4 Khảo sát và phân tích cao petroleum ether ……………………………21 3.4.1 Sắc ký cột cao petroleum ether …………………………………..21 3.4.2 Khảo sát phân đoạn III …………………………………………...22 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y cùng hợp chất HP1 bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ……………………….23 3.5.1 Cách tiến hành tổng quát …………………………………………23 3.5.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH ………………………………………23 3.5.3 Mẫu đối chứng dương ascorbic acid (vitamin C) ………………..24 3.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol .………24 3.5.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao nước ...……25 3.5.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc… …………….26 3.5.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1 ……………26 Chương 4: Kết quả vả thảo luận ………………………………………….27 4.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi …………………………………………………………………..27 4.1.1 Biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất HP1 ……………………27 viii Luận văn tốt nghiệp 4.1.1.1 Phân tích phổ 1H­NMR của HP1 ……………………………27 4.1.1.2 Phân tích phổ 13C­NMR và DEPT của HP1 …………….28 4.1.1.3 Phân tích phổ HMBC ………………………………………28 4.1.2 Kết luận ….……………………………………………………….29 4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y và HP1 đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………30 4.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid (vitamin C) ………….30 4.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng …………………………..31 4.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether ……………….32 4.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate …………………..33 4.2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao nước ………………………….34 4.2.6 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1: methyl haematommate ………………………………………………………………35 Chương 5: Kết luận và kiến nghị ………………………………………….36 5.1 Kết luận ………………………………………………………………36 5.2 Kiến nghị ……………………………………………………………..36 Tài liệu tham khảo …………………………………………………………37 Phụ lục ………………………………………………………………………39 Phụ lục 1: Phổ 1H­NMR của hợp chất HP1 ………………………………39 Phụ lục 2: Phổ DEPT của hợp chất HP1 ...……………………………….40 Phụ lục 3: Phổ 13C­NMR của hợp chất HP1 ………………………………41 Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất HP1 ...………………………………42 ix Luận văn tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình trong sắc ký lớp mỏng ………………14 Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả sắc ký cột cao petroleum ether…………………22 Bảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid… 24 Bảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng………25 Bảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao nước …………………………………………………………………………25 Bảng 3.5: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc …...26 Bảng 3.6: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của HP1 .………….26 Bảng 4.1: Số liệu phổ 1H­NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C­NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất HP1 ……………………………………………………..29 Bảng 4.2: So sánh số liệu phổ 1H­NMR và 13C­NMR của hợp chất HP1 và methyl haematommate trong tài liệu [17] ……………………………………30 Bảng 4.3: Phần trăm ức chế của ascorbic acid theo nồng độ trong từng mẫu thử …………………………………………………………………………...30 Bảng 4.4: Phần trăm ức chế của cao tổng theo nồng độ trong từng mẫu thử...31 Bảng 4.5: Phần trăm ức chế của cao PE theo nồng độ trong từng mẫu thử ….32 Bảng 4.6: Phần trăm ức chế của cao EtOAc theo nồng độ trong từng mẫu thử ……………………………………………………………………………33 Bảng 4.7: Phần trăm ức chế của cao nước theo nồng độ trong từng mẫu thử ..34 Bảng 4.8: Phần trăm ức chế của hợp chất HP1 theo nồng độ trong từng mẫu thử ……………………………………………………………………………35 x Luận văn tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y …………………………………..3 Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi ……………………8 Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi……………9 Hình 2.4: Minh họa cách tính Rf …………………………………………….14 Hình 2.5: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH ..……………………………16 Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao chiết ……………………………..20 Hình 3.2: SKLM cao petroleum ether ………………………………………21 Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP1 …………………………………….23 Hình 4.1: Tinh thể hợp chất tinh khiết HP1 …………………………………27 Hình 4.2: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ ascorbic acid …………………………………………………………………31 Hình 4.3: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao tổng ……………………………………………………………………..32 Hình 4.4: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao PE ……………………………………………………………………….32 Hình 4.5: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao EtOAc ..…………………………………………………………………33 Hình 4.6: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao nước ……………………………………………………………………..34 Hình 4.7: Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ HP1 ………………………………………………………………………….35 xi Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 13 C­NMR H­NMR DEPT HMBC Rf DPPH IC50 SKLM PE EtOAc Dd s C 1 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Proton Nuclear Magnetic Resonance Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Heteronuclear Multiple­Bond Correlation Retention factor 1,1­diphenyl­2­picrylhydrazyl Half maximal Inhibitory Concentration Sắc ký lớp mỏng Petroleum ether Ethyl acetate Dung dịch Singlet Carbon xii Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, trên thế giới xuất hiện nhiều loại bệnh mới và nguy hiểm chưa tìm được thuốc đặc trị như HIV, ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch... với số bệnh nhân ngày càng gia tăng đã thôi thúc các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm, tổng hợp các loại thuốc mới trị liệu tốt hơn. Tuy nhiên, thuốc tổng hợp ít nhiều đều gây nên những tác dụng phụ không mong muốn, do vậy, những năm gần đây xu hướng sử dụng các hợp chất tự nhiên (dạng thô, cao chiết hay hợp chất chiết xuất tinh khiết) có hoạt tính sinh học cao để điều trị bệnh được các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu và đã mang lại nhiều thành quả. Điển hình như curcumin (từ nghệ), taxol (từ thông đỏ), viblastin, vincristin (từ cây dừa cạn) trị ung thư; quinin (từ cây canhkina) và artemisinin (từ cây thanh hao hoa vàng) điều trị sốt rét... Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thiên nhiên đa dạng, nguồn động thực vật phong phú dồi dào, vì vậy mà từ ngàn xưa nhân dân đã biết sử dụng các phương thuốc từ thực vật để chữa nhiều bệnh như sốt, tiêu chảy, đau nhức, cảm ho... Đây là một lợi thế lớn để nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên, tìm ra các loại dược liệu mới, trong đó địa y là loài thực vật có tiềm năng. Đặc biệt, nước ta có nguồn địa y phong phú và dồi dào với 275 loài, trong đó có 122 loài lần đầu tiên được báo cáo ở Việt Nam [1] . Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm, có thể sống ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô hạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu tốt. Các công trình khảo sát thành phần hóa học của địa y trên thế giới cho thấy nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cấp (protein, amino acid, polyol, carotenoid, polysaccharide và vitamin) và thứ cấp (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid, terpene…, trong đó một số chất đặc thù chỉ có ở địa y) [2, 3] . Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ địa y cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung thư, kháng virus HIV... [3, 4]. Đã có rất nhiều nghiên cứu về mặt hóa học, chuyển hóa và hoạt tính sinh học của địa y trên thế giới bắt đầu từ thế kỉ XIX. Trong khi đó, ở nước ta với sự đa dạng về chủng loài nhưng mới chỉ có những nghiên cứu về mặt thực vật học cùng rất ít nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của địa y. Vì 1 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU vậy, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” được chọn là cần thiết và có ý nghĩa nhằm góp phần tìm hiểu thành phần hóa học, phát hiện các hoạt tính sinh học đáng quý của địa y và đưa địa y vào sử dụng như một dược liệu trong việc chữa bệnh. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trong phạm vi đề tài luận văn “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” gồm các mục tiêu sau: ­ Tách chiết, phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao petroleum ether của loài địa y này. ­ Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được. ­ Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh khiết phân lập được bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH. 1.3 Nội dung nghiên cứu ­ Tìm hiểu, thu thập tài liệu về địa y nói chung và về loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi. ­ Thu mẫu địa y tươi, phơi khô, nghiền thành bột mịn. ­ Tiến hành chiết kiệt bột địa y với methanol thu cao tổng. ­ Tiến hành chiết lỏng­lỏng cao tổng với từng loại dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ether, ethyl acetate để thu được các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau. ­ Sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng để khảo sát, phân lập hợp chất tinh khiết từ cao petroleum ether. ­ Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. ­ Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao và các chất tinh khiết bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH. ­ Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo. 2 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về địa y 2.1.1 Tên gọi Tên khoa học: Lichene. Tên tiếng Việt: Địa y. Tên tiếng Anh: Lichen. 2.1.2 Đặc điểm sinh học Địa y là nhóm thực vật bậc thấp hình thành do sự cộng sinh giữa hai thành phần là nấm và một hay nhiều loài sinh vật có khả năng quang hợp, thường là tảo lục hoặc khuẩn lam. Thành phần quang hợp là tảo tạo ra chất hữu cơ cho chính nó và cho nấm, còn nấm có nhiệm vụ bảo vệ tảo khỏi các tác nhân vật lý có hại và cung cấp muối khoáng, nước từ môi trường cho tảo. Nhờ sự cộng sinh này, địa y có thể thích ứng ở nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt như núi cao, vùng băng giá hay nhiệt đới và sống trên nhiều thể nền khác nhau như đất, đá, lá cây, vỏ cây, kim loại… Địa y được phân chia thành ba dạng hình thái phát triển: dạng khảm (crustose) dính chặt vào giá thể, dạng phiến (foliose) với nhiều thùy như lá cây và dạng sợi (fruticose) nhiều sợi như bụi cây [5] . Địa y dạng khảm Địa y dạng phiến Địa y dạng sợi Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y. Địa y sinh trưởng chậm và sống lâu năm. Phần lớn các loài địa y vùng ôn đới, cận nhiệt và nhiệt đới tăng trưởng vài milimét tới vài centimét trong một năm và phát triển mạnh nhất ở vùng khí hậu ẩm ven biển và rừng mưa Bắc Mỹ. Ở vùng rất lạnh và rất nóng, địa y phải mất hàng thế kỷ để đạt được kích thước lớn. Địa y rất nhạy cảm với sự ô nhiễm không khí như chất oxy hóa, SO2, HF…, đã xảy ra hiện tượng địa y biến mất ở các đô thị lớn; vì vậy mà nó 3 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU phản ánh một phần mức độ ô nhiễm không khí. Nguyên nhân là do nguồn dinh dưỡng của địa y chủ yếu từ môi trường xung quanh, chẳng hạn như nguồn nước của địa y là từ sương có thể mang theo nhiều chất ô nhiễm và địa y không thể thải độc qua quá trình rụng lá như các loài thực vật bậc cao cũng như không có lớp biểu bì nên các chất ô nhiễm có thể xâm nhập vào địa y [6] . Mỗi loài địa y có màu sắc đặc trưng nhưng cũng khó phân biệt giữa một số loài địa y với nhau: cam, vàng chanh tới lục nhạt, xanh vàng nhạt, xám trắng, xám xanh, xám đen, nâu, đen… Màu sắc cũng là một yếu tố để nhận dạng loài địa y [7] . 2.1.3 Công dụng Trên thế giới, địa y đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, là dược liệu trong các bài thuốc dân gian, nguyên liệu làm thuốc nhuộm và nước hoa. Về mặt dược liệu, Cetraria islandica (rêu Island) dùng trị bệnh phổi và viêm chảy, thuốc từ nó vẫn còn được bán ở châu Âu. Peltigera canina dùng để ăn ở Ấn Độ là phương thuốc trị bệnh gan và chứa hàm lượng cao amino acid methionine là tiềm năng cho việc trị bệnh. Về công nghiệp sản xuất nước hoa, đây là một ứng dụng quan trọng của địa y: Evernia prunastri (rêu oak) và Pseudevernia furfuracea (rêu cây) được sử dụng ở Pháp với lượng 8000 ­ 10000 tấn mỗi năm. Về công nghiệp nhuộm, ngày nay địa y ít được sử dụng, chỉ còn Parmelia omphalodes được dùng ở Scotland [8] . Một số hợp chất từ địa y đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học như [3] : ­ Kháng sinh: depsides, depsidones và usnic acid chống lại vi khuẩn gam dương. ­ Kháng ung thư và kháng đột biến gen: (–)­usnic acid, protolichesterinic và nephrosteranic acid, polyporic và dẫn xuất, physodalic acid, các glucan và các dẫn xuất lichenin. ­ Kháng HIV: hợp chất muối sulfate của acetyl glucan từ loài địa y Umbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink. ngăn chặn sự phá hoại tế bào của virus HIV trong ống nghiệm. ­ Ngoài ra, một số hợp chất còn có tác dụng trợ tim (pulvinic acid dilactone), giảm đau và hạ sốt (usnic và diffractaic acid), gây dị ứng (atranorin, barbatic, diffractaic…), ức chế enzyme (lecanoric acid, (­)­usnic acid…) và ức chế sự phát triển của thực vật (psoromic acid, virensic acid, (­)­ usnic acid…). 4 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.4 Thành phần hóa học Địa y là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học quan trọng, nó đã thu hút các nhà hóa học ngay từ giai đoạn đầu của hóa học hữu cơ. Các khía cạnh hóa học của hợp chất từ địa y đã được công bố bởi Zopf vào đầu thế kỷ XIX và cấu trúc của hầu hết các hợp chất này đã được biết đến bởi nghiên cứu của Asahina và Shibata vào đầu thế kỷ XX. Gần đây, hơn 800 hợp chất từ địa y được phân lập và chia thành nhóm: aliphatic acid, γ­, δ­ và macrocyclic lactone, hợp chất thơm đơn vòng, quinone, chromone, xanthone, dibenzofuran, depside, depsidone, depsone, terpenoid, steroid, carotenoid và diphenyl ether. Trong đó, depside, depsidone và dibenzofuran chỉ có ở địa y [9 ] . Các chất chuyển hóa thứ cấp hiện diện với lượng lớn trong địa y và thường dựa vào chúng để phân loại, do địa y khó phân biệt về mặt hình thái học [3]. Một số nhóm hợp chất chính trong địa y: 2.1.4.1 Acid béo Ngoài các acid béo thường thấy trong thực vật như caproic acid, caprylic acid, linoleic acid… địa y còn tích lũy các acid béo với mạch nhánh có 17, 19 hoặc 20 carbon. Các acid béo không bão hòa như arachidonic acid cũng hiện diện trong địa y. Các monobasic acid đều khởi nguồn từ protolichesterinic acid (1), một α­methylene butyrolactone. Protolichesterinic acid không bền, dễ dàng sắp xếp lại tạo thành dạng tautomeric, gọi là lichesterinic acid (2) [10] . HOOC O O O O 1 HOOC 2 2.1.4.2 Dẫn xuất pulvinic acid Nhiều địa y chứa sắc tố vàng hoặc da cam cấu tạo bởi hai đơn vị phenylpropane, mà các đơn vị C3 của những acid từ địa y này là isopropyl hơn là propyl. Vulpinic acid (4), một methyl ester của pulvinic acid (3) cho thấy tác dụng kháng khuẩn chống lại sinh vật hiếu khí và kị khí [10] . CO 2R OH 3R=H 4 R = Me O O 5 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ngoài ra còn có calycin (5), pulvinamide (6),… [11]. O O O OH O O OH O O 5 NH2 6 2.1.4.3 Dẫn xuất hydroxybenzoic acid Ester của 4­hydroxybenzoic acid như methylparaben (7) được dùng làm chất bảo quản trong dược phẩm, nhanh chóng bị thủy phân trong cơ thể thành acid và bị đào thải nên độc tính thấp. Do đó, các hợp chất đơn vòng phenol từ địa y như methyl orsellinate (8), methyl β­orsellinate (9) và methyl hematommate (10) thể hiện hoạt tính kháng sinh [10] . OH CO2Me OH HO 7 OH OH CO2Me Me CO 2Me Me HO Me 8 OHC CO2Me HO 9 Me 10 2.1.4.4 Depside Depside là nhóm hợp chất tạo thành do sự ngưng tụ của hai hoặc nhiều hydroxybenzoic acid, trong đó nhóm carboxyl của phân tử thứ nhất ester hóa với nhóm hydroxyl phenol của phân tử thứ hai. Có hai loại depside, loại chứa nhóm chức orcinol như orsellinic acid (11), confluentic acid (12)… và loại chứa nhóm chức β­orcinol như atranorin (13), diffractaic acid (14)… [10]. Me Me OH CO2H O COOH O HO OH OMe MeO 11 Me O 12 Me Me OH OHC HO CO2Me O O Me CO 2H OMe O Me OH Me MeO O Me 14 13 6 OH Me