Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ Y TẾ
-----------------
TRẦN THỊ KHUÊ NỮ
SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH
CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT
SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ Y TẾ
-----------------
TRẦN THỊ KHUÊ NỮ
SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH
CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT
SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE
Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số : 8720601
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN THẮNG
PGS.TS. TRẦN ANH TUẤN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các tài liệu trích dẫn, số liệu, kết quả nêu trong luận văn là
hoàn toàn trung thực, được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 05 năm
2018 đến tháng 06 năm 2019 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn
Văn Thắng và PGS.TS. Trần Anh Tuấn. Đề tài nghiên cứu này là duy nhất và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào.
Tác giả luận văn
Trần Thị Khuê Nữ
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH ................................................... i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... iii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................... iv
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học ............................... 4
1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mô học ........................................................ 4
1.3. Hóa chất thay thế clear-rite 3 ................................................................. 29
1.4. Dung dịch có thành phần LAS nồng độ 1,7% ........................................ 32
1.5. Các nghiên cứu ngoài nước ................................................................... 33
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 50
3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ............................................................. 50
3.2. Chất lượng nhuộm nhân và tế bào chất của 2 phương pháp nhuộm ....... 54
3.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của 2 phương pháp nhuộm HE ....... 55
3.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 62
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 68
4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ...................................................... 68
4.2. Chất lượng nhuộm nhân và nhuộm tế bào chất ...................................... 68
4.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm HE .......... 72
4.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 77
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
KẾT LUẬN ................................................................................................. 82
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
i
ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH
TIẾNG VIỆT
TIẾNG ANH
Bảng dữ liệu an toàn hóa chất
Material Safety Data Sheet
Chất liệu di truyền
Deoxyribonucleic Axit
Cơ quan Quản lý An toàn và
Occupational Safety and
Sức khỏe Nghề nghiệp
Health Administration
Dung dịch rửa chén (bát)
Dish washing liquid
Điểm số nhuộm nhân
The parameter of nuclear stain
Độ đồng nhất
Uniformity of stainning
Độ trong rõ
Clarity of stainning
Độ tương phản, sắc nét
Crispness of stainning
Hệ thống hài hoà toàn cầu về
Globally Harmonized System of
phân loại và ghi nhãn hoá chất
Classification and Labeling of Chemicals
Khối mô đúc parafin
Block
Nhuộm tế bào chất
Cytoplasmaic stainning
Thông tin di truyền
Ribonucleic Axit
Tế bào hình đài
Goblet cell
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TÊN VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ
BV
Bệnh viện
DNA
Deoxyribonucleic Axit
GHS
Hệ thống hài hoà toàn cầu về phân loại và ghi nhãn
hóa chất
GPB
Giải phẫu bệnh
HE
Heamatoxylin-Eosin
LAS
Chất hoạt động bề mặt
Sodium Linear Alkybenzene Sulfonate
MSDS
Bảng dữ liệu an toàn hóa chất
OSHA
Cơ quan Quản lý An toàn và Sức khỏe Nghề nghiệp
RNA
Ribonucleic Axit
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Quy trình nhuộm HE với dung dịch Toluen/ Xylen ...................... 14
Bảng 1.2: Phân tích kết quả nhuộm HE ........................................................ 23
Bảng 1.3: Màu sắc các thành phần tế bào của nhuộm HE ............................. 24
Bảng 1.4: Những lỗi thường gặp trong phương pháp nhuộm HE .................. 28
Bảng 1.5: Tóm tắt cỡ mẫu nghiên cứu nhuộm HE với LAS .......................... 36
Bảng 2.1: Quy trình nhuộm HE thường quy ................................................. 43
Bảng 2.2: Quy trình nhuộm HE cải tiến........................................................ 44
Bảng 2.3: Hóa chất sử dụng cho phương pháp nhuộm HE cải tiến ............... 49
Bảng 3.1: Thời gian cố định (giờ)................................................................. 52
Bảng 3.2: Độ trong rõ ở tiêu bản của 2 phương pháp nhuộm ........................ 55
Bảng 3.3: Tỉ lệ độ đồng nhất ........................................................................ 56
Bảng 3.4: Điểm số của tiêu bản ở 2 phương pháp nhuộm ............................. 62
Bảng 3.5: Thời gian nhuộm .......................................................................... 64
Bảng 3.6: Cơ cấu giá tiêu bản ....................................................................... 64
Bảng 3.7: So sánh ưu và khuyết điểm của clear-rite 3 và LAS 1,7% ............ 65
Bảng 3.8: So sánh hiệu quả của nhuộm HE thường quy và HE cải tiến ........ 66
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
iv
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1: So sánh kết quả nhuộm HE với xylen và HE LAS 1,7%........... 35
Biểu đồ 3.1: Phân bố người bệnh theo tuổi ................................................... 50
Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ loại bệnh phẩm ................................................................. 51
Biểu đồ 3.3: Bệnh phẩm cố định .................................................................. 52
Biểu đồ 3.4: Bệnh phẩm xử lý ...................................................................... 53
Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ tiêu bản tẩy parafin........................................................... 53
Biểu đồ 3.6: Tỉ lệ nhuộm nhân ..................................................................... 54
Biểu đồ 3.7: Tỉ lệ nhuộm tế bào chất ............................................................ 54
Biểu đồ 3.8: Tỉ lệ độ tương phản .................................................................. 55
Biểu đồ 3.9: Tổng hợp các tỉ lệ nhuộm ......................................................... 56
Biểu đồ 3.10: Tỉ lệ tiêu bản nhuộm HE thường quy và HE cải tiến .............. 63
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
v
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu ................................................... 40
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Ký hiệu tượng hình của dung dịch xylen ...................................... 16
Hình 1.2: Sự oxid của Hematoxylin ............................................................. 18
Hình 1.3: Cấu trúc Eosin .............................................................................. 22
Hình 1.4: Nhuộm Hematoxylin Eosin trên mô gan ....................................... 23
Hình 1.5: Dữ liệu an toàn hóa chất clear-rite 3 ............................................. 31
Hình 3.1: Chất lượng nhuộm nhân trên tiêu bản mô túi mật ......................... 57
Hình 3.2: Nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô túi mật.................................. 57
Hình 3.3: Chất lượng độ trong, rõ trên tiêu bản mô túi mật .......................... 58
Hình 3.4: Chất lượng độ tương phản trên tiêu bản mô túi mật ...................... 58
Hình 3.5: Chất lượng đồng nhất trên tiêu bản mô túi mật ............................. 59
Hình 3.6: Không đạt nhuộm nhân trên tiêu bản mô ruột ............................... 60
Hình 3.7: Không đạt nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô tuyến tiền liệt ....... 60
Hình 3.8: Tiêu bản không đạt độ trong rõ ..................................................... 60
Hình 3.9: Tiêu bản không đạt độ tương phản ................................................ 61
Hình 3.10: Không đạt độ đồng nhất trên tiêu bản mô thận ............................ 61
Hình 3.11: Tiêu bản không đủ tiêu chuẩn chẩn đoán ..... .............................. 61
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) là một phương pháp nhuộm thường quy
trong xét nghiệm mô bệnh học, được sử dụng rộng rãi nhất và là tiêu chuẩn
trong chẩn đoán mô bệnh học [27], [29]. Để chẩn đoán được mô bệnh, các bệnh
phẩm sau khi được cắt lọc/ phẫu tích thành những mảnh mô có kích thước phù
hợp, mô được xử lý qua các bước như: khử nước (được máy xử lý mô tự động
thực hiện), đúc (vùi) mô, cắt lát mảnh 3-4µ𝑚, nhuộm và cuối cùng được bác sĩ
giải phẫu bệnh (GPB) - tế bào bệnh học dịch (đọc) tổn thương [2]. Để quan sát
được thành phần cấu trúc của mô, các mảnh cắt phải được nhuộm màu tương
phản của cấu trúc nhân và thành phần tế bào chất. Trên tiêu bản nhuộm, bác sĩ
GPB có thể quan sát cấu trúc màng nhân, hạt nhân, chất nhiễm sắc cũng như
sự bắt màu của thành phần tế bào chất, chất nền: sợi colagen, hồng cầu, sợi
chun. Trong phương pháp nhuộm HE phải đi qua nhiều bước như: tẩy parafin,
khử nước, nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất. Trong đó, bước dùng hóa chất xylen
hay toluen để tẩy parafin trong mô là quan trọng, quyết định nhiều đến chất
lượng nhuộm tiêu bản. Tuy nhiên xylen, toluen độc hại đối với con người và
môi trường [3], [22], [37], [47]. Một số hóa chất thay thế xylen được sản xuất.
Các chất thay thế có thể là hóa chất hydrocacbon béo, hydrocacbon thơm, dầu
dừa, ... Các hóa chất đó có chức năng tương tự như toluen, xylen: làm trong
sáng mô, tẩy parafin trong phương pháp nhuộm HE. Hiện nay các phòng xét
nghiệm GPB đang sử dụng hóa chất clear-rite 3 [49] để thay thế hóa chất toluen,
xylen. Các bệnh viện (BV) như: BV Chợ Rẫy, BV Nhân dân Gia Định, Đại học
Y Dược, BV Bình Dân, BV Nhi Đồng I, BV Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh,
BV Ung Bướu Cần Thơ, BV Vimec. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm thay
xylen, toluen có giá thành cao và không phải là ít nguy hiểm hơn [12], [38].
Theo phân loại của cơ quan Quản lý An toàn và Sức khỏe Nghề nghiệp
.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
2
(Occupational Safety and Health Administration - OSHA) [22], thành phần hóa
chất clear-rite 3 được phân loại lớp 1B nguy cơ gây ung thư, hóa chất dễ cháy
loại 2 [43], [49], cũng có ảnh hưởng đến cơ quan đích là gan và thận khi tiếp
xúc hóa chất lâu dài hoặc thường xuyên, nguy cơ đột biến tế bào mầm và nguy
cơ gây ung thư, có nguy hiểm về đường hô hấp và có thể gây tổn thương các
cơ quan do phơi nhiễm kéo dài hoặc tiếp xúc thường xuyên.
Các nghiên cứu dùng nước chanh của tác giả Ananthaneni Anuradha và cộng
sự [8] hay dùng dầu bách hương/ tuyết tùng để thay thế xylen trong phương
pháp nhuộm HE [24], tuy nhiên giá thành cao.
Một số tác giả sử dụng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% để
thay thế dung dịch toluen, xylen, có thể xem là thân thiện với môi trường hơn.
Falkeholm và cộng sự [18], lần đầu tiên đã nghiên cứu dung dịch có chứa thành
phần LAS 1,7 % để thay thế dung dịch xylen và alcool trong quy trình nhuộm
HE, với chi phí rẻ tiền và ít độc hại hơn. Nghiên cứu của Madhuri R Ankle và
cộng sự [9], cũng dùng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% tẩy
parafin, khử nước và làm trong mô, nghiên cứu cho thấy kết quả dùng dung
dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% ngang bằng với dung dịch xylen
và alcool trong giai đoạn tẩy parafin. Ngoài ra một số tác giả sử dụng dung dịch
có chứa thành phần LAS dao động từ 1,5%-2,0% [8], [42].
Vì hóa chất clear-rite 3 ảnh hưởng đến sức khỏe khi tiếp xúc thường xuyên.
Với mong muốn môi trường phòng xét nghiệm GPB an toàn ít độc hại hơn.
Chúng tôi tiến hành nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE với dung
dịch chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS)
- dung dịch tẩy rửa thông thường, thay thế hóa chất clear-rite 3 hiện đang sử
dụng. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch chất tẩy rửa sunlight pha
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
3
loãng 1,7%, do hãng Unilever sản xuất (dựa vào hầu hết các NC trước đây sử
dụng nồng độ 1,7%) nhằm:
MỤC TIÊU
1. So sánh chất lượng nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất của phương pháp
nhuộm HE với hóa chất clear-rite 3 và alcool (HE thường quy) và phương pháp
nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% (HE cải tiến).
2. So sánh độ trong rõ, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm
HE thường quy và phương pháp nhuộm HE cải tiến.
3. So sánh hiệu quả của phương pháp nhuộm HE thường quy và phương pháp
nhuộm HE cải tiến.
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học
Kỹ thuật khám nghiệm đại thể giúp cho chúng ta quan sát một cách có hệ
thống toàn diện các phủ tạng hoặc mối liên quan giữa chúng với nhau cũng như
mối liên quan của các tổ chức trong cùng một phủ tạng, hoặc chức phận của
chúng một cách khái quát, nhưng các kỹ thuật nghiên cứu tế bào và tổ chức
phát hiện cho chúng ta những cấu trúc tinh tế nhất không những ở phạm vi tế
bào mà còn đi sâu tới những tiểu phần của tế bào [2].
Do hầu hết các tổ chức và phủ tạng đều quá dày nên không thể soi trực tiếp
dưới kính hiển vi, nên các nhà tổ chức học đầu tiên đã quan sát những màng
mỏng hoặc các vật liệu đã bị tước hoặc ép. Do đó, các sự liên quan cấu trúc đã
bị phá vỡ và tế bào chết rất nhanh chóng đưa đến những nhận định sai lệch,
không chính xác [2].
Cuối của thế kỷ XIX, không những người ta đã tìm hiểu về các tế bào sống
hoặc sống sót mà còn chú ý đến những tế bào chết được bảo quản theo nhiều
cách cắt mỏng rồi nhuộm với nhiều loại phẩm nhuộm. Kính hiển vi được cải
tiến, máy cắt mỏng ra đời, hàng loạt các kỹ thuật cố định ra đời và nhuộm sáng
tạo [2] với mục đích biểu hiện hình ảnh cấu trúc và làm tăng độ tương phản cấu
trúc, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi như kỹ thuật nhuộm HE, kỹ thuật
nhuộm papanicolaou (PAP), kỹ thuật nhuộm Pariodic axit schiff (PAS), được
dùng trong chẩn đoán GPB.
1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mô học
1.2.1. Cố định
Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như tế bào nhưng
vẫn tôn trọng mức tối đa hình thái của chúng. Nói cách khác, cố định một tổ
chức là giết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
5
một tình trạng gần với lúc sống nhất [2]. Cố định mô bệnh phẩm thích hợp để
xét nghiệm là trung tâm của tất cả các xét nghiệm mô học [13], [17].
1.2.1.1. Dung dịch cố định
Việc dùng dung dịch cố định mô bệnh phẩm phù hợp để xét nghiệm mô học
là vô cùng quan trọng, là trọng tâm của tất cả các xét nghiệm mô học, một số
dung dịch cố định đóng vai trò là chất gắn màu cho các quá trình nhuộm màu
cụ thể [14], [15]. Ngược lại, chất cố định đôi khi ức chế một số kỹ thuật nhuộm.
Vì cố định là bước đầu tiên trong kỹ thuật mô học, kỹ thuật nhuộm được thực
hiện sau khi cố định và những kỹ thuật tiếp theo, nên cần phải dùng dung dịch
cố định phù hợp [34]. Nếu không chú ý đến quá trình này, một loạt các xét
nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm mô bệnh học sẽ không hiệu quả
và thực tế là có thể không thể khắc phục được mô bệnh phẩm [47]. Khi chọn
một dung dịch cố định nên có sự cân bằng giữa những lợi ích và bất lợi mà mỗi
loại dung dịch cố định có. Chúng bao gồm những thay đổi hoặc mất mát phân
tử từ các mô cố định, gây sưng hoặc co rút các mô, sự thay đổi chất lượng của
nhuộm hóa mô miễn dịch, ảnh hưởng đến phân tích sinh hóa và khả năng duy
trì cấu trúc của các bào quan tế bào. Mục tiêu chính của sự cố định các loại mô
là duy trì các đặc điểm hình thái rõ ràng và nhất quán [47]. Để quan sát hình
ảnh vi thể của các tiêu bản nhuộm màu, các mối liên quan vi thể ban đầu giữa
các tế bào, các thành phần tế bào (ví dụ như tế bào chất và nhân), thành phần
ngoại bào phải được duy trì. Thành phần hóa học của mô cũng phải được duy
trì. Nhiều thành phần hóa học trong mô có thể hòa tan trong dung dịch nước
hoặc môi trường chất lỏng khác, do đó các thành phần hòa tan không được mất
trong quá trình cố định và xử lý mô. Giảm thiểu sự mất mát của các thành phần
tế bào bao gồm protein, nhân và lipid, ngăn chặn sự phá hủy các cấu trúc phân
tử như màng tế bào chất, mạng lưới nội chất trơn, mạng lưới nội chất thô, màng
tế bào hạt nhân, màng nhân. Nếu các thành phần hòa tan trong tế bào chất mất,
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
6
nhuộm màu bị giảm hoặc thay đổi các hình ảnh vi thể của mô, ví dụ ty thể bị
mất hoặc bị phá hủy [47].
Trong chẩn đoán GPB, sự lựa chọn dung dịch cố định cho hầu hết các nhà
GPB là dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% [2]. Formaldehyde đệm
trung tính 10% là dung dịch thường được sử dụng nhất vì là chất có sẵn trên thị
trường, chi phí thấp, không cháy nổ, giết vi khuẩn nhanh chóng [4], không kết
tủa protein nhưng cố định hoàn toàn bằng cách làm cho chúng không hoà tan,
cố định các lipid phức tạp kể cả ty lạp thể (mitochondrion) và bộ Golgi, tuy
không tác dụng trực tiếp lên lipid nhưng vẫn bảo toàn được chúng [2]. Không
làm co mô nhưng gây cứng mô. Cấu trúc tế bào bảo toàn tốt. Nhược điểm của
dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% là phản ứng với hematin tạo nên
sắc tố màu nâu hay kết tủa đen. Hơi formaldehyde độc nên cần đậy kín bình [2]
sau mỗi lần sử dụng.
Dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10%, hoạt động hiệu quả, có thể sử
dụng với hầu hết các loại mô, môi trường đệm trung tính giúp ổn định môi
trường không ảnh hưởng đến thành phần cấu trúc của mô. Nếu dung dịch cố
định không được đệm, ở độ pH khác có thể gây ra co rút hạt nhân, cường độ
nhuộm tế bào chất thay đổi [48].
Quá trình cố định formaldehyde không tạo ra "sự cố định quá mức", nghĩa là
các mô không bị cứng lại một cách quá mức [20], tạo điều kiện thuận tiện cho
parafin ngấm vào mô. Thành phần methylene hydrate có trong dung dịch
formaldehyde đệm trung tính 10%, phản ứng với một số chuỗi bên của protein
để tạo thành các nhóm bên hydroxymethyl, sự hình thành chuỗi bên
hydroxymethyl là phản ứng chính, đặc trưng và hình thành các liên kết ngang.
Formaldehyde cũng phản ứng với protein hạt nhân và axit nucleic (Kok &
Boon, 2003, Leong, 2005). Nó thâm nhập giữa axit nucleic và protein, ổn định
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
7
axit nucleic, cố định nucleotide bằng cách phản ứng với các nhóm amin tự do
như với protein. Trong Deoxyribonucleic axit (DNA) các phản ứng liên kết
ngang được bắt đầu tại các vùng giàu adenine - thymidine và tăng liên kết ngang
khi nhiệt độ tăng. Các nhóm phản ứng có thể kết hợp với các nhóm hydro hoặc
với nhau để tạo thành cầu metylen. Formaldehyde chủ yếu bảo tồn các liên kết
peptide-protein và cấu trúc chung của các bào quan tế bào. Formaldehyde có
thể tương tác với axit nucleic nhưng ít ảnh hưởng đến carbohydrate và bảo quản
lipit nếu các dung dịch có chứa canxi (Bayliss High & Lake, 1996) [17]. Bệnh
phẩm lấy ra khỏi cơ thể cố định ngay (không quá 30 phút kể từ khi bệnh phẩm
được lấy ra khỏi cơ thể) trong formaldehyde trung đệm tính 10%, do các khoa,
phòng lâm sàng gửi tới [1].
1.2.1.2. Thể tích cố định
Thể tích và nồng độ dung dịch cố định có tác động rõ rệt đến vận tốc xuyên
thấm và vận tốc cố định [2], do đó phải dùng tối thiểu thể tích dung dịch cố
định ≥ 10 lần thể tích bệnh phẩm, để cố định tối ưu và nhanh chóng [47], là
lượng dung dịch cần thiết đủ cố định mẫu bệnh phẩm. Những bệnh phẩm lớn,
nên cắt lát có độ dày 1,5cm để dung dịch cố định có thể xuyên qua mô được dễ
dàng [13]. Phần lớn thể tích mô xác định khối lượng dung dịch cố định cần
thiết, độ dày sẽ quyết định tốc độ cố định [16], [41].
1.2.1.3. Thời gian cố định
Thời gian cố định phụ thuộc vào loại bệnh phẩm, độ dày bệnh phẩm, vận tốc
xuyên thấm và vận tốc cố định của dung dịch cố định, nồng độ dung dịch cố
định, nhiệt độ [2].
Theo luật khuyếch tán nó giảm dần từ lúc ngâm bệnh phẩm vào dung dịch
Công thức tính: e =d√𝑡
Trong đó, e = độ ngấm sâu vào, tính theo milimet
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
8
d = hệ số xuyên thấm
t = thời gian hoạt động của dung dịch tính theo giờ.
Như vậy, hệ số d sẽ bằng bề dày của tổ chức mô được một dung dịch có nồng
độ đã biết đi qua trong một giờ.
Vận tốc cố định là hiện tượng hóa học: nó tương ứng với thời gian cần thiết
cho việc kết tủa hoặc làm cho các thành phần tế bào không bị hòa tan.
Như vậy, nếu vận tốc xuyên thấm chậm nhưng vận tốc cố định nhanh thì cần
lấy bệnh phẩm nhỏ, cắt mỏng và không ngâm lâu trong dung dịch cố định. Trái
lai, nếu vận tốc xuyên thấm nhanh, vận tốc cố định chậm có thể cắt bệnh phẩm
tương đối to và dày nhưng cần ngâm lâu trong dung dịch cố định [2].
Tương tự tài liệu [47], thời gian cố định xấp xỉ bằng bình phương độ sâu mà
dung dịch cố định phải thâm nhập và hầu hết các dung dịch cố định, chẳng hạn
như formaldehyde đệm trung tính 10% sẽ thâm nhập mô đến độ sâu khoảng
1mm trong một giờ. Điều quan trọng cần lưu ý là các thành phần của chất cố
định sẽ thâm nhập vào các mô ở các mức độ khác nhau, vì vậy sẽ tốt hơn nếu
các chất cố định này được sử dụng với các mẫu bệnh phẩm cắt mỏng hay nếu
mẫu bệnh phẩm lớn thì hãy thực hiện cắt thành những lát có độ dày 1,5cm để
dung dịch cố định có thể xuyên qua mô dễ dàng [15]. Ngoài ra, protein làm bất
hoạt các chất cố định, đặc biệt là trong máu hoặc chất lỏng có máu, vì vậy
những mẫu bệnh phẩm phải được rửa bằng nước muối trước khi đưa vào dung
dịch cố định [48].
1.2.1.4. Bệnh phẩm cố định đạt
Là bệnh phẩm không bị “sống” hoặc “quá chín” [2].
Bệnh phẩm “sống” thường mềm, vẫn còn thấy màu hồng đỏ của tổ chức mô
bị thoái hóa, hoại tử. Nó dễ sinh ra các tổn thương và hình ảnh giả tạo. Khi
nhuộm hình ảnh bắt màu không đẹp.
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.
9
Nguyên nhân gây bệnh phẩm “sống” có thể là bệnh phẩm cắt quá dày, thời
gian ngâm bệnh phẩm quá ngắn, thể tích dung dịch cố định không đủ, nồng độ
dung dịch không đủ.
Bệnh phẩm “quá chín”, mô khá cứng chắc, giòn khi cắt. Dù cẩn thận, khi cắt
mảnh, mô vẫn bị vỡ, nát vụn và khi nhuộm tính bắt màu bị giảm rõ, nhân tế bào
dễ bị nhăn nhúm.
Nguyên nhân bệnh phẩm “quá chín” do thời gian cố định quá dài.
Nếu mô cố định không được đầy đủ, có thể dẫn đến hình thái thay đổi và ảnh
hưởng đến đặc tính nhuộm màu của mô [47]. Sau cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua khâu kỹ thuật sau:
1.2.2. Khử nước
Bệnh phẩm sau khi cố định đủ thời gian và đạt yêu cầu, được bác sĩ GPB cắt
lọc bệnh phẩm ở vị trí cần xét nghiệm với kích thước theo quy định, mô được
xử lý bằng máy chuyển mô chuyên dụng. Xử lý mô được thiết kế để loại bỏ tất
cả nước có thể ra khỏi mô, thay thế nó bằng môi trường hỗ trợ cung cấp đủ độ
cứng để cho phép cắt mảnh mô mà không làm tổn thương nhu mô hoặc biến
dạng [47].
Bệnh phẩm sau xử lý đạt là bệnh phẩm trong, bóng [1], vừa đủ cứng, không
quá mềm cũng không quá cứng, mô không bị đục. Để bệnh phẩm đạt sau xử lý,
điều quan trọng là trong tất cả các lần nhúng, ngâm mô vào các loại hóa chất
như forrmaldehyde 10% pH 7,2, alcool, clear-rite 3, parafin của quá trình xử lý
mô phải tuân thủ đúng thời gian, nồng độ là cần thiết, thời gian ngâm mô trong
các loại hóa chất không quá ít hoặc quá nhiều [13]. Bất kỳ giai đoạn ngâm mô
trong xử lý mô mà dung dịch không được đẩy hết ra khỏi các mô, parafin không
thể xâm nhập vào mô hoặc thời gian ngâm mô trong parafin không đủ, các mô
sẽ không được xử lý tốt [47].
Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.
- Xem thêm -