Tài liệu Tổng quan về enzyme protease

Enzyme protease Mở đầu Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đượac sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế…Hàng năm luợng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD,được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử,xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease la enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thưc phẩm ( đông tụ sữa làm cho phomát,lsmf mềm thịt,bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia.xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa,thuộc da,y tế,nông nghiệp…) Qua nhiều năm ,việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao,do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất.Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu đượ chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói chung và protease nói riêng thì có một số phương pháp hóa – lý khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm chính sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 1 Enzyme protease Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn enzyme phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 2 Enzyme protease Phần I – Tổng quan về enzyme protease 1.Giới thiệu chung Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid ( -CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. H2N–CH–CO–NH–CH–CO -….- NH–CH-COOH R1 R +H2O RX 2 H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO…NH-CH-COOH R1 R2 RX Mô hình enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 3 Enzyme protease Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa,..) và động vật (gan, dạ dày bê,..). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Cấu trúc không gian enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 4 Enzyme protease 1.1 Phân loại Protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Peptidase (protease) (E.C.3.4) Endopeptidase (E.C.3.4.21-99) Exopeptdase (E.C.3.4.11-17) Aminopeptidase Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành 2 loại : endopeptidase và exopeptidase. • Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại : + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin,một dipeptide hoặc tri peptide. + Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác ,endopeptidase được chia thành 4 nhóm: Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 5 Enzyme protease + Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin.trypsin,elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 1.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau vê nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 6 Enzyme protease thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm. Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứa tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tư thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000),… Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 – 48.400). Protease thiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton. 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động ( TTHĐ) của protease. Trong TTHĐ của protease vi sinh vật (VSV) ngoài gốc aa đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aa khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease VSV cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: -TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại. + Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 A0 , có thể phân biệt thành 6 phần dưới TTHĐ ( subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 7 Enzyme protease + Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấy phân tử các phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 A0. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung như sau: E+S enzyme – S Enzyme-S + P1 enzyme + P2 Trong đó: E: Enzyme, S: cơ chất, Enzyme-S: phức chất enzyme-cơ chất, P1, P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 cưa phản ửng. Phần II – Nguồn thu nhận Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi vi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là 3 nguồn chính: động vật, thực vật, vi sinh vật. 2.1 Nguồn động vật - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 8 Enzyme protease trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩn renin bị nhiễm pepxin ( trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nhiều nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Edothia Parasitica và Mucor Purullus. Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá basa. Dịch trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78 UI/gCKNT trong điều kiện trích ly : tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5: nhiệt đọ 35 0C: thời gian trich ly 10 phút. 2.2 Nguồn thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa củ lá, thân, quả đu đủ ( Carica papaya) còn Bromelain thu được từ quả chồi dứa, vỏ dứa ( pineapple pant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của Bia khi làm lạnh ( chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của proease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên. Nguồn protease thu từ thực vật Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 9 Enzyme protease Thu nhận từ hạt cốc nảy mầm: Malt là loại hạt hòa thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo( nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt. Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau: + Thu nhận, xử lí, làm sạch, phân loaị và bảo quản hạt. + Rửa, sát trùng và ngâm hạt. + Uơm mầm ta sẽ thu được malt tươi. + Sấy malt tươi. + Xử lí và bảo quản malt khô. Hoạt tính protease trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4-8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tính amylase và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5. Sự thủy phân protein bắt đầu bằng tác dụng của protienaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các acidamin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt. Tuy nhiên, vì nhiệt độ nảy mầm tương đối thấp và thời gian nảy mầm tương đối dài sẽ có sự thủy phân protein tương đối sâu sắc để tạo thành một lượng đáng kể các polypeptit và các acidamin. Tác động này chỉ diễn ra với nội nhũ, trong khi protein ở lớp ngăn cách nội nhũ với vỏ và cả phần vỏ malt thì không bị biến đổi cả trong cả quá trình chế biến về sau. 2.3 Nguồn vi sinh vật Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,…gồm các loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. 2.3.1 Vi khuẩn Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 10 Enzyme protease Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% sản lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kêt peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số chi Clotridium. Trong đó, B,subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp ác protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp ( pH 58) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clotridium. Bacillus 2.3.2 Nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus, A.terricola, A.saitoi,… Các nấm mốc này có khả năng cả ba loại protease: acid, kiềm và trung Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 11 Enzyme protease tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3. Một số nấm mốc nhưA.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat. Nấm mốc 2.3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,… Xạ khuẩn Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được chiết tách từ S.grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 12 Enzyme protease 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amina acid. Ở Liên Xô (cũ) người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S,grieus có tên là protelin. Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân keratin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-zim dùng trong sản xuất Da. Protease từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp chê biến thịt. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide đinh trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: • Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống vi sinh vật. • Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm. • Có thể điều khiển sinh tông hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi. • Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố ( gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý. Để sản xuất chế phẩm enzyme , người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó. Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 13 Enzyme protease Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và thực vật 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật. Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Quá trình sản xuất cá chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu: Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh tổng hợp enzyme Tách và làm sạch chế phẩm enzyme Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 14 Enzyme protease Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme 3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao. Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khả năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. 3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến. Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để: -Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược. Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme. Gây đột biến đoạn gene hoạt hoá promotor để làm tăng áp lực của nó đối với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã… Dùng biện pháp này có thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần. Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lỗi” một bazo khi tái tạo phân tử AND. Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ) hay hoá học (các hoá chất) tác dụng lên tế bào sinh vật. 3.1.1.2 Phương pháp biến nạp. Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi sinh vật dưới ảnh hưởng của AND trong dịch chiết nhận được từ tế bào của sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (AND) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào. Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 15 Enzyme protease Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại AND nào chứ không đòi hỏi phải là AND từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn AND nhất định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn AND được di truỳền trong biến nạp có M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loại vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas. 3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene. Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. 3.1.1.4. Phương pháp tải nạp Vật liệu di truyền (AND) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận. 3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưư ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyển và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu. • Phương pháp cấy chuyển. Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 16 Enzyme protease điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-400C và sau mỗi tuần phải cấy chuyển lại. Khi cấy chuyển chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyển các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng. Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chin sinh lý. Phương pháp cấy chuyển rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc. 3.2. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch • Phương pháp làm khô Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khẩn thời gian giữ giống có thể được một nă. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuiy nhiên giống như phương pháp cấy chuyển thời gian bảo quản tương đối ngắn. • Phương pháp đông khô Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và đượclàm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 17 Enzyme protease số virut. Tuy nhiên phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. • Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196oC -> -80oC). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt đọ khác nhau như -20oC, -30oC, -40oC,-70oC, -140oC và -196oC. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30oC cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro nhue cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. 3.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease. Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng cso ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. trong thành Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 18 Enzyme protease phần môi trường phải có đủ các chất bảo quản được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho khồng bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 3.3.1. Nguồn cacbon. Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tuỳ thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase cảu nấm mốc có thể theo thứ tự: Đối với Asp.flavus 74: fructoza → glucoza → sacaroza → ramnoza → manoza → galactoza → arabinora → lactoza. Đối với Asp. Awamori 200: fructoza → manit → sacaroza → arabinora → manoza → galactoza → lactoza. Đối với Asp. Oryzae 79: fructoza → sacaroza → maltoza → glucoza → manit → arabinora → galactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. Ví dụ: VI khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột >8%. Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 19 Enzyme protease Nhiều xạ khuẩn ưu nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng đọ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme. Nếu tăng nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4:1. trên môi trường có maltoza (0,5 – 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza, manoza,fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2 – 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme. Ngoài ra, một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n-parafin với 12, 14 và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng khôgn chỉ đồng hoá đươch cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm. 3.3.2. Nguồn nitơ. Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số laòi nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Tren môi trường kzapek NaNO3 đwocj thay bằng cả cazein và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung. Trong quá trình nuôi cáy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B. mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 20