Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc ms ms

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ THỊ ĐÀO XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ THỊ ĐÀO XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN Tp. Hồ Chí Minh – 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác. Lê Thị Đào . . Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Lê Thị Đào Hướng dẫn khoa học: TS. Chương Ngọc Nãi, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn. Từ khóa: LC-MS/MS, irbesartan, hydroclorothiazid. Mở đầu: Phối hợp của irbesartan (IRB) và hydroclorothiazid (HCTZ) được chỉ định trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB và HCTZ cho rằng sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng. Cho đến nay, chỉ có một chế phẩm phối hợp IRB và HCTZ được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các sản phẩm ngoại nhập. Để chứng minh hiệu quả điều trị tương đương giữa thuốc generic và thuốc phát minh, cần phải đánh giá tương đương sinh học in vivo. Kỹ thuật LC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và giới hạn định lượng các chất thấp trên các nền mẫu dịch sinh học. Vì vậy, kỹ thuật này đang được áp dụng phổ biến để định lượng thuốc trong dịch sinh học. Trên thế giới đã có một số công trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước công bố công trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ. Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: IRB và HCTZ trong các mẫu huyết tương người giả lập. Phương pháp nghiên cứu: Mẫu huyết tương giả lập chứa các chất phân tích và chuẩn nội telmisartan được xử lý bằng các phương pháp như kết tủa protein với methanol, acetonitril; chiết lỏng-lỏng với tert-butyl methyl ether, ethyl acetat và hỗn hợp tert-butyl methyl ether ethyl acetat. Mẫu sau khi xử lý sẽ được định lượng bằng kỹ thuật LC-MS/MS, sử dụng cột sắc ký pha đảo, pha động methanol và đệm amoni format 5 mM pH 5. Sau cùng, quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA và EMA. Kết quả: IRB, HCTZ và chuẩn nội được ion hóa bằng kỹ thuật ESI và được ghi phổ bằng k4y thuật MRM để thu được các ion phân tử và ion phân mảnh dùng cho định lượng. Quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LCMS/MS đã được xây dựng, sử dụng cột sắc ký Gemini C18 (250 x 2 mm; 5 µm), pha động methanol và đệm amoni format 5 mM, pH 5 (80:20, tt/tt), tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Mẫu huyết tương giả lập được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với hỗn hợp tert-butyl methyl ether - ethyl acetat (50:50, tt/tt) cho hiệu suất chiết trên 95%. Quy trình định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu chung của một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kết luận: Đề tài đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Quy trình có thể được ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm chứa IRB và HCTZ. . .i Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LC-MS/MS METHOD FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF IRBESARTAN AND HYDROCHLOROTHIAZIDE IN HUMAN PLASMA Le Thi Dao Supervisor: Dr. Chuong Ngoc Nai, Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan Keywords: LC-MS/MS, irbesartan, hydrochlorothiazide. Introduction: Combination of irbesartan (IBR) and hydrochlorothiazide (HCTZ) is indicated in the treatment of edema and hypertension. Clinical studies on IRB and HCTZ suggest that this combination is effective. So far, there has been only one formulation of IRB and HCTZ combination is locally produced with a competitive price than one of imported products. In order to prove clinically equivalent efficacy between generic and patent drugs, the in vivo bioequivalence study is mandatory. The LC-MS/MS technique has several advantages such as high sensitivity and specificity, short analysis time and low limit of quantitation. This technique is being applied commonly to quantify active ingredients in biological fluids. There have been several simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma until now. However, no local authors have published the simultaneous quantitative studies of IRB and HCTZ in human plasma, so far. Therefore, this study has been performed with the aim of development and validation of the simultaneous quantitative procedure of irbesartan and hydrochlorothiazide in human plasma by LC-MS/MS in accordance with the guidelines of US-FDA and EMA, contributing to the in vivo bioequivalence study of pharmaceuticals containing IRB and HCTZ. Materials and methods Object of study: IRB and HCTZ spiked into blank human plasma samples. Methods of study: Blank human plasma samples containing the analytes and telmisartan as internal standard, were treated by protein precipitation with methanol, acetonitrile; liquidliquid extraction with tert-butyl methyl ether, ethyl acetate and mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate. The treated samples were quantified by LC-MS/MS, using reverse phase column, mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5. Finally, the quantitative procedure was validated on the basis of FDA and EMA guidelines on bioanalytical method validation. Results: IRB, HCTZ and internal standard were ionized using ESI source and detected by multiple reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular ions and fragment ions for quantification. The procedure for simultaneous assay IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed, using Gemini C18 column (250 x 2 mm; 5 µm), mobile phase containing methanol and ammonium formate buffer 5 mM with pH 5 (80:20, v/v), and flow rate of 0.4 ml/min. The human plasma samples were treated by liquid-liquid extraction with a mixture of tert-butyl methyl ether and ethyl acetate (50:50, v/v), which gave the recovery above 95%. The procedure was successfully validated with general requirements for a bioanalytical procedure. Conclusion: The procedure for simultaneous assay of IRB and HCTZ in human plasma by LC-MS/MS was developed which is high sensitivity, specificity and accuracy. The procedure can be applied for in vivo bioequivalence study of combination medical products containing IBR and HCTZ. . . MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................x MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Tổng quan về irbesartan ...................................................................................3 1.2. Tổng quan về hydroclorothiazid ......................................................................4 1.3. Tổng quan về chuẩn nội ...................................................................................6 1.4. Tổng quan về phương pháp xử lý mẫu huyết tương ........................................8 1.5. Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA và EMA ...............................................................................................................11 1.6. Một số công trình nghiên cứu định lượng irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ ....................18 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................24 2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................24 2.2. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................24 2.3. Nguyên vật liệu ..............................................................................................24 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................36 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ ...........................................................................36 3.2. Khảo sát chuẩn nội .........................................................................................38 3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ...............................................................................38 3.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu .........................................................................46 3.5. Xác định khoảng nồng độ định lượng các thuốc ............................................52 . . 3.6. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA ...............................................................................................................53 3.7. Dự thảo quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng LC-MS/MS .............................................................62 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................66 4.1. Lựa chọn kỹ thuật phân tích ...........................................................................66 4.2. Điều kiện khối phổ .........................................................................................66 4.3. Điều kiện sắc ký .............................................................................................67 4.4. Lựa chọn chuẩn nội ........................................................................................67 4.5. Quy trình xử lý mẫu .......................................................................................68 4.6. Kết quả thẩm định ..........................................................................................69 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................71 5.1. Kết luận ..........................................................................................................71 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . i. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, Từ nguyên Ký hiệu AF Acid formic AS Analytical standard (Chất chuẩn phân tích) ACN Acetonitrile Cmax Nồng độ đỉnh CC Calibration curve (Đường chuẩn) CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu) ESI Electrospray ionization (Ion hóa phun điện) US-FDA The United States Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ) HCTZ Hydroclorothiazid HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HQC High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IRB Irbesartan IS Internal standard (Chuẩn nội) LC-MS LC-MS/MS Liquid chromatography – Mass spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ) Liquid chromatography – Tandem Mass spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ/Khối phổ) LLOQ Lower limit of quantification (Giới hạn định lượng dưới) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) . .i LOQ Limit of quantification (Giới hạn định lượng) LQC Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) MF Matrix factor (Yếu tố nền mẫu) MRM Multiple reaction monitoring MQC Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) QC Quality control (Mẫu kiểm tra) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S Area (Diện tích pic) S/N Signal / Noise (Tín hiệu / Nhiễu) TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo tR Retention time (Thời gian lưu) TCCS Tiêu chuẩn cơ sở UHPLC- Ultra high performance liquid chromatography – Tandem Mass MS/MS spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng – Khối phổ/Khối phổ) ULOQ Upper limit of quantitation (Giới hạn định lượng trên) UPLC- Ultra performance liquid chromatography – Tandem Mass MS/MS spectrometry (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng – Khối phổ/Khối phổ). . . ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số quy trình xử lý mẫu huyết tương người .......................................10 Bảng 1.2. Một số công trình nghiên cứu định lượng irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng - khối phổ ................................18 Bảng 1.3. Nồng độ đỉnh (Cmax) và khoảng nồng độ tuyến tính của irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người ..............................................................19 Bảng 2.1. Chất chuẩn và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu .......................24 Bảng 2.2. Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ...........................24 Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng sử dụng trong nghiên cứu ............................25 Bảng 2.4. Một số thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu ................................25 Bảng 2.5. Khoảng nồng độ tuyến tính dự kiến và các mức nồng độ của mẫu kiểm tra của IRB và HCTZ trong huyết tương người ........................................................31 Bảng 2.6. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương người ......................32 Bảng 3.1. Kết quả tối ưu hóa thế phân mảnh của IRB, HCTZ, telmisartan, losartan, valsartan ....................................................................................................................36 Bảng 3.2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của telmisartan, losartan, valsartan ở cùng nồng độ 1 µg/mL ...........................................................................................38 Bảng 3.3. Các thông số sắc ký của các chất phân tích theo nhiệt độ cột..................43 Bảng 3.4. Các thông số sắc ký của các chất phân tích theo tốc độ dòng..................44 Bảng 3.5. Các thông số sắc ký của các chất phân tích theo thể tích tiêm mẫu.........45 Bảng 3.6. Hiệu suất chiết dược chất và chuẩn nội từ huyết tương với 2 dung môi tủa protein (n=6)..............................................................................................................47 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=6) ....................................................48 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát nồng độ natri hydroxyd kiềm hóa huyết tương (n=6) ..49 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát nồng độ acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) ..50 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát thể tích acid phosphoric acid hóa huyết tương (n=6) .51 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát số lần chiết (n=6) ........................................................52 Bảng 3.12. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương ..............................53 . . Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n=6) .......................................53 Bảng 3.14. Kết quả thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp ................................54 Bảng 3.15. Hiệu suất chiết các chất từ huyết tương người (n = 6) ...........................55 Bảng 3.16. Mối tương quan giữa nồng độ IRB và HCTZ trong huyết tương và tỷ số diện tích pic (S/SIS) ...................................................................................................56 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa của các hệ số của phương trình hồi quy ....................................................................56 Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày ...................................................................................................................................57 Bảng 3.19. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới ...........................................58 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n=6) ......................58 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu (n=6) .....................................59 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá ảnh hưởng độ pha loãng của IRB và HCTZ trong huyết tương (n=6) ................................................................................................................60 Bảng 3.23. Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch gốc IRB, HCTZ và IS (n=6) ...................................................................................................................................60 Bảng 3.24. Kết quả đánh giá độ ổn định của IRB và HCTZ trong huyết tương (n=6) ...................................................................................................................................61 . . DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Trang Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết mẫu bằng phương pháp kết tủa protein ..........................29 Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng.........................30 Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của irbesartan ..................................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hydroclorothiazid .....................................................4 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của losartan kali..............................................................6 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của telmisartan ...............................................................7 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của valsartan ...................................................................8 Hình 1.6. Cơ chế phân mảnh của telmisartan, hydroclorothiazid (HCTZ), irbesartan, losartan, valsartan. ...................................................................................22 Hình 3.1. Phổ khối (ion phân tử và ion phân mảnh) của telmisartan (A và A’), irbesartan (B và B’), hydroclorothiazid (C và C’), losartan (D và D’), valsartan (E và E’) ở cùng nồng độ 1 µg/mL ................................................................................37 Hình 3.2. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với 2 hệ pha động khảo sát: (A). acetonitril – amoni format 10 mM pH 5 (80:20) và (B). methanol – amoni format 10 mM pH 5 (80:20) ......................................................................................................39 Hình 3.3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với hệ pha động methanol - amoni format pH 5 (80:20) có nồng độ 1 mM (A), 3 mM (B), 5 mM (C) và 10 mM (D) ..39 Hình 3.4. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với pha động methanol - amoni format 5 mM pH 5 với các tỷ lệ 60:40 (A), 70:30 (B), 80:20 (C), 90:10 (D)...........40 Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với pha động methanol - amoni format 5 mM (80:20) có pH 3 (A), pH 4 (B), pH 5 (C), pH 6 (D) ...........................41 Hình 3.6. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với nhiệt độ cột 30 oC(A), 35 oC(B), 40 oC(C) và 45 oC(D) ................................................................................................42 Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với tốc độ dòng 0,35 mL/phút (A), 0,4 mL/phút (B) và 0,45 mL/phút (C). ......................................................................44 Hình 3.8. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với thể tích tiêm mẫu 2 µL (A), 3 µL (B), 5 µL (C) và 10 µL (D) ..............................................................................45 . i. Hình 3.9. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn irbesartan, hydroclorothiazid và chuẩn nội telmisartan nồng độ 100 ng/mL ở điều kiện sắc ký thích hợp ..................................46 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu giả lập tương ứng với dung môi tủa protein methanol (A) và acetonitril (B) .......................................................................................................47 Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các dung môi chiết khác nhau. (A). tert-butyl methyl ether, (B). ethyl acetat, (C). hỗn hợp tert-butyl methyl ether – ethyl acetat (5:5). ..........................................................................................................................48 Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu giả lập với các nồng độ acid hóa huyết tương khác nhau. (A). H3PO4 0%, (B). H3PO4 5%, (C). H3PO4 10%, (D). H3PO4 15% và (E). H3PO4 20%. ………………………………………………………………………………..51 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A), (B), (C) và mẫu huyết tương giả lập có chứa irbesartan (A’), hydroclorothiazid (B’) và telmisartan (C’) ở mức nồng độ LLOQ ...................................................................................................................54 . . MỞ ĐẦU Bệnh tim mạch là bệnh do sự hoạt động quá sức của tim dẫn đến khả năng hoạt động của tim suy yếu. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, trung bình mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do căn bệnh này. Đây là con số báo động về sự nguy hiểm mà căn bệnh này gây ra. Tăng huyết áp động mạch là một trong những yếu tố nguy cơ phổ biến và quan trọng nhất đối với bệnh tim mạch. Tuy nhiên, việc kiểm soát huyết áp không đạt yêu cầu cũng chiếm một tỷ lệ lớn trong điều trị. Vì vậy, trong điều trị huyết áp việc phối hợp thuốc đang được khuyến khích nhằm tăng tác dụng điều trị, tạo nên tác dụng hiệp đồng và giảm số lần uống thuốc cũng như những tác dụng không mong muốn. Mặc khác, muốn kiểm soát huyết áp tốt trong điều trị thì cần phải theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương có đạt yêu cầu điều trị hay không để có thể điều chỉnh liều cho phù hợp. Vì thế, các phương pháp xác định nồng độ thuốc làm hạ huyết áp trong huyết tương hoặc trong các dịch sinh học được áp dụng trong nhiều năm qua để theo dõi việc kiểm soát huyết áp trong điều trị bệnh [22]. Irbesartan (IRB) là một thuốc đối kháng thụ thể typ I angiotensin II. IRB được chỉ định điều trị tăng huyết áp động mạch vô căn, bệnh thận do đái tháo đường typ 2 có tăng huyết áp [2],[29]. Hydroclorothiazid (HCTZ) là thuốc lợi tiểu thuộc nhóm thiazid. HCTZ được chỉ định điều trị tăng huyết áp, dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II. Phối hợp của IRB và HCTZ được chỉ định trong điều trị phù nề và tăng huyết áp. Các nghiên cứu lâm sàng về IRB / HCTZ cho rằng sự kết hợp này có hiệu quả lâm sàng [2],[3],[20],[23],[29]. Hiện nay, có rất nhiều chế phẩm phối hợp IRB và HCTZ trên thị trường Việt Nam như Co-dovel, Coaprovel, Avalide, Irbesartan/HTC Sanzod, Karvezide, Irbenida Plus, Irovel H, Ibarzid. Tuy nhiên, chỉ có Co-dovel được sản xuất trong nước bởi Công ty Cổ phần xuất nhập khẩu Y tế Domesco với giá thuốc rẻ hơn các thuốc ngoại nhập hoặc thuốc phát minh. Để các thuốc generic có khả năng thay thế . . được thuốc phát minh, cần phải tiến hành thử nghiệm chứng minh tương đương sinh học giữa thuốc generic và thuốc phát minh vì sẽ giúp cho người bệnh giảm chi phí điều trị mà hiệu quả điều trị vẫn tốt. Do đó, việc đánh giá tương đương sinh học giữa thuốc generic và thuốc phát minh rất cần thiết trong việc nghiên cứu sản xuất thuốc generic ở nước ta. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu định lượng IRB và HCTZ trong huyết tương người một cách riêng lẻ, đồng thời hoặc kết hợp với các thuốc khác bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS hay LC-MS/MS) [5],[11],[14],[15],[16],[18],[20],[21],[27],[29]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có tác giả nào trong nước công bố công trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ trong huyết tương người. Kỹ thuật LC-MS/MS là một trong những kỹ thuật đang được áp dụng phổ biến để định lượng thuốc trong dịch sinh học. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm như độ nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn, giới hạn định lượng các chất thấp trên các nền mẫu phức tạp như dịch sinh học. Vì những lý do trên, đề tài “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IRBESARTAN VÀ HYDROCLOROTHIAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS” được thực hiện để góp phần vào việc đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa irbesartan và hydroclorothiazid. Mục tiêu của đề tài là: - Xác định chuẩn nội, điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ thích hợp. - Xây dựng quy trình chiết irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người. - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời irbesartan và hydroclorothiazid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS. Việc thẩm định được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học. . . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về irbesartan 1.1.1. Tính chất lý hóa - Cấu trúc hóa học: 8 7 9 5 4 3 6 1 2 4 3 5 3 4 2 6 2 5 6' 1 1' 2' 1 3' 5' 4' Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của irbesartan - Danh pháp IUPAC: 2-butyl-3-[[2'-(lH-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]-l,3diazaspiro[4.4]non-l-en-4-on. - Công thức phân tử: C25H28N6O. - Khối lượng phân tử: 428,5 g/mol. - Irbesartan là chất bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, đa hình [1]. - Irbesartan hơi tan trong methanol, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước [1]. - pKa1 = 4,12; pKa2 = 7,4 [4]. - Điểm chảy: 180-181 °C [31]. 1.1.2. Cơ chế tác dụng và dược động học 1.1.2.1. Cơ chế tác dụng Irbesartan là một thuốc đối kháng thụ thể typ I angiotensin II. Irbesartan phong bế hoạt động sinh lý của angiotensin II, là chất được tạo từ angiotensin I trong phản . . ứng xúc tác bởi men chuyển angiotensin. Angiotensin II là chất co mạch chính của hệ renin-angiotensin và kích thích vỏ thượng thận tổng hợp và tiết aldosteron. Irbesartan phong bế tác dụng co mạch và bài tiết aldosteron của angiotensin II nhờ gắn chọn lọc vào thụ thể AT1 của angiotensin II [2]. Irbesartan có tác dụng làm giảm huyết áp. Tác dụng chống tăng huyết áp của irbesartan và thuốc lợi tiểu thiazid có tính cộng hợp [2]. 1.1.2.2. Dược động học Irbesartan hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa với sinh khả dụng 60-80 %. Thức ăn không làm thay đổi nhiều đến sinh khả dụng của thuốc. Thuốc liên kết khoảng 96% với protein huyết tương. Thể tích phân bố của thuốc khoảng 53-93 lít. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt khoảng 1-2 giờ sau một liều uống. Nồng độ thuốc trong máu đạt trạng thái cân bằng ổn định sau 3 ngày uống thuốc. Thuốc chuyển hóa ở gan nhờ quá trình liên hợp glucuronic và oxy hóa. Irbesartan được oxy hóa chủ yếu qua xúc tác của isoenzym CYP2C9 của cytochrom P450. Thuốc và các sản phẩm chuyển hóa được đào thải qua mật và nước tiểu, phần còn lại (khoảng 80%) qua phân. Một lượng nhỏ dưới 2% của liều đào thải qua nước tiểu dưới dạng không biến đổi. Nửa đời thải trừ của thuốc là 11-15 giờ [2],[12]. 1.2. Tổng quan về hydroclorothiazid 1.2.1. Tính chất lý hóa - Cấu trúc hóa học: 5 6 4 7 3 1 2 8 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hydroclorothiazid - Danh pháp: 6-Cloro-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-7-sulfonamid-1,1- dioxid. . . - Công thức phân tử: C7H8ClN3O4S2. - Khối lượng phân tử: 297,7 g/mol. - Hydroclorothiazid là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình [1]. - Hydroclorothiazid rất ít tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong aceton, tan trong dung dịch kiềm loãng [1]. - pKa = 7,9 và 9,2 [13]. - Điểm chảy: 273 °C [32]. 1.2.2. Cơ chế tác dụng và dược động học 1.2.2.1. Cơ chế tác dụng Hydroclorothiazid và các thuốc lợi tiểu thiazid làm tăng bài tiết natri clorid và nước kèm theo do cơ chế ức chế tái hấp thu các ion natri và clorid ở ống lượn xa. Sự bài tiết các chất điện giải khác cũng tăng, đặc biệt là kali và magnesi, còn calci thì giảm. Các thiazid có tác dụng lợi tiểu mức độ vừa phải vì khoảng 90% ion natri đã được tái hấp thu trước khi đến ống lượn xa là vị trí chủ yếu thuốc có tác dụng [2]. Hydroclorothiazid có tác dụng hạ huyết áp do làm giảm thể tích huyết tương và dịch ngoại bào liên quan đến sự bài tiết natri. Hydroclorothiazid có tác dụng hạ huyết áp sau 1-2 tuần, còn tác dụng lợi tiểu xảy ra nhanh có thể thấy ngay sau vài giờ. Hydroclorothiazid làm tăng tác dụng của các thuốc hạ huyết áp khác [2]. 1.2.2.2. Dược động học Sau khi uống, hydroclorothiazid hấp thu tương đối nhanh, khoảng 65-75% liều sử dụng, tuy nhiên tỷ lệ này có thể giảm ở người suy tim. Thức ăn có thể làm giảm hấp thu của thuốc. Hydroclorothiazid tích lũy trong hồng cầu, 40-68% thuốc liên kết với protein huyết tương. Thuốc thải trừ chủ yếu qua thận, phần lớn dưới dạng không chuyển hóa. Nửa đời của hydroclorothiazid khoảng 9,5-13 giờ, nhưng có thể kéo dài trong trường hợp suy thận nên cần điều chỉnh liều. Hydroclorothiazid đi qua hàng rào nhau thai, phân bố và đạt nồng độ cao trong thai nhi [2]. Tác dụng lợi tiểu xuất hiện sau khi uống 2 giờ, đạt tối đa sau 4 giờ và kéo dài khoảng 12 giờ [2]. . . Tác dụng chống tăng huyết áp xảy ra chậm hơn tác dụng lợi tiểu nhiều và chỉ có thể đạt được tác dụng đầy đủ sau 2 tuần, ngay cả với liều tối ưu giữa 12,5-25 mg/ngày. Ðiều quan trọng cần biết là tác dụng chống tăng huyết áp của hydroclorothiazid thường đạt được tối ưu ở liều 12,5 mg (nửa viên 25 mg). Các hướng dẫn điều trị và thử nghiệm lâm sàng hiện đại đều nhấn mạnh cần sử dụng liều thấp nhất và tối ưu, điều đó làm giảm được nguy cơ tác dụng có hại. Vấn đề quan trọng là phải chờ đủ thời gian để đánh giá sự đáp ứng của cơ thể đối với tác dụng hạ huyết áp của hydroclorothiazid vì tác dụng trên sức cản ngoại vi cần phải có thời gian mới thể hiện rõ [2]. 1.3. Tổng quan về chuẩn nội 1.3.1. Losartan kali - Cấu trúc hóa học: 3 4 2 1 5 4' K+ 5' 3' 3 4 6' - 2 1 2' 2 1' 1 6 5 5 3 4 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của losartan kali - Danh pháp: Kali 5-[4’-[[2-butyl-4-cloro-5-(hydroxymethyl)-1H-imidazol-1- yl]methyl]biphenyl-2-yl]tetrazol-1-id. - Công thức phân tử: C22H22ClKN6O. - Khối lượng phân tử: 461,0 g/mol. - Losartan kali là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [6]. - Losartan kali dễ tan trong nước và methanol (MeOH), hơi tan trong acetonitril (ACN) [6]. . . - pKa = 4,9 [28]. 1.3.2. Telmisartan - Cấu trúc hóa học: 3 4 5 2 3' 1 2' 4' 3 2 6 7 5' 4 6' 1 5 6 5 1' 1 4 2 3 7 6 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của telmisartan - Danh pháp: Acid 4'-[[4-methyl-6-(1-methyl-lH-benzimidazol-2-yl)-2-propyl-lHbenzimidazol-1-yl]methyl]biphenyl-2-carboxylic. - Công thức phân tử: C33H30N4O2. - Khối lượng phân tử: 514,6 g/mol. - Telmisartan là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng nhạt, đa hình [1]. - Telmisartan không tan trong nước, khó tan trong methanol, hơi tan trong methylen clorid và tan trong dung dịch natri hydroxyd 1 M [1]. - pKa = 4,45 ± 0,09 [7]. 1.3.3. Valsartan - Danh pháp IUPAC: (2S)-3-Methyl-2-[pentanoyl[[2’-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl4-yl]methyl]amino]butanoic acid. - Công thức phân tử: C24H29N5O3. - Khối lượng phân tử: 435,5 g/mol. - Valsartan là chất bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [6]. - Valsartan dễ tan trong ethanol khan nước, ít tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước [6]. .