Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin i trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc ms ms)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ MỸ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. CHƯƠNG NGỌC NÃI PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác. Trần Thị Mỹ Dung . MỤC LỤC Trang TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về metronidazol (MET) 3 1.2. Tổng quan về spiramycin I (SPY I) 5 1.3. Tổng quan về các chất dùng làm chất chuẩn nội 7 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng ghép khối phổ 8 1.5. Xử lý mẫu huyết tương 14 1.6. Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US- 17 FDA và EMA 1.7. Một số công trình nghiên cứu định lượng metronidazol và spiramycin 24 trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Địa điểm nghiên cứu 27 2.3. Nguyên vật liệu 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1. Chuẩn bị mẫu 28 2.4.2. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết 29 tương người bằng phương pháp LC-MS/MS . 2.4.3. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET VÀ SPY I, IS trong 31 huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS theo hướng dẫn của USFDA và EMA Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ 35 3.2. Khảo sát chuẩn nội 37 3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký 38 3.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương 45 3.5. Xác định khoảng nồng độ định lượng MET và SPY I trong huyết tương 47 người 3.6. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết 47 tương người bằng phương pháp LC-MS/MS 3.7. Dự thảo quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết 57 tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS Chương 4. BÀN LUẬN 60 4.1. Lựa chọn kỹ thuật phân tích để định lượng đồng thời MET và SPY I 60 4.2. Điều kiện sắc ký, thời gian phân tích và lượng mẫu thử 60 4.3. Khảo sát thành phần pha động 62 4.4. Lựa chọn chất chuẩn nội 63 4.5. Quy trình xử lý mẫu, hiệu suất chiết và ảnh hưởng của nền mẫu 64 4.6. Độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp 65 4.7. Độ ổn định của các chất phân tích 65 4.8. Ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư 66 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1. Kết luận 67 5.2. Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt ACN Acetonitrile AUC Area under cover (Diện tích dưới đường cong) APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển) AS Analytical Substance (Chất phân tích) CE Collision cell (Buồng va chạm) FAB Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) Cmax Nồng độ đỉnh CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) ECD Electron capture detection (Đầu dò cộng kết điện tử) ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun điện) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc và Thực phẩm) FI Field Ionization (ion hóa trường) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu) HQC High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IS Internal standard (Chuẩn nội) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng) LC Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) LC-MS/MS Liquid Chromatography- Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng – Khối phổ/Khối phổ) LLE Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng) LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) . MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MQC Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM) MeOH Methanol MF Matrix effect (Ảnh hưởng nền mẫu) MET Metronidazole ROX Roxithromycin PPT Protein precipitation (Tủa protein) CV Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) SRM Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM) SPY I Spiramycin I TB Trung bình TIN Tinidazole Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh t1/2 Thời gian bán thải ULOQ Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) . DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử 4 Bảng 1.2. Các thông số dược động học của spiramycin 6 Bảng 1.3. Tóm tắt quy triǹ h xử lý mẫu huyế t tương 16 Bảng 1.4. So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015 23 Bảng 2.1. Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 2.2. Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 2.3. Nồng độ lý thuyết các dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm tra (QC) 29 Bảng 3.1. Tóm tắt thông tin khảo sát nội chuẩn 37 Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ thu hồi với 2 dung môi tủa protein ở mức nồng độ MQC 47 Bảng 3.3. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương 47 Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) 48 Bảng 3.5. Kết quả xác định tính đặc hiệu của phương pháp 49 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 50 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy 50 và ý nghĩa của các hệ số của phương trình hồi quy Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác của phương pháp 51 (với MET) Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác của phương pháp 52 (với SPY I) Bảng 3.10. Hiệu suất chiết của MET, SPY I và ROX (n = 6) 52 Bảng 3.11. Độ ổn định của MET và SPY I trong dung dịch chuẩn gốc (n = 6) 53 Bảng 3.12. Độ ổn định của MET và SPY I trong huyết tương (n = 6) 54 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích MET và 55 SPY I Bảng 3.14. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của mẫu tồn dư MET, SPY I và 56 ROX Bảng 3.15. Kết quả đánh giá độ pha loãng của MET, SPY I trong huyết tương . 58 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol 3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của spiramycin 5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của roxithromycin 7 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của tinidazol 7 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của carbamazepin 8 Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC 9 Hình 1.7. Sơ đồ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI 10 Hình 1.8. Sơ đồ khối của đầu dò khối phổ hai lần tứ cực 11 Hình 1.9. Các chế độ làm việc của MS/MS 12 Hình 1.10. Bộ phận phân tích khối phổ của thiết bị LC-MS/MS 8040 14 Shimadzu Hình 3.1. Phổ khối của SPY I (A), MET (B), ROX (C) và TIN (D) 36 Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1% - 37 MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x 3 mm; 5 µm), nhiệt độ cột 40 oC, thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 1 (A đến C) và pha động 38 2 (D). Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 3 (A), 4 (B), 5 (C) và 39 (D), 6 (E) và 7 (F) Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động có pH 2,5 (A), 40 pH 5 (B), pH 7,5 (C) và pH 8,0 (D) Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các cột sắc ký khác nhau (nhiệt độ cột 40 oC). (A) Cột Nucleosil C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm). (B) Cột Nucleosil C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm). (C) Cột Gemini NX-C18 (100 x 3,0 mm; 5 µm). (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; 3 µm). (E) Cột Zorbax C18 (250 x 4,6 mm; 3 µm). Hệ pha động ACN - amoni format 5 mM pH 7,4 (80:20). Thể tích tiêm mẫu 3 µl . 42 Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác nhau. 43 (A) 30 oC, (B) 35 oC, (C) 40 oC. Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4 ACN (20:80). Thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch MQC với tốc độ dòng khác nhau. 44 (A) 0,3 ml/phút, (B) 0,4 ml/phút, (C) 0,5 ml/phút Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch MET, SPY I và ROX ở mức nồng độ 45 MQC Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein 45 khác nhau. (A) tủa bằng ACN, (B) tủa bằng MeOH Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein khác 46 nhau. (A) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,01 N; (B) và (C) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 1 N; (E) tủa bằng ACN trong dung dịch acid formic 1%; (F) tủa bằng MeOH trong dung dịch acid formic 1%. Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4 -ACN (20:80). Nhiệt độ cột 40 oC. Thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A) và mẫu huyết tương tự tạo 49 có chứa chuẩn ở nồng độ LLOQ (B) Hình 4.1. Công thức cấu tạo của spiramycin I gồm có 3 phân tử đường . 61 MỞ ĐẦU Hiện nay dạng thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin với liều cố định được sử dụng phổ biến trong nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn răng miệng cấp tính, mạn tính và dự phòng nhiễm khuẩn tại chỗ sau phẫu thuật nha khoa tại Việt Nam. Ngoài việc sử dụng các thuốc kháng viêm giảm đau trong điều trị nhiễm trùng răng miệng, kháng sinh cũng có vai trò quan trọng trong việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng như nướu răng, lợi…Các vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng khá đa dạng, thường bao gồm cả hai loại kỵ khí và hiếu khí nên sự phối hợp kháng sinh để điều trị là cần thiết. Việc phối hợp metronidazol và spiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệp đồng ức chế một số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lần đối với metronidazol và giảm MIC 10 lần đối với spiramycin [31], cũng như giảm những tác dụng không mong muốn. Spiramycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid được phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, là một hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần spiramycin I, II và III, trong đó hàm lượng spiramycin I trên 85%, spiramycin II và spiramycin III lần lượt không quá 5% và 10% [27],[32]. Spiramycin I có hoạt tính sinh học cao nhất trong số ba đồng phân trên [25]. Vì vậy, spiramycin I thường được chọn là chất đại diện để định lượng spiramycin [5],[9],[32]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượng metronidazol trong dịch sinh học [11],[17],[21],[24],[29],[32],[34],[35],[36] và spiramycin I [5],[9],[23],[32]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS chỉ có một công trình công bố cho đến thời điểm hiện tại [32]. Trong nước, vẫn chưa có công trình công bố về phương pháp định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người. Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol và spiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các thuốc ngoại nhập cùng hàm lượng. Tuy nhiên, chế phẩm này chưa được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất trong nước, các thuốc generic cần được chứng minh tính hiệu quả và an toàn trong điều trị qua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc. . 2 Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC – MS/MS)” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS. - Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA. . 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về metronidazol (MET) 1.1.1 Danh pháp, cấu trúc - Cấu trúc hóa học: Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol - Danh pháp IUPAC: (Metronidazol là 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)-ethanol [1]. - Công thức phân tử: C6H9N3O3 [1]. - Khối lượng phân tử: 171,2 g/mol [1]. 1.1.1. Tính chất lý hóa - Metronidazol là bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [1]. - Tính chất: khó tan trong nước, aceton, ethanol 96% và methylen clorid [1]. - pKa = 2,5 [12]. - Điểm chảy: 159 - 162 oC [12]. 1.1.2. Cơ chế tác dụng và dược động học 1.1.2.1. Cơ chế tác dụng Metronidazol là một dẫn chất 5-nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis và trên vi khuẩn kỵ khí. Trong ký sinh trùng, nhóm 5-nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độc với tế bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm vỡ các sợi này và cuối cùng làm tế bào chết. Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ ức chế tối thiểu các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml [2]. Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn hiếu khí. Khi bị nhiễm cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, phải phối hợp metronidazol với các thuốc kháng khuẩn khác [2]. . 4 1.1.2.2. Dược động học Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống. Khoảng 80% liều được hấp thu từ đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) khoảng 11,5 – 13,0 µg/ml trong vòng 1-3 giờ sau khi uống liều đơn 500 mg. Khoảng 10 - 20% thuốc liên kết với protein huyết tương. Metronidazol thâm nhập tốt vào các mô và dịch cơ thể, vào nước bọt và sữa mẹ. Nồng độ điều trị cũng đạt được trong dịch não tủy. Metronidazol chuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, và thải trừ qua nước tiểu một phần dưới dạng glucuronid [2]. Thời gian bán thải trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ, đối với chất chuyển hóa hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ. Sự bài tiết chủ yếu qua thận, chủ yếu là các chất chuyển hóa hydroxy và khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân [2]. Các thông số dược động học của metronidazol, thuốc đối chứng Flagyl® 250 mg và thuốc thử Amin 250 mg [11] được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử Thử (TB ± SD) Đối chứng (TB ± SD) Cmax (µg/ml) 9,99 ± 1,34 10,61 ± 1,43 Tmax (giờ) 2,17 ± 0,91 2,17 ± 0,86 t1/2(giờ) 9,15 ± 1,84 9,10 ± 0,64 Nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin sau 2 giờ uống thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin (viên nén Rodogyl® và viên nghiên cứu chứa spiramycin 769.000 UI và metronidazol 128 mg trên người tình nguyện) lần lượt là 13,5 µg/ml và 1,06 µg/ml [31]. Trên bệnh nhân viêm nha chu, sau 2 giờ uống viên nén Rodogyl® chứa spiramycin 739.000 UI và metronidazol 127,4 mg; nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin lần lượt là 11,8 µg/ml và 1,8 µg/ml [31]. . 5 1.2. Tổng quan về spiramycin I (SPY I) 1.2.1. Danh pháp, cấu trúc Cấu trúc hóa học: Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Spiramycin Thành phần Spiramycin I Spiramycin II Spiramycin III R H COCH3 CO-CH2-CH3 Công thức phân tử C43H74N2O14 C45H76N2O15 C46H78N2O15 Phân tử lượng 843,1 885,1 899,1 Danh pháp IUPAC: Spiramycin là một kháng sinh nhóm macrolid được tạo ra khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Streptomyces ambofaciens hoặc thu được bằng các phương pháp khác. Thành phần chính là (4R,5S,6S,7R,9R,10R, 11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O-(2,6dideoxy-3-C-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--Dglucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10-[[2,3,4,6tetradeoxy-4-(dimethylamino)-D-erythro-hexopyranosyl]oxy]-oxacy-clohexadeca-11,13dien-2-on (spiramycin I). Ngoài ra còn có spiramycin II (4-O-acetyl spiramycin I) và spiramycin III (4-O-propanoyl spiramycin I) [1]. 1.2.2. Tính chất lý hóa Spiramycin có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, hút ẩm nhẹ, khó tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol 96% và trong MeOH [1]. pKa = 7,9 [16]. 1.2.3. Cơ chế tác dụng và dược dộng học 1.2.3.1. Cơ chế tác dụng Spiramycin là kháng sinh nhóm macrolid. Thuốc có tác dụng kìm khuẩn trên vi khuẩn đang phân chia tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là tác dụng trên các tiểu đơn vị 50S của ribosom . 6 vi khuẩn và ngăn cản vi khuẩn tổng hợp protein. Ở những nơi có mức kháng thuốc rất thấp, spiramycin có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương, các chủng Coccus như Staphylococcus, Pneumococcus, Meningococcus, phần lớn chủng Gonococcus, 75% chủng Streptococcus và Enterococcus. Các chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria, Chlamydia, Actinomyces, một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với spiramycin. Spiramycin không có tác dụng với các vi khuẩn đường ruột Gram âm [2]. 1.2.3.2. Dược động học Spiramycin được hấp thu không hoàn toàn ở đường tiêu hóa. Thuốc uống được hấp thu khoảng 20 - 50% liều sử dụng. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng 2 - 4 giờ sau khi uống và có thể duy trì được 4 đến 6 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương sau khi uống liều 6 triệu đơn vị spiramycin đạt được tương ứng là 3,3 µg/ml sau 1,5 – 3 giờ. Thức ăn làm giảm khoảng 70% nồng độ tối đa của thuốc trong huyết thanh và làm cho thời gian đạt đỉnh chậm 2 giờ. Spiramycin phân bố rộng khắp cơ thể. Nửa đời thải trừ trung bình là 5 - 8 giờ. Thuốc thải trừ chủ yếu ở mật [2]. Các thông số dược động học của spiramycin được thống kê trên 10 người tình nguyện sau khi uống thuốc thử spiramycin 1,5 g (6 viên Rovanmycin 750000 IU của Rhone-Poulenc Rorer) [37] được trình bày trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Các thông số dược động học của spiramycin Thông số Thử (TB ± SD) Cmax (µg/ml) 2,403 ± 1,004 Tmax (giờ) 2,726± 1,234 t1/2(giờ) 6,238 ± 2,811 . 7 1.3. Tổng quan về các chất dùng làm chuẩn nội 1.3.1. Roxithromycin (ROX) Cấu trúc hóa học: Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của roxithromycin Danh pháp IUPAC: (3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S, 14R)-4-[(2,6-dideoxy-3-Cmethyl-3-O-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-10-[(E)-[(2methoxyethoxy)methoxy]imino]-3,5,7,9,11,13-hexomethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3(dimethylamino)--D-xylo-hexapyranosyl]oxy] oxacyclotetradecan-2-on [1]. Công thức phân tử: C41H76N2O15 [1]. Khối lượng phân tử: 837,0 g/mol [1]. Roxithromycin có dạng bột kết tinh trắng, đa hình, rất khó tan trong nước, dễ tan trong aceton, ethanol 96% và methylen clorid, khó tan trong dung dịch acid hydrocloric loãng [1]. pKa = 9,08 (trong kiềm mạnh); pKa = 12,46 (trong acid mạnh) [38]. 1.3.2. Tinidazol (TIN) - Cấu trúc hóa học: Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của tinidazol . 8 Danh pháp IUPAC: 1-[2-(ethylsulphonyl)ethyl]-2-methyl-5-nitro-1H-imidazol [1]. Công thức phân tử: C8H13N3O4S [1]. Khối lượng phân tử: 274,3 g/mol [1]. Tindazol có dạng bột kết tinh gần như trắng hoặc vàng nhạt, thực tế không tan trong nước, tan trong aceton và trong methylen clorid, hơi tan trong MeOH [1]. pKa = 4,7 [39]. Điểm chảy: 127 - 128 °C [39]. 1.3.3. Carbamazepin Cấu trúc hóa học: Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của carbamazepin Danh pháp IUPAC: 5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid [1]. Công thức phân tử: C15H12N2O [1]. Khối lượng phân tử: 236,3 g/mol [1]. Carbamazepin có dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình, rất khó tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton và ethanol 96% [1]. pKa = 13,9 [40]. 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng ghép khối phổ Sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS là kỹ thuật phân tích kết hợp khả năng tách của sắc ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của máy khối phổ. LC-MS/ MS đã được ứng dụng thành công trong phân tích các dược chất, nội tiết tố, độc chất và chất chuyển hóa… LC-MS/MS mang đến những đột phá lớn trong lĩnh vực phân tích định lượng trong dịch sinh học do tính đặc hiệu, độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh. Ngoài ra, LC-MS/MS cũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như mỹ phẩm, môi trường, thực phẩm… . 9 1.4.1. Hệ thống sắc ký lỏng Cột HPLC Xử lýdữ liệu liệu Bình chứa pha động Bơm mp Bộ phận tiêm mẫu Đầu dò Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống HPLC (Nguồn: https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/677482/wojnicz_aneta.pdf?sequence=1) Sắc ký lỏng là kỹ thuật phân tích phổ biến sử dụng để tách, định tính và định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Trong kỹ thuật LC, dung môi được đẩy qua cột nhờ bơm với áp suất 50 đến 350 bar. Cột LC thường có đường kính từ 2,1 mm đến 4,6 mm, chiều dài từ 30 mm đến 250 mm và hạt có kích thước từ 1,5 μm đến 5 μm. Sự phân tách xảy ra dựa trên sự tương tác của mẫu với pha động và pha tĩnh. Sắc ký lỏng tách các thành phần của mẫu dựa trên sự khác biệt về tính phân cực của chất đó đối với pha tĩnh hoặc pha động [28]. 1.4.2. Đầu dò khối phổ hai lần tứ cực 1.4.2.1. Bộ phận ion hóa phun điện (Electrospray ionization - ESI) ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất kém bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. Kỹ thuật ESI có khả năng tạo thành những ion nhiều điện tích (dương hoă ̣c âm, tùy vào cực điê ̣n thế ) [3]. Trong kỹ thuật ESI, dung dịch phân tích được phun ra khỏi đầu mao quản vào vùng có điện trường mạnh 3-6 kV ở áp suất khí quyển. Dưới ảnh hưởng của điê ̣n thế cao, ta ̣i đầ u ố ng dẫn mao quản bằng thép không rỉ (có đường kính 0,1 – 0,5 mm), mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích (dương hay âm) bị bay dung môi dần nhờ dòng khí xung quanh. Các giọt sương càng xa đầu phun càng có kích thước nhỏ và bị hút vào bộ phân tích khối lượng [3],[18]. . 10 Những phân tử nhỏ (khoảng dưới 500 Da) có một nhóm chức có khả năng mang điện tích, sẽ nhận một proton để tạo thành ion phân tử [M+H]+ khi nguồn ion hoạt động ở chế độ ion dương hoặc cho một proton để tạo thành ion phân tử [M-H]- khi ở chế độ ion âm. Khi có sự hiện diện của muối (như muối natri, kali, format, acetat, …), sẽ tạo các ion phân tử như [M+Na]+, [M+K]+, [M+format]-, [M+acetat]-…Với những phân tử lớn hơn, có thể có nhiều tâm nhận ion, ESI sẽ tạo ra những ion phân tử mang điện tích như [M+2H]2+, [M+3H]3+ [18]. Bộ phận phân tích khối phổ Dung dịch chất phân tích Hình 1.7. Sơ đồ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI (Nguồn: http:// pubs.acs.org/ac) 1.4.2.2. Bộ phận phân tích khối 2 lần tứ cực Máy khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS) gồm hai tứ cực được ghép như hình 1.8. . 11 Hình 1.8. Sơ đồ khối của đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (Nguồn: https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/677482/wojnicz_aneta.pdf?sequence=1) 1. Nguồn ion hóa. 2a. Bộ phận phân tích khối thứ nhất (Q1), 2b. Buồng va chạm (Q2) 2c. Bộ phân phân tích khối thứ hai (Q3). 3. Bộ phận phát hiện (detector) Máy khối phổ tứ cực hoạt động như một bộ lọc khối. Mỗi tứ cực có một chức năng riêng. Đầu tiên tứ cực thứ nhất (Q1) chọn khảo sát một ion cụ thể (ion mẹ) cho vào Q2 là buồng va chạm (collison cell) với dòng khí trơ (argon) để phân mảnh. Các ion trong buồng va chạm được tăng tốc nhờ áp điện thế, tạo ra năng lượng va chạm. Nhờ va chạm, các ion được gia tốc cùng với các phân tử khí trơ để tạo phân mảnh nhỏ. Quá trình này được gọi là phân mảnh do va chạm. Các mảnh ion được tạo ra ở buồng va chạm được phân tích trong tứ cực thứ hai (Q3) và đến đầu dò [15],[19]. 1.4.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ a. Kỹ thuật full scan Đây là phương pháp quét dãy khối trong khoảng thời gian nhất định, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cung cấp phổ khối tất cả ion của các chất trong suốt quá trình phân tích. Việc tìm hợp chất quan tâm có thể khó khăn vì nhiều hợp chất có cùng số khối. Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân tích định tính [18]. .