Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phan Thanh Dũng Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018 . . DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA PGS.TS Vĩnh Định Ds. Lâm Hoàng Lệ Vân . . MỤC LỤC MỞ ĐẦU 6 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ........................ 6 Mục tiêu đề tài ....................................................................................................................... 7 Tóm tắt nội dung đề tài .......................................................................................................... 8 ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ - DUNG MÔI – HÓA CHẤT...................................... 9 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................ 9 Chất chuẩn đối chiếu.............................................................................................................. 9 Dung môi hóa chất ................................................................................................................. 9 Trang thiết bị và dụng cụ ....................................................................................................... 9 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 10 1.  Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin .................. 10 2.  Thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin ................ 11 các KẾT Qủa nghiên cứu đạt được ...................................................................................... 19 1.  XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN ...................................................................................................................... 19 4.1.1.  Khảo sát điều kiện phân tích ............................................................................. 19 2.  Thẩm định quy trình định lượng ....................................................................... 24 4.2.2.  Khoảng xác định ............................................................................................... 37 4.2.3.  Độ thô ............................................................................................................... 37 3.  dỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN ...................................................................................................................... 44 4.3.1.  Thuốc thử .......................................................................................................... 44 4.3.2.  Điều kiện sắc ký ................................................................................................ 44 4.3.3.  Tiến hành .......................................................................................................... 44 4.  ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN ...................................................................................................................... 46 5.  BÀN LUẬN ...................................................................................................... 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 49 1.  KẾT LUẬN....................................................................................................... 49 2.  ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 49 . . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Cinn Cinnarizine Cinnarizin DĐVN Dược điển Việt Nam ĐL Định lượng HPLC High performance Sắc ký lỏng hiệu năng cao liquid chromatography HLN Hàm lượng nhãn HLTB Hàm lượng trung bình IR Infrared Hồng ngoại Pira Piracetam Piracetam PDA Photo diode array detector RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TB Trung bình TĐPP Thẩm định phương pháp VKN Viện kiểm nghiệm . . DANH MỤC HÌNH Hình 4.8.  Sắc kí đồ điều kiện 1.a ...................................................................................... 19 Hình 4.9.  Sắc kí đồ điều kiện 1.b ...................................................................................... 20 Hình 4.10. Sắc kí đồ điều kiện 1.c ...................................................................................... 20 Hình 4.11. Sắc kí đồ điều kiện 2 ......................................................................................... 21 Hình 4.12. Sắc kí đồ điều kiện 3.a ...................................................................................... 22 Hình 4.13. Sắc kí đồ điều kiện 3.b ...................................................................................... 23 Hình 4.14. Sắc kí đồ điều kiện 4 ......................................................................................... 24 Hình 4.15. Sắc ký đồ của mẫu trắng ................................................................................... 25 Hình 4.16. Sắc ký đồ của mẫu tá dược ............................................................................... 26 Hình 4.17. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam ............................................ 26 Hình 4.18. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin ............................................ 27 Hình 4.19. Sắc ký đồ của chuẩn piracetam ......................................................................... 27 Hình 4.20. Sắc ký đồ của chuẩn cinnarizin......................................................................... 28 Hình 4.21. Sắc kí đồ chuẩn hỗn hợp ................................................................................... 28 Hình 4.22. Sắc kí đồ mẫu thử ............................................................................................. 29 Hình 4.23. Sắc kí đồ mẫu thử thêm chuẩn .......................................................................... 29 Hình 4.24. Phổ UV-Vis của piracetam trong mẫu chuẩn ................................................... 30 Hình 4.25. Phổ UV-Vis của piracetam trong mẫu thử ........................................................ 30 Hình 4.26. Phổ UV-Vis của cinnarizin trong mẫu chuẩn ................................................... 31 Hình 4.27. Phổ UV-Vis của cinnarizin trong mẫu thử ....................................................... 31 . . DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1.  Danh mục chất chuẩn đối chiếu .......................................................................... 9 Bảng 3.2.  Danh mục hóa chất thuốc thử ............................................................................. 9 Bảng 3.3.  Danh mục trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 9 Bảng 3.4.  Các điều kiện khảo sát ...................................................................................... 11 Bảng 3.5.  Công thức mẫu tá dược ..................................................................................... 12 Bảng 3.6.  Nồng độ các dung dịch tính tuyến tính ............................................................. 14 Bảng 4.8.  Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic ....................................................... 31 Bảng 4.9.  Kết quả xử lý thống kê ...................................................................................... 32 Bảng 4.10.  Kết quả khảo sát độ đúng của piracetam .......................................................... 32 Bảng 4.11.  Kết quả khảo sát độ đúng của cinnarizin .......................................................... 33 Bảng 4.12.  Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống của piracetam .................................. 34 Bảng 4.13.  Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của cinnarizin .................................... 34 Bảng 4.14.  Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................................ 35 Bảng 4.15.  Kết quả độ chính xác trung gian của piracetam ................................................ 35 Bảng 4.16.  Kết quả độ chính xác trung gian của cinnarizin ................................................ 36 Bảng 4.17.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tốc độ dòng 0,7 ml/phút 38 Bảng 4.18.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tốc độ dòng 0,7 ml/phút 38 Bảng 4.19.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tốc độ dòng 0,9 ml/phút 39 Bảng 4.20.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tỷ lệ pha động ACN – đệm 55:45 40 Bảng 4.21.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tỷ lệ pha động ACN – đệm 55:45 40 Bảng 4.22.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tỷ lệ pha động ACN – đệm 65:35 41 Bảng 4.23.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tỷ lệ pha động ACN – đệm 65:35 41 Bảng 4.24.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở đệm pH 4,25 ......... 42 . . Bảng 4.25.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở đệm pH 4,25 ............. 42 Bảng 4.26.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở đệm pH 4,75 ......... 43 Bảng 4.27.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở đệm pH 4,75 ............. 43 Bảng 4.28.  Kết quả định lượng trên 3 lô của piracetam ...................................................... 46 Bảng 4.29.  Kết quả định lượng trên 3 lô của cinnarizin...................................................... 46 . . Báo cáo tổng kết CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC - Piracetam (2-(2-oxopyrrolidin-1 -yl)acetamid) là một dẫn xuất vòng của acid gamma amino-butyric (GABA). Thuốc có tác động lên một số chất dẫn truyền thần kinh như acetylcholin, noradrenalin, dopamin…, làm tăng hoạt động của vùng Đoan não (vùng não tham gia vào cơ chế nhận thức, học tập, trí nhớ, sự tỉnh táo và ý thức), nên có tác dụng hưng trí hay cải thiện khả năng học tập, trí nhớ; ngoài ra thuốc có tác dụng bảo vệ chống lại những rối loạn chuyển hóa do thiếu máu não cục bộ nhờ làm tăng đề kháng của não đối với tình trạng thiếu oxy. Chỉ định điều trị triệu chứng chóng mặt; suy giảm trí nhớ, kém tập trung, hoặc thiếu tỉnh táo, rối loạn hành vi, sa sút trí tuệ do nhồi máu não nhiều ổ ở người cao tuổi; điều trị hỗ trợ chứng khó đọc ở trẻ em; bổ trợ trong điều trị giật rung cơ có nguồn gốc vỏ não. - Cinnarizin ((E)-l-(diphenylmethyl)-4-(3-phenylprop-2 -enyl)piperazin) là thuốc kháng histamin (H1) có tác dụng ngăn chặn thụ thể ở cơ quan tận cùng của tiền đình, ức chế quá trình tiết histamin và acetylcholin. Cinarizin còn là chất đối kháng calci có chọn lọc, ức chế sự co tế bào cơ trơn mạch máu nên làm giãn mạch máu não, làm tăng lưu lượng máu đến các vùng, giảm tình trạng thiếu oxy não. Chỉ định phòng say tàu xe; rối loạn tiền đình như chóng mặt, ù tai, buồn nôn, nôn trong bệnh Ménière. - Viên phối hợp ngoài cho tác động hưng trí của piracetam, tác động kháng histamin của cinnarizin còn làm cho tác động cải thiện tuần hoàn não của cả hai hoạt chất tăng lên so với chế phẩm đơn thành phần. - Công ty Cổ Phần Dược phẩm Boston Việt nam hiện đang nghiên cứu sản xuất viên nang cứng chứa 2 hoạt chất này và chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm này. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin trong viên nang cứng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA”. Để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm này. . . Báo cáo tổng kết MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA. Thăm dò các điều kiện phân tích như: - Lựa chọn pha động - pH pha động - Tỉ lệ pha động - Tốc độ dòng - Bước sóng phát hiện Đưa ra qui trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin . . Báo cáo tổng kết CHƯƠNG 2: TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI - Xây dựng qui trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Khảo sát điều kiện tối ưu của quy trình định lượng 2 hoạt chất trên. - Thẩm định qui trình phân tích để ứng dụng vào việc định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.  Tính thích hợp hệ thống  Tính đặc hiệu  Tính tuyến tính  Độ chính xác  Độ đúng  Khoảng xác định của phương pháp  Độ thô . . Báo cáo tổng kết CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ - DUNG MÔI – HÓA CHẤT 3.1. Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm: BosPhezam Thành phần và hàm lượng: Mỗi viên nang chứa: Piracetam 400 mg Cinnarizin 25 mg Tá dược vừa đủ 1 viên (Tá dược: Lactose monohydrat, aerosil, magnesium stearat) Nguồn gốc: Phòng nghiên cứu phát triển – Công ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam Số lô: 010517 RD, 020517 RD, 030517 RD. 3.2. Chất chuẩn đối chiếu Bảng 3.1. Danh mục chất chuẩn đối chiếu Hoạt chất Số lô Piracetam PIR0040417 Nguồn gốc Chất chuẩn làm việc Chuẩn viện kiểm QT082 060916 nghiệm Tp.Hồ Chí Minh Cinnarizin Hàm lượng tính trên nguyên trạng (%) 99.48 99.70 3.3. Dung môi hóa chất Bảng 3.2. STT 1 2 3 4 5 Danh mục hóa chất thuốc thử Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc Acetonitril Triethylamin Acid phosphoric đậm đặc Kali dihydrophosphat Acid hydrocloric HPLC HPLC HPLC HPLC Phân tích Merck - Đức Scharlau - Tây Ban Nha Merck - Đức Scharlau - Tây Ban Nha Merck - Đức 3.4. Trang thiết bị và dụng cụ Bảng 3.3. STT Danh mục trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị . Mã hiệu Nguồn gốc 0. Báo cáo tổng kết 1 Máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu CBM 20 Alite, đầu hiệu năng cao dò PDA Eclipse XDB C18 (250  4,6 mm; 5 Nhật 2 Cột sắc kí 3 Máy đo pH Scott lab 850 Mỹ 4 Bể siêu âm VWR Mỹ 5 Cân phân tích Sartorius, độ chính xác 0,01 mg Đức 6 Cân phân tích AX-200, độ chính xác 0,1 mg Nhật 7 Cân kĩ thuật Ohaus SPS 602 Mỹ 8 Máy Độ hòa tan Lanbindia DS 14000 Ấn Độ 9 10 μm) - Agilent Mỹ Hệ thống lọc chân không Các dụng cụ thủy tinh phân tích Màng lọc 11 Cellulose Acetate 0,45 μm 12 Màng lọc Nylon Syringe 0,45 μm 3.5. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin Dựa vào cấu trúc và tính chất hóa học của hai chất cần phân tích thì piracetam có độ phân cực cao còn cinnarizin có độ phân cực thấp, đồng thời tham khảo các chuyên luận của BP 2014, EP 8.0, DĐVN IV và các tài liệu khác thì kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với hệ dung môi phân cực được lựa chọn cho quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin. Dự thảo quy trình định lượng ban đầu như sau: - Cột C8 (250 × 4,6 mm; 5 μm). . 1. Báo cáo tổng kết - Đầu dò PDA với bước sóng 227 nm. - Pha động: ACN-đệm phosphat pH 6,0 (50:50) (Đệm phosphat pH 6,0: Hòa tan 6,8 g natri dihydrophosphat vào 1000 ml nước vừa đủ, điều chỉnh về pH 6,0 bằng natri hydroxyd 10 M) - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 μl. - Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng Bảng 3.4. STT Cột 1 C8 2 C18 3 C18 4 C18 Các điều kiện khảo sát Pha động Đệm pH phosphat pH 6,0 và ACN, chạy đẳng dòng Đệm pH phosphat pH 6,0 và ACN, chạy đẳng dòng Đệm phosphat pH 4,5 và ACN, chạy đẳng dòng Đệm phosphat pH 4,5 và ACN, chạy đẳng dòng Tốc độ dòng Nhiệt độ cột 1 ml/phút Nhiệt độ phòng 1 ml/phút Nhiệt độ phòng 1 ml/phút Nhiệt độ phòng 0,8 ml/phút 45 oC 3.5.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin Quy trình được thẩm định theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013, phụ lục 8.,Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 và có tham khảo “Thông tư số 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014, Quy định việc đăng ký thuốc, phụ lục 1”. [3], [4] 3.5.2.1. Tính đặc hiệu Mục đích: Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác, tránh ảnh hưởng của các thành phần khác có trong mẫu. Dung môi pha mẫu: ACN-nước (50:50) Mẫu trắng: Hỗn hợp dung môi: ACN–nước (50:50) Chuẩn bị mẫu chuẩn: - Dung dịch chuẩn gốc cinnarizin: cân chính xác khoảng 23,5 mg chuẩn cinnarizin vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml dung môi pha mẫu, lắc đều, siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch này có nồng độ 470 µg/ml. . 2. Báo cáo tổng kết - Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: cân chính xác khoảng 75 mg chuẩn piracetam cho vào bình định mức 100 ml, hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cinnarizin vào bình trên và thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc đều siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch này chứa nồng độ piracetam là 750 µg/ml và cinnarizin là 47,0 µg/ml. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 7 ml dung môi pha mẫu, lắc đều siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch hỗn hợp này có nồng độ 300 µg/ml piracetam và 18,75 µg/ml cinnarizin. Chuẩn bị mẫu thử: Cân 20 nang, xác định khối lượng trung bình bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác khoảng một lượng thuốc bột tương đương với 75 mg piracetam vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, đề nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu được dung dịch thử đậm đặc. Hút chính xác 10 ml dịch thử đậm đặc và pha loãng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. Mẫu thử thêm chuẩn: Hút chính xác 10,0 ml dịch thử đậm đặc và 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. Chuẩn bị các mẫu tá dược: - Mẫu tá dược: Bảng 3.5. Công thức mẫu tá dược STT 1 2 3 Tá dược Lactose monohydrat Aerosil Magnesium stearat Tổng Khối lượng trong 1 viên 55 mg 5 mg 15 mg 75 mg Dung dịch mẫu tá dược: Cân chính xác khoảng 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội. Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 10 ml dịch . 3. Báo cáo tổng kết lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha loãng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. - Mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam: Cân chính xác khoảng 75 mg piracetam và 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội. Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha loãng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. - Mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin: Cân chính xác khoảng 4,7 mg cinnarizin và 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội. Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha loãng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. Tiến hành: Lần lượt tiêm vào hệ thống sắc kí: mẫu trắng, dung dịch mẫu tá dược, dung dịch mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam, dung dịch mẫu ta1 dược thêm chuẩn cinnarizin, dung dịch chuẩn piracetam, dung dịch chuẩn cinnarizin, dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn. Ghi nhận các sắc kí đồ. Yêu cầu: - Sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu tá dược không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng thời gian lưu của các pic piracetam và cinnarizin. - Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng thời gian lưu của cinnarizin. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng thời gian lưu của piracetam. - Sắc kí đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của piracetam và cinnarizin trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. - Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của piracetam và cinnarizin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. - Phổ UV tại thời gian lưu của piracetam và cinnarizin trong dung dịch thử phải phù hợp với phổ UV tại thời gian lưu của pic tương ứng trong dung dịch chuẩn. . 4. Báo cáo tổng kết - Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic piracetam và cinnarizin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu. 3.5.2.2. Khoảng tuyến tính Mục đích: Khả năng suy ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được (y) và nồng độ (x). Tiến hành: - Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn có nồng độ 60%, 80%, 100%, 120% và 140% so với nồng độ định lượng của các hoạt chất từ dung dịch chuẩn gốc ở mục 3.2.2.1. - Lần lượt hút chính xác 6,0 ml; 8,0 ml; 10 ml; 12 ml; 14 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí. Bảng 3.6. Nồng độ các dung dịch tính tuyến tính Mức nồng độ Dung dịch chuẩn gốc (ml) 60% 6,0 80% 8,0 Bình định mức (ml) 25 25 Nồng độ piracetam (μg/ ml Nồng độ cinnarizin (μg/ ml 100% 10,0 120% 12,0 140% 14,0 25 25 25 180,0 240,0 300,0 360,0 420,0 11,25 15 18,75 22,5 26,25 - Tiến hành tiêm các mẫu vào hệ thống sắc kí (mỗi mẫu tiêm 1 lần), ghi lại sắc kí đồ và xác định đáp ứng của pic. - Với mỗi hoạt chất, xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong các dung dịch chuẩn (x) và diện tích pic (y) thu được trên các sắc kí đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. + Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính dạng: = ax + b. Hệ số tương quan tuyến tính: (r). + Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi qui. + Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui. Yêu cầu: Với mỗi hoạt chất, hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,999. . 5. Báo cáo tổng kết 3.5.2.3. Độ đúng Mục đích: Biểu thị mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%) = ượ ượ ạ ạ ấ ì ạ đượ ấ à x 100% Tiến hành: - Cân khoảng 75 mg tá dược cho vào bình vào bình định mức 200 ml. Tiến hành với 9 bình cho độ đúng 80% (3 mẫu), 100% (3 mẫu), 120% (3 mẫu). - Mức nồng độ 80%: Cân chính xác khoảng 320 mg chuẩn piracetam và 20 mg chuẩn cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 240 µg/ml và cinnarizin khoảng 15 µg/ml. - Mức nồng độ 100%: Cân chính xác khoảng 400 mg chuẩn piracetam và 25 mg chuẩn cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 300 µg/ml và cinnarizin khoảng 18,75 µg/ml. - Mức nồng độ 120%: Cân chính xác khoảng 480 mg chuẩn piracetam và 30 mg chuẩn cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 360 µg/ml và cinnarizin khoảng 22,5 µg/ml. . 6. Báo cáo tổng kết Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi ở các mức nồng độ phải đạt trong khoảng: 98,0-102,0% và RSD của tỷ lệ thu hồi phải ≤ 2,0%. 3.5.2.4. Độ chính xác a. Độ lặp lại - Tính thích hợp hệ thống Mục đích: Nhằm đánh giá tính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, mẫu thử… Được đánh giá trước khi tiến hành phân tích để đảm bảo toàn bộ hệ thống có hiệu năng phù hợp. Kiểm tra dựa trên các thông số sắc kí: Diện tích pic (S), thời gian lưu (tR), hệ số bất đối (T), số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (RS). Tiến hành: Dung dịch chuẩn được chuẩn bị như mục 3.2.2.1. Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp, ghi lại các sắc ký đồ và các giá trị thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (T), số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (RS).. của các pic piracetam và cinnarizin. Tính giá trị trung bình và RSD các thông số của các lần tiêm lặp lại. Yêu cầu: Với mỗi hoạt chất, giá trị RSD của các thông số ≤ 2,0 %; 0,8 ≤ T ≤ 1,2; N > 2000; RS ≥ 2. - Độ lặp lại Mục đích: Biểu thị độ chính xác của quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm và trong khoảng thời gian ngắn. Tiến hành: Chuẩn bị 6 dung dịch thử như mục 3.2.2.1. Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn. Mỗi mẫu tiến hành tiêm 1 lần. Xác định diện tích pic, từ đó suy ra hàm lượng phần trăm tính trên nhãn của mỗi hoạt chất trong mẫu thử. Yêu cầu: RSD của hàm lượng phần trăm tính trên nhãn của mỗi hoạt chất phải ≤ 2,0%. b. Độ chính xác trung gian Mục đích: Biểu thị mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện tại nhiều ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và các trang thiết bị khác nhau. . 7. Báo cáo tổng kết Tiến hành: - Kiểm nghiệm viên thứ hai tiến hành trên một ngày khác nhau và trên một máy sắc kí lỏng khác. Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp như trong mục 3.2.2.1. Tiêm lặp lại 6 lần. Chuẩn bị 6 mẫu thử như trong mục 3.2.2.1. Mỗi mẫu thử tiêm 1 lần. - Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) của các kết quả xác định hàm lượng piracetam và cinnarizin có trong mẫu thử do mỗi kiểm nghiệm viên thử nghiệm và giữ hai kiểm nghiệm viên thử nghiệm. Yêu cầu: - Giá trị RSD (%) kết quả định lượng cuả mỗi kiểm nghiệm thử nghiệm (n=6) phải ≤ 2,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên thử nghiệm (n=12) phải ≤ 2,0%. - Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%. 3.5.2.5. Khoảng xác định Được xác lập từ khoảng tuyến tính và độ đúng. 3.5.2.6. Độ thô Mục đích: Nhằm đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích không bị ảnh hưởng bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thông số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của qui trình trong điều kiện sử dụng bình thường. Các thay đổi thường gặp: pH trong pha động, tỷ lệ thành phần pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ, cột sắc kí… Thay đổi tốc độ dòng Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm 10% tốc độ dòng. Thay đổi tỷ lệ pha động Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm 10% thành phần dung môi hữu cơ. Thay đổi pH Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm giá trị pH 0,25 Tiến hành Chuẩn bị mẫu chuẫn hỗn hợp và mẫu thử như mục 3.2.2.1. Với mỗi điều kiện khảo sát thay đổi, tiêm lặp lại liên tiếp 6 lần mẫu chuẩn hỗn hợp và 6 lần lặp lại liên tiếp mẫu thử. Ghi nhận các sắc kí đồ và các giá trị thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (T), số đĩa .