Tài liệu Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh brucella tại phõng xét nghiệm vi sinh thuộc đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học oxford thành phố hồ chí minh

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- HUỲNH THANH THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN BỆNH BRUCELLA TẠI PHÕNG XÉT NGHIỆM VI SINH THUỘC ĐƠN VỊ NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG ĐẠI HỌC OXFORD THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- HUỲNH THANH THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN BỆNH BRUCELLA TẠI PHÕNG XÉT NGHIỆM VI SINH THUỘC ĐƠN VỊ NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG ĐẠI HỌC OXFORD THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. HỒ ĐẶNG TRUNG NGHĨA 2. TS. LÊ SỸ SÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn HUỲNH THANH THẢO . i. MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i MỤC LỤC .................................................................................................... ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... v DANH MỤC BIỂU ĐỒ .............................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4 1.1. Tổng quan về bệnh Brucella ở người .................................................... 4 1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh Brucella ........................................ 23 1.4. Phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể ..................................... 27 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 30 2.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................ 30 2.2. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 30 2.3. Tiêu chuẩn chọn mẫu ......................................................................... 30 2.4. Kiểm soát sai lệch lựa chọn ................................................................ 31 2.5. Cỡ mẫu ............................................................................................... 32 2.6. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu .............................................. 32 2.7. Định nghĩa các biến số........................................................................ 32 2.8. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................... 34 2.9. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 38 2.10. Các quy trình xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu ......................... 41 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu ................................................................ 51 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ ........................................................................... 52 3.1. Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella .................. 52 . . i 3.2. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học và các yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm Brucella ................................................................................. 58 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 66 4.1. Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella .................. 66 4.2. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học và các yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm Brucella ................................................................................. 73 4.3. Hạn chế của đề tài .............................................................................. 76 KẾT LUẬN ................................................................................................. 77 KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 80 . v. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT  Từ ti ng Việt ATSH An toàn sinh học KN Kháng nguyên KT Kháng thể  Từ ti ng Anh BA blood agar BCV Brucella chemical vaccine CT Computed Tomography ELISA indirect enzyme-linked immusorbent assay IU LPS lipopolysaccharide PCR polymerase chain reaction RBT Rose Bengal test SAT serum agglutination test SMZ sulfamethoxazol TMP trimethoprim . . v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Triệu chứng của 500 bệnh nhân mắc bệnh Brucella do chủng B.menlitensis ...................................................................................................... 9 Bảng 2.1. Máy móc và thiết bị sử dụng ............................................................. 35 Bảng 2.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao ................................................................. 36 Bảng 2.3. Thuốc nhuộm Gram .......................................................................... 37 Bảng 2.4. Thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen ............................................................. 38 Bảng 3.1. Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Brucella của xét nghiệm RBT và cấy máu ....... 52 Bảng 3.2. Kết quả pha loãng huyết thanh đối với xét nghiệm RBT .................. 53 Bảng 3.3. So sánh kết quả pha loãng huyết thanh RBT đối với kết quả cấy máu .......................................................................................................................... 54 Bảng 3.4. Kết quả nhuộm Gram và Ziehl-Neelsen cải tiến đối những mẫu cấy máu dương tính ................................................................................................. 55 Bảng 3.5. Kết quả định danh vi khuẩn ............................................................... 55 Bảng 3.6. Độ tương hợp giữa hai xét nghiệm Rose Bengal và cấy máu ............. 56 Bảng 3.7. Dữ liệu thô từ thử nghiệm RBT ......................................................... 57 Bảng 3.8. Dữ liệu thống kê của RBT để chẩn đoán nhiễm Brucella so với nuôi cấy định danh vi khuẩn ...................................................................................... 57 Bảng 3.10. Tỉ lệ nhiễm Brucella theo giới tính .................................................. 62 . . vi Bảng 3.11. Tỉ lệ nhiễm Brucella theo độ tuổi .................................................... 62 Bảng 3.12. Tỉ lệ nhiễm Brucella theo nơi cư trú ................................................ 64 Bảng 3.13. Tỉ lệ nhiễm Brucella với nguy cơ tiếp xúc nguồn bệnh.................... 65 . . vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Biểu đồ phân bố giới tính .............................................................. 58 Biểu đồ 3.2. Biểu đồ phân bố nhóm tuổi............................................................ 59 Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ dân số nghiên cứu theo nơi cư trú .......................................... 60 Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ dân số theo yếu tố nguy cơ .................................................... 61 . . viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Tình hình phân bố bệnh Brucella trên thế giới ................................ 7 Hình 1.2. Tình hình phân bố bệnh Brucella ở Việt Nam................................. 8 Hình 1.3. Chụp cộng hưởng từ (MRI) của bệnh nhân nam 63 tuổi .............. 11 Hình 1.4. Hình ảnh nhuộm Ziehl – Neelsen của vi khuẩn Brucella (bên trái) và của Chamydia abortus (bên phải) ................................................................ 24 Hình 2.1. Kết quả RBT dương tính (bên trái) & âm tính (bên phải) .............. 43 Hình 2.2. Hình ảnh nhuộm Gram của Brucella ............................................ 46 Hình 2.3. Hình ảnh nhuộm Zielh-Neelsen của Brucella ............................... 49 . .1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Brucella là bệnh do các vi khuẩn Gram âm của chi Brucella gây nhiễm trên người và động vật [56]. Bệnh gây ra gánh nặng lớn cho nền kinh tế do gây hư thai, vô sinh, giảm sản xuất sữa trong chăn nuôi và cũng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng [50]. Nhiễm trùng ở người thường do tiếp xúc giữa mô bị tổn thương với mô hoặc máu của động vật bị nhiễm, hay do tiêu thụ các sản phẩm bị nhiễm bệnh như sữa và pho mát chưa tiệt trùng. Thịt của động vật mắc bệnh Brucella cũng là nguồn lây nhiễm nếu người ăn phải thịt chưa nấu chín. Một số báo cáo cũng cho thấy có sự lây truyền từ người sang người thông qua quan hệ tình dục, sữa mẹ bị nhiễm bệnh, các chế phẩm máu hay cấy ghép tủy xương của người bị nhiễm [82]. Gần đây, WHO đã coi căn bệnh bị quên lãng này là một bệnh rất nguy hiểm, hiện vẫn tồn tại ở khắp các quốc gia trên thế giới với ước tính có trên 50.000 ca nhiễm mới được ghi nhận hằng năm. Biểu hiện lâm sàng của người bị nhiễm Brucella được đặc trưng bởi sốt và các triệu chứng không đặc hiệu như đổ mồ hôi đêm, suy nhược, mất ngủ, chán ăn. Bệnh ở thể mãn tính có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến các cơ quan và để lại những biến chứng nặng nề [43], [69]. Do các biểu hiện trên lâm sàng đa dạng, triệu chứng phối hợp phức tạp, ảnh hưởng nhiều cơ quan, điều này có thể chẩn đoán sai bệnh [52]. Đáng quan tâm bệnh Brucella ở người gây ra những biến chứng nặng nề. Ở phụ nữ mang thai nếu bị nhiễm có thể dọa sẩy thai (27.7%), sẩy thai tự nhiên (12.8%), sinh non (13.9%), chết thai (8.1%), hay gây ra các dị tật bẩm sinh. Có một số trường hợp người mẹ tử vong do bị nhiễm trùng nặng [84]. Nếu không . .2 được phát hiện sớm và điều trị kịp thời thì Brucella có thể tiến triển thành thể mạn tính và ảnh hường nghiêm trọng đến nhiều hệ cơ quan trong cơ thể (huyết học, tiêu hóa gan – mật – tụy, hô hấp, tim mạch, thần kinh) [18]. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến phụ nữ có thai, với tỉ lệ bất thường thai sản lên đến hơn 60% trên tổng số phụ nữ mang thai có nhiễm Brucella [84]. Trong khi đó, hiện nay trên thế giới vẫn chưa có vacxin phòng ngừa. Theo WHO, Brucella thuộc nhóm vi sinh vật nguy cơ cấp 3. Bệnh Brucella là một trong những bệnh nhiễm trùng dễ mắc nhất trong phòng thí nghiệm do khí dung gây ra [78] . Mức độ nguy hiểm của bệnh không chỉ phụ thuộc vào độc lực của sinh vật, mà còn với số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm được xử lý. Mẫu máu và mẫu bệnh phẩm sinh thiết sử dụng cho chẩn đoán huyết thanh học hiếm khi chứa đủ số lượng vi khuẩn để gây nguy hại cho nhân viên xét nghiệm, nhưng vẫn phải được xử lý cẩn thận ở mức độ an toàn sinh học cấp 2. Đặc biệt, Brucella melitensis và Brucella suis là nguy hiểm nhất đối với con người [23]. Hiện tại một số kỹ thuật xét nghiệm đã được áp dụng để phát hiện bệnh Brucella trên thế giới như nuôi cấy định danh vi khuẩn, các xét nghiệm huyết thanh học hay ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh…, trong đó nuôi cấy định danh vi khuẩn được xem là tiêu chuẩn vàng [27], [35], [26]. Tuy nhiên ở nước ta hiện nay có rất ít các nghiên cứu về bệnh Brucella cũng như các phương pháp để chẩn đoán phát hiện bệnh. Do các triệu chứng trên lâm sàng đa dạng, không điển hình, gây khó khăn trong việc chẩn đoán bệnh. Bên cạnh đó, mỗi kỹ thuật xét nghiệm đều có ưu nhược điểm riêng, chưa có một quy trình cụ thể nào để chẩn đoán phát hiện bệnh Brucella. Do đó việc xây dựng được quy trình chẩn đoán bệnh Brucella là một việc làm cần thiết góp phần vào . .3 công tác chẩn đoán và điều trị kịp thời cho người bệnh. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, với mong muốn đưa ra được quy trình chẩn đoán bệnh Brucella bảo đảm độ chính xác, giúp ích cho các nhà lâm sàng sớm phát hiện được bệnh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu : ―Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella tại phòng xét nghiệm vi sinh thuộc đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford thành phố Hồ Chí Minh‖. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh Brucella. 2. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học và các yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm Brucella. . .4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan về bệnh Brucella ở ngƣời Bệnh Brucella là một trong những bệnh nhiễm trùng phổ biến ở những quốc gia có thu nhập từ thấp đến trung bình. Căn bệnh này là nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế và là một trở ngại cho thương mại và xuất khẩu [46]. Bệnh Brucella hiếm khi lây truyền từ người sang người [82]. Bệnh được truyền sang người thông qua việc tiêu thụ các sản phẩm sữa chưa được tiệt trùng, thông qua tiếp xúc trực tiếp với động vật bị nhiễm bệnh hoặc hít phải khí dung. Bệnh Brucella mang tính nghề nghiệp – những người có nguy cơ cao tiếp xúc với mầm bệnh như bác sĩ thú y, người chăn nuôi gia súc, người vắt sữa, người bán thịt hay nhân viên phòng thí nghiệm. Hầu hết các trường hợp mắc bệnh Brucella ở người đều liên quan đến cừu và dê bị nhiễm bệnh. 1.1.1.Lịch sử bệnh Brucella Năm 1887, General Sir David Bruce - bác sĩ người Anh, đã phân lập được Micrococcus melitensis được xem là nguyên nhân chính gây ra cái chết của những người lính Anh ở bán đảo Malta [14]. Sau đó, vi khuẩn này được đổi tên thành Brucella melitensis để vinh danh ông. Năm 1897, Bernhard Lauritz Frederik Bang phân lập được vi khuẩn gây bệnh Brucella abortus nên từ đó bệnh có tên mới là bệnh Bang. Năm 1905, bác sĩ Themistocles Zammit tại Malta xác định sữa chưa qua tiệt trùng đúng quy cách là nguồn chứa mầm bệnh [87]. Ở gia súc, bệnh còn có tên gọi là bệnh sẩy thai truyền nhiễm. . .5 Năm 1986, George F Araj đã phát triển một xét nghiệm miễn dịch liên quan đến enzyme đặc hiệu của Brucella để chẩn đoán nhanh chóng và kịp thời bệnh ở hệ thần kinh trung ương hoặc hệ thần kinh ngoại biên [3]. Năm 1989, các nhà thần kinh học thuộc tiểu vương quốc Ả Rập phát hiện có mối liên hệ giữa bệnh với các biểu hiện thần kinh ở động vật và người mắc bệnh. 1.1.2.Dịch tễ của bệnh Brucella Bệnh Brucella có tác động đáng kể đến sức khoẻ con người và động vật ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt ở Nam Mỹ, Nam Âu, Châu Phi, Trung Đông và phần lớn Châu Á [85], [57], [61]. Hơn 500.000 ca nhiễm mới ở người được báo cáo hằng năm [28]. Ở các nước công nghiệp hóa, nơi mà vệ sinh thực phẩm được kiểm soát nghiêm ngặt thì bệnh chủ yếu mang tính chất nghề nghiệp và phần lớn các trường hợp là nam giới trong độ tuổi từ 20 đến 45, bệnh thường do B. abortus hoặc B. suis gây ra. Ở các nước hoặc khu vực B. melitensis là phổ biến, toàn bộ dân số có nguy cơ mắc bệnh và nhiều trường hợp xảy ra ở phụ nữ và trẻ em. Trong các xã hội du mục, người lớn thường bị nhiễm bệnh khi còn nhỏ và không biểu hiện bệnh cấp tính, mặc dù nhiều người có thể bị di chứng do nhiễm trùng mãn tính, trẻ em chiếm một tỉ lệ cao các trường hợp cấp [23]. Tỉ lệ tử vong của bệnh theo một số nghiên cứu hồi cứu là < 1% [71]. Ở những nước có khí hậu ôn đới hoặc hàn đới, có sự thay đổi theo mùa rõ . .6 rệt, với hầu hết các trường hợp xảy ra vào mùa xuân và mùa hè. Ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh xảy ra quanh năm [23]. Tình hình trên thế giới Hiện nay, trên thế giới tỉ lệ người nhiễm Brucella không rõ. Tỉ lệ chỉ được báo cáo ở các vùng có dịch từ < 0.01 đến > 200 trên 100.000 dân [49]. Căn bệnh này hiện diện ở 4 trong 7 châu lục (Nam và Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Á, Châu Phi). Mặc dù đã được kiểm soát nghiêm ngặt ở hầu hết các quốc gia công nghiệp, nhưng nó vẫn là một vấn đề lớn ở khu vực Trung Đông, Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Châu Phi cận Sahara và một phần Châu Mỹ La Tinh – nơi các quốc gia thường không đủ nguồn lực về kinh tế cũng như chuyên môn kỹ thuật hay phương tiện để kiểm soát và tiêu diệt các nguồn lây bệnh. Ở Châu Á, bệnh Brucella phân bố rộng rãi, ngoại trừ Nhật Bản và Hàn Quốc là hai quốc gia chưa có ca bệnh nào được báo cáo. Những tổn thất về mặt kinh tế do bệnh Brucella ở người đã được tính toán ở một số quốc gia. Thiệt hại đề cập ở đây là do chi phí điều trị tại bệnh viện, thuốc men, mất thu nhập cá nhân do bệnh tật gây ra. Tại Tây Ban Nha, tổn hại về kinh tế do Brucella vào khoảng 5.030 USD/ bệnh nhân, trong khi ở New Zealand, chi phí xấp xỉ cho một bệnh nhân là 3.200 USD [66]. . .7 Hình 1.1. Tình hình phân bố bệnh Brucella trên th giới (Nguồn:https://infection.thelancet.com) Tình hình Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay, rất hiếm có các nghiên cứu về tỉ lệ bệnh Brucella ở người được báo cáo. Có ba trường hợp được báo cáo nhiễm Brucella abortus vào năm 1962 ở miền Nam Việt Nam [79], mãi đến 2017 có một bài báo được đăng trên tạp chí khoa học báo cáo về 10 ca nhiễm bệnh được phát hiện tại bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. Trong đó, bốn tỉnh có người mắc bệnh là Bình Phước (6 ca), Tây Ninh (1 ca), Hồ Chí Minh (2 ca), Long An (1 ca) [15]. Do đặc thù chăn nuôi nhỏ lẻ ở các tỉnh và việc quản lý gia súc chưa được quan tâm đúng mức. Thông tin về đường lây nhiễm cũng như các đối tượng dễ mắc bệnh Brucella còn rất hạn chế. . .8 Tây Ninh ( 1ca) Tp. Hồ Chí Minh (2 ca) Bình Phước (6ca) Long An (1 ca) Hình 1.2. Tình hình phân bố bệnh Brucella ở Việt Nam 1.1.3. Biểu hiện lâm sàng Bệnh ở người thường biểu hiện như một căn bệnh sốt cấp tính, sốt liên tục hoặc từng cơn thường >37.5oC [51], kèm theo cảm giác khó chịu, chán ăn, mệt lã. Trong trường hợp không có biện pháp điều trị cụ thể, bệnh có thể kéo dài vài tuần đến vài tháng. Điển hình, một vài dấu hiệu được mô tả như ở gan/lách/hạch to có thể xảy ra. Giai đoạn cấp tính có thể trở thành mạn tính với các đợt tái phát, diễn tiến nhiễm trùng cục bộ dai dẳng và gây nhiều biến chứng nghiêm trọng. Ở động vật, nhiễm trùng thường tập trung ở đường sinh dục, gây sẩy thai. Chất bài tiết được phóng thích ra từ đường sinh dục và đặc biệt là sữa, nguồn chính yếu gây nhiễm trùng ở người. Với bức tranh lâm sàng phức tạp, vấn đề chẩn đoán . .9 cần được hỗ trợ bởi các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm. Tính mẫn cảm với Brucella ở người phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm trạng thái miễn dịch, đường lây, số lượng, chủng loại Brucella. Về tổng thể, B. melitensis và B. suis có độc lực cao hơn B. abortus và B. canis, mặc dù các biến chứng nghiêm trọng có thể xảy ra với bất kỳ chủng Brucella nào. Bệnh diễn ra cấp tính trong khoảng một nữa các trường hợp nhiễm bệnh, với thời gian ủ bệnh có thể là vài ngày. Một nữa các trường hợp còn lại, chúng diễn ra một cách âm thầm, với các dấu hiệu và triệu chứng kéo dài từ nhiều tuần đến nhiều tháng kể từ khi bị nhiễm [77]. Các biểu hiện lâm sàng rất đa dạng, bao gồm sốt, mệt mỏi, yếu sức, đổ nhiều mồ hôi, cảm thấy khó chịu, chán ăn, sụt cân, nhức đầu, đau nhức khớp và đau lưng. Các biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất của bệnh Brucellosis là sốt (87,5–90%) và mệt mỏi (70–75%) sau đó là đổ mồ hôi, đau cơ và yếu [12]. Thông thường bệnh nhân cảm thấy khá hơn vào buổi sáng và các triệu chứng tồi tệ hơn khi dần về cuối ngày. Bảng bên dưới, mô tả các triệu chứng của 500 bệnh nhân mắc bệnh Brucella do chủng B. melitensis. Bảng 1.1. Triệu chứng của 500 bệnh nhân mắc bệnh Brucella do chủng B. melitensis [68] STT Triệu chứng Số lƣợng Phần trăm bệnh nhân (%) 1 Sốt 464 93 2 Ớn lạnh, lạnh run 410 82 3 Đổ nhiều mồ hôi 437 87 4 Đau nhức 457 91 . .10 5 Cảm giác thiếu năng lượng 473 95 6 Đau khớp, đau lưng 431 86 7 Viêm khớp 202 40 8 Đau cột sống 241 48 9 Đau đầu 403 81 10 Mất sự ngon miệng 388 78 11 Sụt cân 326 65 12 Táo bón 234 47 13 Đau bụng 225 45 14 Tiêu chảy 34 7 15 Ho 122 24 16 Đau/ viêm tinh hoàn/ mào tinh 62 21 17 Ban 72 14 18 Mất ngủ 185 37 19 Ốm yếu 127 25 20 Xanh xao 11 22 21 Hạch to 160 32 22 Lách to 125 25 23 Gan to 97 19 24 Vàng da 6 1 25 Tổn thương thần kinh trung ương 20 4 26 Âm thổi của tim 17 3 27 Viêm phổi 7 1 .