Tài liệu Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng (curcuma longa l., zingiberaceae)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ ĐOÀN XUÂN TUYỀN XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID TỪ DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. VĨNH ĐỊNH Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện Luận văn Đoàn Xuân Tuyền . . LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến Thầy PGS.TS. Vĩnh Định và Cô TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy luôn tận tâm chỉ bảo, góp ý và dành thời gian chỉnh sửa để em được hoàn chỉnh luận văn. Kính gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô khoa Dược – Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm đã dành trọn tâm huyết để truyền đạt kiến thức; hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt khóa học và thực hiện đề tài. Trân trọng cảm ơn quý Thầy Cô phản biện, quý Thầy Cô trong Hội đồng đã dành thời gian tìm hiểu và nhận xét giúp em hoàn thiện luận văn. Trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh Bình Dương đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ, hỗ trợ cho tôi hoàn thành khóa học. Chân thành cảm ơn DS.CK1. Nguyễn Khắc Sơn – công ty TNHH THƯƠNG MẠI VÀ DỊCH VỤ KHANG MINH (TP. Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk) đã tài trợ thực hiện nghiên cứu này. Xin cảm ơn Thầy TS. Phan Văn Hồ Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về dụng cụ, cũng như giúp đỡ em và các bạn chủ động được thời gian trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn, các bạn DCQ2014 đã đồng hành. Cảm ơn tập thể lớp CH Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất (2017 – 2019); anh chị em Khoa Dược phẩm – Mỹ phẩm, Khoa Vi sinh – Đông Dược của Trung tâm Kiểm nghiệm Bình Dương luôn gắn bó, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Và bằng tất cả yêu thương, xin cảm ơn gia đình đã luôn động viên và đồng hành đặc biệt là những giai đoạn khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn. Mặc dù đã rất cố gắng để thực hiện, song luận văn không tránh khỏi thiếu sót, rất mong được sự góp ý của Thầy cô để luận văn được hoàn chỉnh hơn. Một lần nữa, xin trân trọng cảm ơn! . . i TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID TỪ DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Đoàn Xuân Tuyền Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Vĩnh Định Đặt vấn đề Thân rễ Nghệ vàng tươi (Rhizoma Curcumae longae) sau khi thu lấy tinh bột, phần bã (dư phẩm) còn chứa nhiều curcuminoid. Để tận thu nguồn dư phẩm trong việc chiết xuất curcuminoid, đề tài được thực hiện nhằm đánh giá hàm lượng; khảo sát các yếu tố và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0. Quy trình được ứng dụng để chiết xuất, tinh chế thu curcuminoid có hàm lượng cao và phân lập các thành phần tinh khiết. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu Đối tượng: curcuminoid trong dư phẩm của Nghệ vàng. Phương pháp: đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình chiết curcuminoid xuất dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0, mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken. Sản phẩm sau khi chiết xuất được tinh chế đạt hàm lượng ≥ 95 % và phân lập các thành phần tinh khiết. Kết quả Điều kiện tối ưu thu được để chiết curcuminoid từ dư phẩm: thời gian chiết trong môi trường kiềm 30 phút, nồng độ dung dịch natri hydroxyd 0,05 M và dịch kiềm được acid hóa đến pH 3. Kết quả chiết xuất đánh giá tính lặp lại của quy trình thu được hàm lượng curcuminoid 7,26 ± 0,099 % phù hợp với giá trị dự đoán 7,31 %. Sản phẩm được tinh chế bằng methanol – nước (5:1) chứa hàm lượng curcuminoid 95,1 %, phân lập 3 hợp chất tinh khiết được định tính và xác định hàm lượng CUR (98,1 %), DMC (99,1 %) và BDMC (98,5 %). Kết luận Việc chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột Nghệ vàng với quy trình chiết xuất đơn giản sẽ góp phần tăng giá trị kinh tế cho người nông dân trồng nghệ. Từ khóa: curcuminoid, Curcuma longa L., tối ưu hóa, Box-Behnken, JMP 10.0. . . ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2017 – 2019 Speciality: Drug quality control and toxicology Code: 8720210 DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION OF CURCUMINOIDS EXTRACTION FROM TURMERIC POWDER RESIDUES (Curcuma longa L., Zingiberaceae) Doan Xuan Tuyen Supervisors: Assoc. Prof. Vinh Dinh Background Fresh turmeric root (Rhizoma Curcumae longae), after separating the starch, the residue (residues) contain a lot of curcuminoid. In order to utilize this source of curcuminoids extract, the study was conducted to evaluate the content; to investigate the factors and to optimize the curcuminoids extraction from the residue under the support of JMP 10.0 software. The process is applied to extract, refine curcuminoid with high content and isolate the pure ingredients. Materials – Methods Materials: curcuminoids in yellow turmeric powder residues. Methods: evaluation of curcuminoids content in yellow turmeric powder residues, investigating the factors affecting curcuminoids extraction and optimization of extraction under the support of JMP 10.0 software, Box-Behnken surface response model. The product is purified with content ≥ 95% and isolated the pure ingredients. Result The optimal conditions for curcuminoids extraction from residues: alkaline extraction time: 30 minutes, sodium hydroxyde solution concentration: 0.05 M and acidification pH: 3. The extracted results evaluate the repeatability of the proces to obtain a curcuminoid content of 7.26 ± 0.099% consistent with the predicted value of 7.31%. The product is refined by methanol – water (5:1) with curcuminoids content 95.1%, isolate 3 pure compounds that are qualitative and determine CUR (98.1%), DMC (99.1%) and BDMC (98.5%). Conclusion The extract of curcuminoids from the yellow powder residues which simple process will contribute to increasing economic value for turmeric farmers. Keywords: Curcuminoid, Curcuma longa L., Optimization, Box-Behnken, JMP 10.0. . . MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ....................................................... viii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. ix MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG ....................................................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID ............................................. 7 1.3. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CURCUMINOID ................... 10 1.3.1. Phương pháp chiết xuất thường quy ........................................................ 10 1.3.2. Phương pháp chiết xuất kết hợp sử dụng tối ưu hóa bằng phần mềm ..... 12 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CURCUMIN VÀ TINH CHẾ CURCUMINOID ...................................................................................................... 16 1.4.1. Một số phương pháp phân lập curcumin ................................................. 16 1.4.2. Một số phương pháp tinh chế curcuminoid ............................................. 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 18 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 18 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU THỬ NGHIỆM ............................................................. 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................... 19 2.3.1. Thu thập và xử lý mẫu ............................................................................. 19 2.3.2. Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng ............................... 20 2.3.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid .......................................... 22 2.3.4. Ứng dụng chiết xuất, phân lập curcuminoid từ dư phẩm ........................ 25 . i. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 29 3.1. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DƯ PHẨM BỘT NGHỆ VÀNG........................ 29 3.2. TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID ....................... 32 3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình ............................. 32 3.2.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm JMP 10.0 ........ 36 3.2.3. Đánh giá quy trình chiết xuất đã được tối ưu hóa ................................... 40 3.3. ỨNG DỤNG CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CURCUMINOID .................... 42 3.3.1. Chiết xuất curcuminoid............................................................................ 42 3.3.2. Tinh chế sản phẩm ................................................................................... 43 3.3.3. Phân lập các thành phần tinh khiết trong hỗn hợp curcuminoid ............. 46 3.3.4. Đánh giá các chất đã phân lập ................................................................. 48 3.4. BÀN LUẬN ....................................................................................................... 58 3.4.1. Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm bột nghệ vàng ............................... 58 3.4.2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng phần mềm JMP 10.0..................... 59 3.4.3. Ứng dụng chiết xuất và phân lập curcuminoid ........................................ 61 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 64 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 64 ĐỀ NGHỊ................................................................................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . . i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng việt BDMC Bisdemethoxycurcumin Curcumin III CTPT Công thức phân tử CUR Curcumin Curcumin DMC Demethoxycurcumin Curcumin II DSC Differential scanning calorimetry Phân tích nhiệt quét vi sai Hàm lượng nguyên trạng HL NT HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Infrared Spectra Quang phổ hồng ngoại Khối lượng phân tử KLPT LC_MS Liquid chromatography-mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ Rf Retention factor Thừa số chậm (Hệ số di chuyển) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKĐ Sắc ký đồ TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo tt : tt thể tích : thể tích UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến USP The United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ . . ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất curcuminoid .............................................7 Hình 2.2. Cấu trúc của một số thành phần khác trong hỗn hợp curcuminoid...........8 Hình 2.3. Cấu trúc dạng ceton (A) và enol (B) của curcuminoid .............................9 Hình 3.4. Một số bộ phận của cây Nghệ vàng và các mẫu thử ...............................19 Hình 3.5. Mô hình tương quan giữa các yếu tố với hàm lượng curcuminoid .........37 Hình 3.6. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đối với hàm lượng curcuminoid ......37 Hình 3.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng curcuminoid ...............................38 Hình 3.8. Mô hình đáp ứng bề mặt thể hiện bởi các yếu tố ....................................39 Hình 3.9. Sự tương tác giữa các yếu tố ...................................................................39 Hình 3.10. Các điều kiện tối ưu của quy trình ........................................................40 Hình 3.11. Sản phẩm kết tinh trong (A): methanol – nước (5 : 1) và (B): isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) ...................................................................................................45 Hình 3.12. Cột sắc ký rửa giải các phân đoạn trong hỗn hợp curcuminoid ............46 Hình 3.13. Tinh thể hình thành trong các phân đoạn PĐ1, PĐ3, PĐ5 ...................47 Hình 3.14. Tinh thể PĐ1, PĐ3, PĐ5 dưới kính hiển vi ..........................................48 Hình 3.15. SKLM các chất phân lập trong 3 hệ dung môi dưới ánh sáng thường .48 Hình 3.16. Phổ UV-Vis của CUR đối chiếu và PĐ1 ..............................................49 Hình 3.17. Phổ UV-Vis của DMC đối chiếu và PĐ3 .............................................49 Hình 3.18. Phổ UV-Vis của BDMC đối chiếu và PĐ5 ...........................................50 Hình 3.19. Công thức cấu tạo của CUR, DMC và BDMC .....................................54 Hình 3.20. Sắc ký đồ, đường bình đồ của PĐ1 .......................................................55 Hình 3.21. Sắc ký đồ, dường bình đồ của PĐ3 .......................................................56 Hình 3.22. Sắc ký đồ, đường bình đồ của PĐ5 .......................................................57 Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng .........................................................................................................................22 Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm.......................................42 . . DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoid .............................................9 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống .........................................29 Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường tuyến tính .......................................................30 Bảng 3.4. Tóm tắt kết quả định lượng curcuminoid trong các mẫu T1, T2, T3 ....30 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát dung dịch kiềm............................................................32 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri hydroxyd ......................32 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung dịch acid để acid hóa ..........................................33 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH dịch kiềm sau khi acid hóa ...........33 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết trong môi trường kiềm .. 34 Bảng 3.10. Kết quả ảnh hưởng của thời gian lắng tủa ............................................34 Bảng 3.11. Kết quả định lượng curcuminoid theo mô hình Box-Behnken ............36 Bảng 3.12. Kết quả chiết xuất curcuminoid theo điều kiện tối ưu hóa ...................41 Bảng 3.13. Kết quả chiết xuất curcuminoid ............................................................42 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát một số dung môi hòa tan loại tạp ..............................43 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng curcuminoid trong sản phẩm 44 Bảng 3.16. Hàm lượng curcuminoid của sản phẩm kết tinh trong hỗn hợp methanol - nước (5 : 1) và hỗn hợp isopropanol – n-hexan (1 : 1,5) ......................................45 Bảng 3.17. Kết quả khai triển sắc ký ......................................................................47 Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất PĐ1, PĐ3, PĐ5 bằng SKLM .......49 Bảng 3.19. Các nhóm chức của PĐ1, PĐ3 PĐ5 suy ra từ phổ IR ..........................50 Bảng 3.20. Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) của PĐ3 so với TLTK ...........51 Bảng 3.21. Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) của PĐ3 so với TLTK ..........52 Bảng 3.22. Phổ 1H-NMR (DMSO – d6, 500 MHz) của PĐ5 so với TLTK ..........53 Bảng 3.23. Phổ 13C-NMR (DMSO – d6, 125 MHz) của PĐ5 so với TLTK ........53 Bảng 3.24. Kết quả xác định hàm lượng của PĐ1 ..................................................56 Bảng 3.25. Kết quả xác định hàm lượng của PĐ3 ..................................................56 Bảng 3.26. Kết quả xác định hàm lượng của PĐ5 .................................................57 . . MỞ ĐẦU Thân rễ nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae) và các chế phẩm từ dược liệu này được sử dụng rất nhiều trong y học cũng như trong đời sống. Curcuminoid là một trong những hoạt chất chiết xuất từ nghệ được báo cáo có nhiều tác dụng dược lý như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư [16], [17], [27], [42], [46]. Các sản phẩm có thành phần curcuminoid được sử dụng để điều trị các bệnh viêm gan, rối loạn kinh nguyệt, động kinh [41]; ứ máu và giảm đau [12], … Qua chuyến tham quan thực tế cơ sở sản xuất các thành phẩm từ nghệ vàng tại thành phố Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk; củ nghệ tươi sau khi thu hoạch được làm sạch, cho vào máy xay, xay nhuyễn, vắt lấy nước, để lắng, phần lắng bên dưới được rửa 4 - 5 lần với nước thu tinh bột. Phần bã là một trong các nguồn dư phẩm còn lại sau khi tách lấy tinh bột chưa được tận dụng. Do tính chất của curcuminoid không tan trong nước nên chắc chắn sẽ còn lại trong bã này. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chiết xuất curcuminoid; phần lớn sử dụng dung môi hữu cơ: methanol, ethanol, ethyl acetat, aceton [17], [34], [32], [38]. Kỹ thuật chiết xuất thường gặp: soxhlet [19], siêu âm [32], vi sóng [16], CO2 siêu tới hạn [27]. Trong các dung môi, ethanol được báo cáo cho hiệu suất chiết xuất cao và thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, ethanol là dung môi hòa tan rất tốt các chất hữu cơ nên sản phẩm có nhiều tạp chất, và để thu sản phẩm có hàm lượng curcuminoid cao đòi hỏi nhiều bước tinh chế phức tạp. Ngoài ra, tính chất hóa học của curcuminoid cho thấy có thể chiết bằng dung môi kiềm sau đó tủa lại trong môi trường acid [3]. Từ thực tế yêu cầu và những lập luận trên, đề tài: “Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bột nghệ vàng Curcuma longa L., Zingiberaceae” được thực hiện. . . Mục tiêu của đề tài: 1. Đánh giá chất lượng nguồn dư phẩm 2. Tối ưu hóa quy trình quy trình chiết xuất “curcuminoid” - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất - Tối ưu hóa quy trình dưới sự hỗ trợ của phần mềm JMP 10.0, mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken 3. Ứng dụng: - Chiết xuất curcuminoid từ dư phẩm bằng quy trình tối ưu đã thu được - Phân lập các thành phần tinh khiết trong hỗn hợp curcuminoid . . 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tên khoa học Nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L. hay Curcuma domestica Val., thuộc họ Gừng Zingiberaceae [3] Bộ phận dùng Bộ phận dùng làm thuốc: Thân rễ được gọi là Khương hoàng (Rhizoma Curcumae longae) và rễ củ gọi là Uất kim (Radix Curcumae longae) [2]. Thân rễ thu hoạch vào tháng 8 – 9, cắt bỏ hết rễ, thân rễ để riêng. Muốn bảo quản lâu phải đồ hoặc hấp từ 6 – 12 (giờ), để ráo nước, phơi nắng, sấy khô [2], [3]. Trong y học cổ truyền nghệ được chế biến thành các dạng: thái phiến; sao với giấm; phiến sao vàng; chế với giấm và phèn chua [3]. Công dụng Thân rễ nghệ có tác dụng hành khí, phá huyết, chỉ thống, sinh cơ. Nghệ dùng để chữa kinh nguyệt không đều, bế kinh, đau tức sườn ngực, khó thở. Phụ nữ đau bụng sau đẻ do máu xấu không sạch, hoặc ứ huyết do sang chấn, vết thương lâu liền miệng [2]. Theo y học cổ truyền Ấn Độ, nghệ dùng để bổ và lọc máu, trị sốt rét, trộn với sữa nóng trị cảm lạnh; dùng nghệ đắp ngoài chữa các bệnh loét không đau; nước sắc thân rễ nghệ có tác dụng giảm đau trong viêm có mủ. Trong y học Trung Quốc, nghệ dược dùng làm thuốc kích thích, bổ, giảm đau, cầm máu, được chỉ định trong loét dạ dày, tiểu ra máu, ... Dùng ngoài chữa vết thương, trĩ, viêm da và nấm tóc [3]. Những công dụng có được ở trên do hoạt tính dược lý của nhiều thành phần trong nghệ, trong đó nổi bật là hợp chất curcuminoid với các tính chất: a) Hoạt tính chống oxy hóa Curcuminoid có khả năng chống oxy hóa, đã được báo cáo vào năm 1975. Hợp chất này hoạt động như một chất dập tắt các gốc tự do, bảo vệ huyết sắc tố khỏi quá trình oxy hóa. Trong ống nghiệm, curcumin có thể ức chế việc tạo ra oxy phản ứng như . . 4 anion superoxid, H2O2 và gốc nitrit bởi các đại thực bào được hoạt hóa, có vai trò quan trọng trong phản ứng viêm [17], [41]. Cơ chế chống oxy hóa của curcumin gồm một hay nhiều bước sau: trung hòa các gốc tự do; tương tác với các tác nhân oxy hóa và ngăn cản chúng phát triển; kết hợp với oxy và làm giảm khả năng phản ứng oxy hóa; ngăn cản các enzym oxy hóa như cytochrom P450; tạo phức hay phá hủy tính oxy hóa của các ion kim loại [19]. b) Hoạt tính bảo vệ thần kinh Curcumin được chứng minh có tác dụng bảo vệ thần kinh bằng cách tăng sự tăng sinh và di chuyển của các tế bào Schwann; có tác dụng giống như thuốc chống trầm cảm thông qua sự ức chế biểu hiện gen cytokin ở vỏ não trước và đồi hải mã của chuột khi bị gây stress nhẹ mãn tính [31]. c) Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và ký sinh trùng Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra một chất giống hormon là acid arachidonic. Acid arachidonic dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase sẽ bị chuyển hóa thành: prostaglandin làm giãn mạch máu, gây mẫn đỏ, trương phồng, đau nhức; thromboxan ngăn quá trình cung cấp máu và năng lượng cho tế bào; leukotrien làm tăng khả năng thấm qua mạch làm trương phồng mô dẫn đến quá trình viêm [40]. Sự liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính của curcuminoid đã được nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của liên kết đôi ở C3,4 và C3”,4” và nhóm OH ở C8,8” trên vòng benzen tạo ra hoạt tính kháng viêm cho hợp chất này. Do vậy, curcuminoid có khả năng ngăn cản enzym cyclooxygenase và lipoxygenase làm giảm viêm từ sự chuyển hóa acid arachidonic [16]. Hỗn hợp curcuminoid và từng thành phần riêng lẻ đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, trong đó curcuminoid > DMC > BDMC > CUR [1]. Curcumin ức chế sự tích hợp HIV-1 cần thiết cho sự nhân lên của virus và ức chế ánh sáng cực tím gây ra biểu hiện gen HIV. Do đó, curcumin và các chất tương tự có thể có tiềm năng phát triển thuốc mới chống lại HIV [17]. . . 5 d) Hoạt tính chống đông máu Hoạt tính chống đông máu của CUR và DMC được thể hiện qua tác dụng ức chế yếu tố hoạt hóa X và tạo thrombin trong quá trình đông máu; chưa ghi nhận hoạt tính chống đông máu của BDMC. Về cấu trúc hóa học, CUR và BDMC chỉ khác nhau sự thay thế nhóm ortho–methoxy ở vị trí 3 của nhóm phenyl, nhưng hoạt động chống oxy hóa rất khác nhau. Sự tương tác liên kết hydro giữa –OH phenol và các nhóm ortho–methoxy trong curcumin ảnh hưởng đến năng lượng liên kết -OH và sự linh động nguyên tử H của các gốc tự do, do đó curcumin trở thành một chất dập tắt gốc tự do tốt hơn so với BDMC [22]. e) Ngăn cản và điều trị ung thư Curcuminoid ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u [41]. Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Curcuminoid có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa như: gốc hydroxyl OH+, gốc peroxyl ROO+, nitric oxid NO và peroxynitrit ONO–. Curcuminoid được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển và di căn đối với một vài loại tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u [30]. f) Hoạt tính bảo vệ gan Curcumin có thể bảo vệ gan thông qua việc chống nhiễm trùng, chống oxy hóa, ức chế xơ hóa và các yếu tố gây tổn thương gan: ức chế sao chép của vius HCV bằng cách hoạt hóa heme oxyase–1; bảo vệ gan của bệnh nhân tiểu đường thông qua điều hòa chu trình chết tế bào qua trung gian nội bào gan (Afrin và cộng sự, 2015). Kết hợp Curcumin và N–acetyl cysteine giúp cải thiện tổn thương gan và thận do quá liều acetaminophen (Kheradpezhouh và cộng sự, 2010) [31]. Thành phần hóa học của nghệ Thân rễ nghệ vàng có chứa curcuminoid (2 – 8 %); tinh dầu (3,0 – 5,0 %) màu vàng nhạt, mùi thơm; chất khoáng, protein, chất béo, carbohydrat, …[35]. . . 6 Tinh dầu: Tinh dầu là thành phần hóa học có hoạt tính, tạo hương thơm cho nghệ. Thành phần của tinh dầu nghệ chủ yếu các hợp chất sesquiterpen ceton: arturmeron, α–turmeron, β–turmeron và curlon [3]. Nhiều hợp chất terpen khác cũng được xác định trong tinh dầu nghệ là α và β pinen, camphen, limonen, terpinen, caryophyllen, borneol, isoborneol, camphor, eugenol, cineol, curzerenon và curcumen [3]. Các hợp chất flavonoid: Flavonoid và glycosid của chúng đã được các nghiên cứu gần đây tìm thấy từ thân rễ nghệ. Đến nay, 18 flavonoid được phân lập và định tính, trong đó có 1 flavanonol, 5 flavon và 11 flavonol. Phần aglycon của chúng bao gồm: luteolin, apigenin, quercetin, kaempferol và myricetin [31]. Chất nhựa dầu (oleoresin): Oleoresin là hỗn hợp các hợp chất được chiết xuất bằng dung môi từ nghệ, gồm có: curcuminoid, dầu dễ bay hơi, chất béo và chất dẻo không bay hơi [35]. Curcuminoid là một trong các thành phần có hoạt tính chính từ chất nhựa dầu của nghệ. Đến nay, 50 curcuminoid đã được xác định bao gồm 3 nhóm cấu trúc: curcuminoid mạch thẳng, curcuminoid vòng và dạng kết hợp với monoterpen hoặc sesquiterpen; trong đó, dạng mạch thẳng phổ biến nhất [31]. Cấu trúc, tính chất của hợp chất này sẽ được trình bày ở mục 2.2. Các thành phần khác: Một số thành phần khác cũng đã được phân lập từ nghệ bao gồm: phenol, acid hữu cơ, các alcaloid, steroid và polysaccarid. Ngoài ra còn có nhiều chất chuyển hóa thứ cấp: monoterpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, và các sản phẩm liên hợp curcuminoid với monoterpen, sesquiterpen, phenolic, flavonoid, saccharid, steroid, alcaloid [31]. . . 7 Hỗn hợp curcuminoid là một trong các hoạt chất chính được chiết xuất từ nghệ; bao gồm 3 nhóm cấu trúc: curcuminoid mạch thẳng chiếm tỷ lệ lớn, curcuminoid vòng và dạng kết hợp với monoterpen hoặc sesquiterpen [31]. Curcuminoid trên thị trường thường chứa 3 thành phần chính: curcumin còn gọi là curcumin I chiếm 77 % (1), demethoxycurcumin hay curcumin II chiếm 17 % (2) và bisdemethoxycurcumin còn gọi là curcumin III chiếm 3 % (3). Các curcuminoid có công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 2.2. [15]. Curcumin (CUR): [1,7–bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-dien-3,5-dion], CTPT: C21H20O6, KLPT: 368,39. Demethoxycurcumin (DMC): [1-(4-hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta1,6-dien-3,5-dion], CTPT: C20H18O5, KLPT: 338,35. Bisdemethoxycurcumin (BDMC): [(1E, 6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-dien3,5 dion], CTPT: C19H16O4, KLPT: 308,33. (1) (2) (3) Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất curcuminoid (1) Curcumin, (2) Demethoxycurcumin, (3) Bisdemethoxycurcumin . . 8 (A) (B) (C) (D) (E) Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của một số thành phần khác trong hỗn hợp curcuminoid (A) Curcumalongin A; (B) Curcumalongin B; (C) Curcumalongin C; (D) Dihydrocurcumin; (E) Terpecurcumin A . . 9 Curcuminoid thường tồn tại ở 2 dạng là ceton và enol. Dạng enol có hệ thống liên hợp và có khả năng hấp thụ UV-Vis ở 410 – 430 nm [39]. (A) (B) Hình 2.3. Cấu trúc dạng ceton (A) và enol (B) của curcuminoid Hợp chất curcuminoid tan trong các dung môi dicloromethan, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, isopropanol, …; ít tan trong pentan, hexan, cyclohexan và hầu như không tan trong nước; tan trong kiềm, tạo dung dịch màu đỏ rồi ngã tím [25], [44]. Tính chất vật lý của hợp chất này được trình bày ở bảng 2.1 [1]. Bảng 2.1. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoid Thông số CUR Hình dạng DMC Tinh thể hình kim Tinh thể hình kim Màu sắc Nhiệt nóng chảy (oC) BDMC Tinh thể hình kim Vàng tươi Đỏ cam Vàng cam 179,5 – 183,5 168,5 – 170,2 213,2 – 215,5 Phổ UV-Vis: các bước sóng hấp thu tối đa trong ethanol đối với CUR, DMC và BDMC lần lượt là 429, 424 và 419 (nm) [34]. Phổ IR (cm-1): CUR, DMC, BDMC thể hiện các dao động đặc trưng trong vùng 3650 – 3200 (νO-H, nhóm chức alcol); 2950 – 2850 (νC-H của Csp3), 1850 – 1650 (νC=O, nhóm chức ceton); >3000, 1650 – 1400 (νC-H và νC=C của Csp2 nhân thơm; 1300 – 1000 (νC-O, nhóm chức alcol); 860 – 800 (δC-H nhân thơn thế 1,2,4). Dao động co dãn của liên kết C–H của C lai hoá sp3 (nhóm thế alkyl) trong vùng từ 2950 – 2850 cm-1 được sử dụng để phân biệt CUR và DMC với BDMC [13], [34]. . 10 . Các phương pháp chiết xuất curcuminoid từ nghệ đã được công bố khi curcumin lần đầu tiên được phân lập năm 1815 và cấu trúc hóa học được xác định năm 1973 [36]. Đến nay, các phương pháp chiết xuất hoạt chất này đã được cải tiến và vẫn còn đang được quan tâm. 1.3.1. Phương pháp chiết xuất thường quy Chiết bằng phương pháp Soxhlet: - Curcuminoid thu được từ bột nghệ với hiệu suất 10,66 % và độ tinh khiết 96,38 % sau khi chiết bằng ethanol 95 % trong hệ thống soxhlet (thời gian chiết 3 giờ; tỷ lệ dược liệu/dung môi 1:16) và kết tinh lại trong hỗn hợp (methanol : nước) [1]. - Bột nghệ được chiết xuất bằng các dung môi lần lượt là methanol, aceton, ethyl acetat và cloroform (tỷ lệ 6 g/250 ml) trong 7 giờ. Sản phẩm thu được có hiệu suất 5,6; 4,6; 4,5; và 4,3 (%). Trong số các dung môi, methanol cho sản phẩm có hàm lượng curcuminoid quy về curcumin cao nhất (12,39 %) [28]. - Bột nghệ được chiết xuất bằng các dung môi aceton, cloroform, hexan, methanol, ethyl acetat và hỗn hợp hexan – methanol trong 6 giờ. Aceton được lựa chọn với hiệu suất 3,49 % và hàm lượng curcuminoid trong sản phẩm thu được cao (43,5 %) [37]. - Bột nghệ (15 g) được chiết với aceton ở 60 oC trong 8 giờ, hiệu suất sản phẩm 8,29 %, hàm lượng curcuminoid quy về curcumin so với dược liệu là 6,9 % [38]. Chiết bằng phương pháp ngâm: - Curcuminoid được chiết từ bột nghệ (100 g) đã loại tinh bột bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi aceton trong 4 giờ, sau đó được loại tạp bằng hỗn hợp dicloromethan – xăng công nghiệp (1 : 1). Sản phẩm thu được có hàm lượng curcuminoid 86,69 %, hiệu suất 6,38 % [6]. - Bột nghệ khô (3 g) được chiết xuất với ethanol 70% (30ml) trên máy lắc với tốc độ 210 vòng / phút, ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày và lọc thu dịch chiết; tiến hành lặp lại .