Tài liệu Gt hstp enzym slide

CHÖÔNG III: ENZYM I. KHAÙI NIEÄM CHUNG VEÀ ENZYM 1. Ñònh nghóa Enzym laø chaát xuùc taùc sinh hoïc coù baûn chaát laø protein (biocatalisateur). Enzym cuõng laø moät loaïi protein neân noù coù ñaày ñuû caùc tính chaát cuûa protein. MEnzym = 10.000 – 1.000.000 D, ngaén nhaát laø ribonuclease 12.700 D. Deã tan, coù caáu truùc hình caàu, Ñaõ khaùm phaù khoaûng 2000 Enzym trong ñoù hôn 200 Enzym thu ñöôïc ôû daïng tinh theå. 2. Caáu taïo Enzym Phaân loaïi (1) Enzym moät thaønh phaàn (Enzym 1 caáu töû, Enzym ñôn giaûn): chæ caáu taïo töø caùc acid amin, töø chuoãi polypeptid (protein ñôn giaûn) (2) Enzym 2 thaønh phaàn (Enzym 2 caáu töû, Enzym phöùc taïp): ngoaøi chuoãi polypeptid coøn coù phaàn phi protein (protein phöùc taïp)  Chuoãi polypeptid: chaát mang, Apoenzym, Apoferment  Phi protein: nhoùm hoaït hoùa, Coenzym – cofactor, Coferment  Coenzym: phaàn phi protein coù lieân keát loûng leûo vôùi apoenzym, vaø deã daøng taùch ra khi duøng phöông phaùp thaåm tích (ña soá laø vitamin)  Cofactor (nhoùm ngoaïi): phaàn phi protein gaén vôùi apoenzym baèng lieân keát ñoàng hoùa trò beàn vöõng, vaø khoâng theå taùch ra ñoäc laäp (ion kim loaïi laø nhoùm ngoaïi) Caáu taïo  Ñieåm khaùc bieät so vôùi protein bình thöôøng laø söï hình thaønh caùc trung taâm hoaït ñoäng Trung taâm hoaït ñoäng (TTHÑ) Phaàn caáu truùc maø nôi ñoù tröïc tieáp xaûy ra caùc phaûn öùng xuùc taùc ñöôïc goïi laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa Enzym  Enzym 1 caáu töû  TTHÑ thöôøng laø caùc nhoùm ñònh chöùc coù hoaït tính cao, vaø khoâng tham gia vaøo vieäc taïo thaønh truïc chính cuûa chuoãi polypeptid. Caùc nhoùm naøy ôû xa nhau nhöng vôí caáu truùc baäc 3,4 chuùng seõ tieán laïi gaàn nhau hình thaønh TTHÑ  Nhoùm –SH cuûa cystein  Nhoùm –OH cuûa serin, tyrosin  Nhoùm -NH2 cuûa lysin  Nhoùm –COOH cuûa acid glutamic, aspartic  Voøng himidazol cuûa histidin N NH  Indol cuûa tryptophan  Caáu truùc khoâng gian cuûa Enzym bò bieán ñoåi thì khaû naêng hoaït ñoäng cuûa TTHÑ bò bieán ñoåi vaø hoaït tính cuûa Enzym cuõng bò bieán ñoåi.  Moät Enzym coù theå coù 1 hay nhieàu TTHÑ. Caùc TTHÑ treân cuøng moät Enzym coù theå gioáng nhau hoaëc khaùc nhau veà caáu taïo vaø chöùc naêng.  Enzym hai caáu töû: TTHÑ thöôøng bao goàm nhoùm ngoaïi hay coenzym vaø caùc nhoùm chöùc cuûa acid amin  Coenzym quyeát ñònh kieåu phaûn öùng hoùa hoïc vaø tröïc tieáp tham gia keát hôïp vôùi cô chaát (thuûy phaân, oxy hoùa, toång hôïp, phaân ly,…)  Apoenzym choïn loïc cô chaát vaø aûnh höôûng ñeán cöôøng ñoä phaûn öùng (protein, lipid, glucid,…) Cô cheá oå khoùa, chìa khoùa (moâ hình Fisher) TTHÑ cuûa Enzym coù caáu taïo nhaát ñònh vaø chæ cho pheùp cô chaát coù caáu taïo töông öùng keát hôïp vaøo, nhö chìa khoùa tra vaøo oå khoùa.  Khoâng giaûi thích ñöôïc caùc kieåu ñaëc hieäu nhoùm Cô cheá Koshland (moâ hình tieáp xuùc caûm öùng)  TTHÑ cuûa Enzym chæ hình thaønh trong quaù trình tieáp xuùc giöõa Enzym vaø cô chaát.  Khi chöa coù cô chaát, caùc nhoùm chöùc naêng cuûa TTHÑ chöa ôû tö theá saün saøng hoaït ñoäng.  Khi tieáp xuùc vôùi moät cô chaát naøo ñoù, caûm öùng khoâng gian seõ bieán ñoåi hình daïng cuûa Enzym, caùc nhoùm chöùc naêng ñònh höôùng thích hôïp vaø chính xaùc vaø caáu truùc khoâng gian TTHÑ thay ñoåi ñeå gaén vôùi cô chaát, thöïc hieän quaù trình xuùc taùc.  Giaûi thích thoûa ñaùng ñöôïc tính ñaëc hieäu nhoùm Trung taâm dò laäp theå (TTDLT) Ngoaøi TTHÑ laøm chöùc naêng xuùc taùc, moät trung taâm khaùc coù nhieäm vuï ñieàu chænh hoaït tính cuûa Enzym goïi laø trung taâm ñieàu chænh hay trung taâm dò laäp theå. Ñaây laø 2 caáu truùc rieâng bieät, coù taùc duïng töông hoã.  TTDLT döông: khi keát hôïp vôùi chaát dò laäp theå coù theå laøm taêng hoaït tính Enzym hoaëc laø Enzym töø traïng thaùi khoâng hoaït thaønh hoaït ñoäng.  TTDLT aâm: khi keát hôïp vôùi chaát dò laäp theå, Enzym seõ giaûm hay maát hoaït tính. Phöùc hôïp Enzym  Nhieàu chu trình chuyeån hoùa trong cô theå sinh vaät goàm nhieàu phaûn öùng lieân tieáp nhau, saûn phaåm cuûa phaûn öùng naøy laïi laø cô chaát cuûa phaûn öùng sau.  Moãi phaûn öùng ñöôïc moät Enzym xuùc taùc, vì vaäy trong chu trình seõ coù nhieàu loaïi Enzym hoaït ñoäng.  Caùc Enzym naøy hoaëc hoaït ñoäng rieâng leû, hoaëc keát hôïp vôùi nhau thaønh phöùc hôïp Enzym.  Phöùc hôïp Enzym laø toå hôïp nhieàu Enzym cuøng xuùc taùc cho moät quaù trình sinh hoùa. Tieàn Enzym (Proenzym, zimogen) Phaàn lôùn caùc Enzym ñöôïc toång hôïp trong cô theå thaønh nhöõng phaân töû Enzym coù saün hoaït tính sinh hoïc. Coù nhöõng Enzym ñöôïc toång hôïp ôû daïng trung gian chöa coù hoaït tính xuùc taùc ñöôïc goïi laø tieàn Enzym (zimogen hay proenzym). Ña soá Enzym moät caáu töû, nhaát laø Enzym cuûa heä tieâu hoùa thöôøng toàn taïi ôû traïng thaùi chöa hoaït ñoäng (Pepsinogen taïi bao töû, Trypsinogen taïi thaønh ruoät, Protrombin gaây ñoâng tuï maùu) Cô cheá chuyeån zimogen thaønh Enzym hoaït ñoäng: Taùc nhaân hoaït hoùa tieàn Enzym thöôøng laø moät Enzym khaùc, hoaëc pH. 3. Teân goïi cuûa Enzym Teân thoâng duïng  Teân goïi quen duøng, thöôøng laø teân ngöôøi tìm ra hoaëc tuøy tieän theo yù taùc giaû, khoâng theo quy öôùc naøo vaø cuõng khoâng noùi leân kieåu phaûn öùng.  Pepsin, trypsin, catalase, amilase, rennin, bromelin, papain, … Teân heä thoáng  Ñöôïc Hoäi nghò Sinh Hoùa Quoác teá laàn thöù 5 (1961) qui ñònh: Teân cô chaát + teân phaûn öùng + ase (aza, az) Pyruvat decarboxylase - khöû CO2 cuûa acid pyruvic Glucophosphat isomerase - chuyeån ñoàng phaân goác phosphate trong daãn xuaát cuûa glucose  Neáu phaûn öùng bao goàm hai söï chuyeån hoùa töông hoã thì ngöôøi ta coøn theâm vaøo sau phaàn thöù hai cuûa teân goïi moät daáu ngoaëc. COOH COOH H2N CH + O2 L-acidamin oxydoreductaza (deamin) R L-acid amin  Moãi Enzym coù 1 maõ soá C O + NH3 + R E C X. X. X. X (1) (2) (3) (4) 4 chöõ X laø 4 soá (1): nhoùm chính (lôùp) (2): nhoùm phuï (phaân lôùp) (3): phaân nhoùm phuï (toå) (4): teân Enzym, thöù töï cuûa E trong phaân nhoùm phuï I : oxihoùa khöû oxydoreductase II : chuyeån hoùa daïng ñoàng phaân, isomerase (EC.2.7.7.16 - ribonuclease) III : phaûn öùng thuûy phaân, hydrolase (EC 3.1.1.3 - thuûy phaân chaát beùo) IV : phaân caét taïo noái ñoâi, liase V : quaù trình chuyeån nhoùm chöùc, transferase VI : toång hôïp töø caùc chaát ñôn giaûn, ligase (synthetase) H2O II. VAI TROØ XUÙC TAÙC CUÛA ENZYM 1. Cô cheá taùc duïng cuûa Enzym GÑ 1: taïo phöùc ES Xaûy ra nhanh choùng vaø caàn naêng löôïng hoaït hoùa thaáp. Phöùc ES khoâng beàn, chæ toàn taïi trong moät thôøi gian ngaén. GÑ 2: hoaït hoùa cô chaát S Khi taïo thaønh phöùc ES, ôû phaân töû cô chaát coù söï chuyeån hoùa: söï phaân boá laïi noäi naêng do ñoù coù söï chuyeån vò electron, hoaëc phaù vôõ caùc lieân keát ñoàng hoùa trò, hình thaønh caùc lieân keát môùi trong phaân töû cô chaát, laøm cô chaát bò kích thích vaø saün saøng chuyeån hoùa taïo saûn phaåm. Möùc naêng löôïng hoaït hoùa cuûa giai ñoaïn naøy cuõng khoâng cao. GÑ 3: taïo saûn phaåm protein Cô chaát sau khi ñöôïc hoaït hoùa seõ bieán ñoåi veà chaát ñeå hình thaønh chaát môùi vaø phaân ly khoûi Enzym taïo thaønh saûn phaåm protein. TD: xeùt 1 phaûn öùng thuûy phaân Enzym thuûy phaân thöôøng coù 2 trung taâm hoaït ñoäng AB + HOH AOH + BH Hydrolase So saùnh vôùi chaát xuùc taùc hoùa hoïc Ñieàu kieän phaûn öùng Xuùc taùc hoùa hoïc Xuùc taùc Enzym Aùp suaát cao, nhieät ñoä cao, Aùp suaát thöôøng, nhieät ñoä thöôøng, thôøi gian daøi, noàng ñoä xuùc thôøi gian ngaén, noàng ñoä xuùc taùc taùc cao, hieäu suaát thaáp nhoû, hieäu suaát trieät ñeå acid ñaëc, nhieät ñoä cao, aùp suaát, thieát bò hieäu suaát thaáp Cellulose Glucose E. cellulase Vaøi giôø, ñieàu kieän bình thöôøng (bao töû boø nhai laïi) Hieäu quaû naêng löôïng Cao Saccharose Thaáp Q = 32.000 cal/mol Fructose + Glucose Acid, Q = 25.000 cal/mol E. invertase, Q = 9.400 cal/mol Maïnh hôn Cöôøng Yeáu hôn 1 mol Fe3+ xuùc taùc phaân ly 10-6 mol/phuùt ñoä 2H2O2 2H2O + O2 phaûn öùng 1 phaân töû catalase coù 1 nguyeân töû Fe phaân ly 5.10 6 mol/phuùt Vaän toác phaûn öùng Chaäm Tính ñaëc hieäu 1 chaát xuùc taùc coù theå xuùc Coù khaû naêng choïn loïc cô chaát raát taùc cho raát nhieàu phaûn öùng cao. Moät Enzym chæ xuùc taùc cho moät vaøi phaûn öùng hay chæ moät phaûn öùng duy nhaát. chæ coù khaû naêng taùc duïng Thay ñoåi hoaït tính döôùi taùc ñoäng gioáng nhau, vaø baûn thaân cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng, t 0, pH, chuùng laø moät hôïp chaát hoùa yeáu toá hoùa hoïc. Coù theå taùch ra töø hoïc, khoâng phaûi laø hôïp chaát cô theå sinh vaät vaø baûo toaøn hoaït sinh hoïc tính cuûa noù ôû ngoaøi cô theå Hoaït tính xuùc taùc Tinh boät Nhanh Amylase, nhieät ñoä thöôøng, vaøi phuùt Acid, ñun soâi trong vaøi giôø III. HOAÏT TÍNH CUÛA ENZYM Glucose 1. Ñònh nghóa  Hoaït tính cuûa Enzym laø khaû naêng chuyeån hoùa cô chaát thaønh saûn phaåm.  Hoaït tính caøng cao thì löôïng saûn phaåm taïo thaønh trong moät ñôn vò thôøi gian caøng nhieàu, toác ñoä phaûn öùng caøng nhanh. 2. Xaùc ñònh hoaït tính cuûa Enzym Phaûn öùng Enzym: E+S [ES] E+P [1] Xaùc ñònh vaän toác chuyeån hoùa cô chaát: löôïng cô chaát S maát ñi trong moät ñôn vò thôøi gian [2] Xaùc ñònh vaän toác taïo thaønh saûn phaåm: löôïng saûn phaåm taïo thaønh trong moät ñôn vò thôøi gian [3] Xaùc ñònh noàng ñoä thaáp nhaát cuûa E ñeå chuyeån hoùa heát moät löôïng cô chaát xaùc ñònh Hoaït tính cuûa Enzym: Soá ñôn vò hoaït ñoäng trong moät ñôn vò cheá phaåm Enzym Ñôn vò hoaït ñoäng cuûa Enzym (UI): Löôïng Enzym toái thieåu caàn thieát ñeå chuyeån hoùa 1mol cô chaát sau 1 phuùt ôû ñieàu kieän tieâu chuaån (laø ñieàu kieän t 0, pH,…thích hôïp nhaát ñeå Enzym ñoù hoaït ñoäng) Hoaït tính rieâng (hoaït ñoä rieâng): Soá ñvò hoaït ñoäng trong moät ñôn vò khoái löôïng hay theå tích cheá phaåm. Bieåu thò ñoä tinh saïch Enzym. Hoaït ñoä rieâng caøng cao, cheá phaåm Enzym caøng tinh saïch. TD: Enzym papain trong voû ñu ñuû 1 g voû ñu ñuû 30 UI/g 1g cheá phaåm I (ñaõ loaïi taïp chaát laàn I) 3000 UI/g 1g cheá phaåm II (loaïi taïp chaát laàn II) Hoaït tính phaân töû Soá ñôn vò hoaït ñoäng trong 1 mol Enzym 300000 UI/g Ñôn vò naøy chæ duøng trong moät soá tröôøng hôïp ñaëc bieät khi Enzym ñaõ ñöôïc tinh cheá ñeán daïng tinh khieát vaø coù theå xaùc ñònh ñöôïc phaân töû löôïng cuûa noù. TD: urease coù M = 480000 Hoaït tính toaøn phaàn Toång soá hoaït ñoä cuûa toaøn boä cheá phaåm Enzym, duøng ñeå tính hieäu suaát tinh cheá TD: 1kg voû ñu ñuû 5g cheá phaåm I 0.03g cheá phaåm II 30 UI/g 3000 UI/g 300000 UI/g TA = 30000 ñv TA = 15000 ñv TA = 9000 ñv 3. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính Enzym (toác ñoä phaûn öùng E) AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä Enzym Thöøa cô chaát S: vaän toác phaûn öùng seõ taêng tuyeán tính ñeán khi toaøn boä Enzym ñeàu tham gia phaûn öùng. Noàng ñoä Enzym lôùn: vaän toác phaûn öùng seõ taêng ñeán khi heát cô chaát S AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát S Phöông trình Michaelis – Menten: bieåu dieãn moái quan heä giöõa vaän toác phaûn öùng vaø noàng ñoä cô chaát [S] E K+1 K-1 K+2 + K -1 [ES] K+2 E + P haèng soá toác ñoä cuûa phaûn öùng taïo phöùc [ES] haèng soá toác ñoä cuûa phaûn öùng phaân ly phöùc [ES] ngöôïc laïi haèng soá toác ñoä cuûa phaûn öùng phaân ly phöùc thaønh saûn phaåm v = Vmax Km S K +1 [S] Km + [S] Vôùi Km = K-1 + K+2 K+1 haèng soá aùi löïc cuûa Enzym ñoái vôùi cô chaát S. Neáu coù cuøng moät luùc nhieàu Enzym cuøng taùc ñoäng leân cô chaát, Enzym naøo coù Km nhoû nhaát thì Enzym ñoù seõ taùc ñoäng xuùc taùc chuyeån hoùa cô chaát ñoù. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä  Nhieät ñoä taêng: vaän toác phaûn öùng taêng.  Vôùi ña soá Enzym: T0opt = 40-600C (T0opt E.ÑV thöôøng thaáp hôn E.TV)  Khi nhieät ñoä taêng cao, vì coù baûn chaát laø protein neân E bò bieán tính vaø maát hoaït tính xuùc taùc. T0 = 700C E baét ñaàu maát hoaït tính. o 0 T = 100 C E hoaøn toaøn maát hoaït tính.  Enzym chòu t0 cao: papain T0opt = 800C, termamyl T0opt = 900C  ÖÙng duïng cuûa yeáu toá nhieät ñoä T0opt toác ñoä phaûn öùng cao nhaát, khi caàn thu saûn phaåm p.öùng 0 T thaáp baûo quaûn E, Vpö = 0, Enzym khoâng bieán tính 0 T > 40, 50 voâ hoaït Enzym, nhieät ñoä thanh truøng. AÛnh höôûng cuûa pH pHopt laø pH maø ôû ñoù toác ñoä phaûn öùng xaûy ra cöïc ñaïi. pH opt cuûa E dao ñoäng trong moät khoaûng goïi laø vuøng pHopt Ñoái vôùi ña soá Enzym, pHopt trong vuøng acid yeáu, kieàm yeáu gaàn vuøng trung tính. Moät soá Enzym coù pHopt ôû vuøng raát acid hay raát kieàm (Pepsin - pHopt = 2; Trypsin - pHopt = 8 – 9) Vuøng pH bieán tính thuaän nghòch: vuøng pH maø hoaït tính cuûa E maát ñi, nhöng khi ñöa veà pHopt, hoaït tính E laïi ñöôïc khoâi phuïc Vuøng pH baát thuaän nghòch: vuøng pH maø hoaït tính E maát ñi khoâng theå naøo khoâi phuïc laïi. Phaûn öùng Enzym thuaän nghòch thì pHopt(T)  pHopt(N) CH3 HC OH COOH acid lactic CH3 pHopt=8 C O pHopt=6 COOH acid pyruvic Enzym lactat dehydrogenase (coenzym NAD NADH2) Tuyø cô chaát maø pHopt cuûa cuøng moät Enzym cuõng thay ñoåi Pepsin: S laø hemoglobin thì pHopt=1,8 / S laø casein thì pHopt=2,2 ÖÙùng duïng cuûa yeáu toá pH Taêng toác ñoä phaûn öùng  Taùch chieát Enzym, tinh saïch Enzym  Voâ hoaït Enzym  thuaän nghòch AÛnh höôûng cuûa chaát kích thích (chaát hoaït hoùa) pHopt pH thuaän nghòch pH baát  Chaát coù khaû naêng laøm taêng theâm toác ñoä phaûn öùng E, hoaëc bieán E töø traïng thaùi khoâng hoaït ñoäng sang traïng thaùi hoaït ñoäng.  Caùc chaát hoaït hoùa coù baûn chaát raát khaùc nhau:  Coenzym (vit): khi coù maët chuùng thì E môùi coù hoaït tính xuùc taùc  Ion kim loaïi: hoaït hoùa tröïc tieáp vì noù tham gia vaøo thaønh phaàn cuûa trung taâm hoaït ñoäng hoaëc laø caàu noái giöõa E vaø S (Ca 2+caàn ñeå hoaït hoùa E amylase, trypsin,… K +, Na+, Mg2+,Fe2+, Fe3+, Mo4+ cuõng laø chaát hoaït hoùa cho nhieàu loaïi E, TTHÑ cuûa Ascorbat oxydase laø Cu) AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm (chaát öùc cheá) Chaát boå sung vaøo phaûn öùng seõ laøm giaûm toác ñoä phaûn öùng E, hoaëc laø voâ hoaït Enzym, kyù hieäu laø I (Inhibitor)  Kìm haõm thuaän nghòch: khi coù maët chaát kìm haõm I, hoaït ñoäng E yeáu ñi, khi loaïi boû I thì hoaït tính E trôû laïi nhö cuõ.  Kìm haõm baát thuaän nghòch: khi coù maët chaát kìm haõm I, hoaït ñoäng E yeáu ñi, nhöng khi loaïi boû I, E khoâng trôû laïi hoaït tính ban ñaàu  Kìm haõm caïnh tranh: I coù caáu taïo hoùa hoïc gaàn gioáng caáu taïo hoùa hoïc cuûa cô chaát, tranh giaønh keát hôïp vôùi TTHÑ cuûa E laøm cho löôïng cô chaát S phaûn öùng vôùi E bò giaûm xuoáng, toác ñoä phaûn öùng giaûm. Noàng ñoä I caøng cao, vaän toác phản ứng caøng giaûm, cần taêng noàng ñoä cô chaát S ñeå loaïi boû taùc duïng cuûa I COOH COOH CH2 CH2 CH2 COOH (I) acid malonic COOH E.Succinat dehydrogenase COOH acid succinic  Kìm haõm khoâng caïnh tranh: CH CH COOH acid fumaric  Chaát kìm haõm I coù caáu taïo hoùa hoïc khaùc vôùi caáu taïo hoùa hoïc cuûa cô chaát  Khoâng lieân keát vôùi E ôû TTHÑ maø laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa TTHÑ laøm cho E khoâng taùc duïng ñöôïc vôùi cô chaát.  Vaän toác phaûn öùng E luùc naøy chæ tuøy thuoäc vaøo noàng ñoä I maø khoâng coù caùch khaéc phuïc.     Thí duï veà I khoâng caïnh tranh Thuoác Sulphamid trò ñau buïng tieâu chaûy. TTHÑ cuûa VSV ñöôøng ruoät chöùa p-aminobenzoic, sulphamid seõ theá choã cuûa p.a.s. laøm E bò voâ hoaït daãn ñeán VSV cheát Hôïp chaát CN keát hôïp vôùi Fe cuûa E citocromoxydase (E ñieàu khieån söï hoâ haáp) laøm voâ hoaït E naøy, ta seõ bò ngaït thôû vaø cheát. Cô chaát S hoaëc saûn phaåm P thöøa cuõng coù theå laø chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh öùc cheá hoaït ñoäng cuûa E IV. TÍNH ÑAËC HIEÄU CUÛA ENZYM 1. Ñònh nghóa: Moãi E chæ coù theå xuùc taùc chuyeån hoùa moät hay moät soá chaát nhaát ñònh theo moät kieåu phaûn öùng nhaát ñònh, tuøy vaøo caáu taïo cuûa TTHÑ. Söï löïa choïn naøy cuûa E ñöôïc goïi laø tính ñaëc hieäu cuûa E Ñaëc hieäu quang hoïc  Moãi E chæ coù theå xuùc taùc vôùi moät daïng ñoàng phaân quang hoïc Fumarat hydratase chæ taùc duïng leân daïng L-acid malic maø khoâng taùc duïng vôùi D-. Theo chieàu ngöôïc laïi, noù cuõng chæ taùc duïng leân daïng trans-a. fumaric maø khoâng taùc duïng vôùi daïng cis. COOH +H2O CH CH COOH acid fumaric (trans) -H2O COOH HO CH CH2 COOH L-acid Malic  Coù E xuùc taùc cho phaûn öùng chuyeån hoùa qua laïi giöõa caùc daïng ñoàng phaân quang hoïc. Lactat-transmerase xtaùc pöùng chuyeån D-a. lactic thaønh L-a. lactic Ñaëc hieäu kieåu phaûn öùng Moãi E chæ coù theå xuùc taùc cho 1 kieåu phaûn öùng chuyeån hoùa nhaát ñònh (E thuûy phaân, toång hôïp, chuyeån vò, ñoàng phaân hoùa, oxy hoùa khöû, …) Ñaëc hieäu kieåu cô chaát  Ñaëc hieäu nhoùm töông ñoái: Chæ caàn 1 ñieàu kieän – baûn chaát cuûa lieân keát (bromelin, lipase)  Ñaëc hieäu nhoùm töông ñoái: Caàn 2 ñieàu kieän – lieân keát vaø caáu taïo cuûa 1 trong 2 caáu töû taïo thaønh lieân keát (aminopeptidase; carboxylpeptidase; tripsin/lkeát peptid, R1=Arg, Lys; Chimotrypsin/ lkeát peptid, R1=Phe, Tryp, Tyr; Pepsin/lkeát peptid, R2=Phe, Leu)  Ñaëc hieäu tuyeät ñoái: Caàn 3 ñieàu kieän - lieân keát vaø caáu taïo cuûa caû 2 caáu töû taïo thaønh lieân keát (glucoxydase, ascorbat-oxydase, arginase, urease,…) 2. Phaân loaïi Enzym theo tính ñaëc hieäu Theå hieän qua caùch goïi teân heä thoáng vaø kyù hieäu nhoùm [1] Oxydoreductase (E xuùc taùc phaûn öùng oxy hoùa khöû) Teân chaát cho H+: teân chaát nhaän H+ + oxydoreductase [2] Transferase: (E. xuùc taùc phaûn öùng chuyeån vò)       Teân nhoùm chuyeån vò + transferase Acyltransferase: chuyeån vò nhoùm acyl qua CoA Glucotransferase: chuyeån vò nhoùm ñöôøng (pentose, hexose) Aminotransferase: chuyeån vò nhoùm NH2 (amin) Phosphotransferase: chuyeån vò goác P Metyltransferase: chuyeån vò goác –CH3 Carboxyltransferase: chuyeån vò goác –CO2 [3] Hydrolase: (E. xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân)  Peptihydrolase: thuûy phaân lieân keát peptid.  Esterase: xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân lieân keát ester (lipase, phosphatase, lecithinase,…)  Glucosidase: thuûy phaân lieân keát ester cuûa goác ñöôøng [4] Liase: (E. xuùc taùc phaûn öùng phaân caét khoâng coù H2O) Teân cô chaát + teân nhoùm bò caét + Liase Decarboxylase: caét CO2   Hydratase: loaïi boû vaø keát hôïp H2O [5] Isomerase: (E. xuùc taùc phaûn öùng ñoàng phaân hoùa)  Glucophosphatisomerase [6] Ligase /synthetase: (E. xuùc taùc phaûn öùng toång hôïp)  Asparagin synthetase: toång hôïp asparagin  Glutamin synthetase: toång hôïp glutamin VI. ÖÙNG DUÏNG CUÛA ENZYM (trong coâng ngheä thöïc phaåm) 1. Phaûn öùng thuûy phaân Phaûn öùng thuûy phaân vöøa coù nhieàu öùng duïng trong vieäc cheá bieán caùc saûn phaåm thöïc phaåm vöøa laø nguyeân nhaân gaây hö hoûng thöïc phaåm. Ñaëc ñieåm cuûa phaûn öùng thuûy phaân  Cô chaát: protein, glucid, lipid,…  Enzym: Enzym 1 caáu töû, coù nhieàu trung taâm hoaït ñoäng, caáu truùc baäc 4, soá monomer bao giôø cuõng chaün. Moät soá Enzym thuûy phaân [1]. Protease: thuûy phaân protein thaønh peptid vaø acid amin + Enzym phaân caét töø giöõa maïch: endopeptidase: pepsin, T, … + Enzym phaân caét töø ñaàu maïch: exopeptidase, carboxylpeptidase Caùc loaïi + + +           protease Enzym Enzym Enzym coù nhieàu öùng duïng: Rennin = chimotrypsin (trong daï daøy) Bromelin (trong döùa) Papain (trong voû quaû ñu ñuû) Töông: dung dòch acid amin töø protein ñaäu naønh Nöôùc maém: dung dòch acid amin töø protein caù Laøm meàm thòt: hoãn hôïp papain vaø bromelin vaø protease VSV Trong coâng ngheä thuoäc da: laøm meàm da, saïch loâng, boùng da Trong coâng ngheä tô taèm: phaù boû protein cericin ñeå taùch ñöôïc caùc sôò tô vaø laøm tô boùng Trong coâng ngheä myõ phaåm: löôïng nhoû protease laøm da toùc meàm maïi, taåy boû deã daøng caùc lôùp teá baøo giaø Xaø boâng giaët chöùa protease seõ deã daøng taåy caùc veát baån khoù giaët nhö maùu, söõa treân vaûi. Coâng ngheä söõa: caùc protease rennin ñöôïc duøng ñeå laøm phomai Trong y hoïc: protease duøng ñeå saûn xuaát moâi tröôøng dinh döôõng nuoâi vi sinh vaät, saûn xuaát huyeát thanh mieãn dòch Trong coâng ngheä laøm baùnh: protease ñöôïc ñöa vaøo ñeå thuûy phaân moät phaàn protein trong boät mì, taïo acid amin ñeå tham gia phaûn öùng melanoidin taïo höông vò, lôùp voû naâu doøn cho saûn phaåm baùnh nöôùng. [2]. Amilase: Coù 3 daïng  ,  vaø  amilase CH 2 OH CH 2 OH O H H H 1 OH OH H H OH CH 2 OH O O H H H H 4 O OH H H OH O ....... OH H H OH OH lieân keát 1,4-glucozit CH 2 OH AM AP = CH 2 OH O H H OH OH H H OH O H AM : Amilo 1 4 H 1 O OH H H OH 6 CH 2 OH CH2 O H OH H H OH AP: Amilo pectin CH 2 OH O H H 1 OH lieân keá t 1,6-glucozit O O H H H H 4 O OH H H OH O OH H H OH O......... lieân keát 1,4-glucozit -amilase (3.2.1.1): endoglucozidase  Coù trong nöôùc boït, haït naûy maàm, trong tuïy taïng, naám moác, vi khuaån.  Beàn nhieät: t0 > 700C, keùm beàn vôùi acid.  Caét lieân keát baát kyø tröø lieân keát keá beân goác khöû 1,4-glucoside, khoâng caét ñöôïc lieân keát 1,6-glucoside  Saûn phaåm thuûy phaân: glucose, alpha dextrin (maïch ngaén)  Laøm ñoä nhôùt dòch hoà giaûm nhanh neân coøn goïi laø E. dòch hoùa -amylase (3.2.1.2) : exoglucozidase  Coù trong thöïc vaät (haït,cuû)  T0opt thaáp = 50 – 600C, t0=700C maát hoaït tính, beàn acid  Caét ñöùt lieân keát 1,4-glucoside töø ñaàu khoâng khöû töøng 2 goác, chæ phaân giaûi 40-50% tinh boät, goïi laø E. ñöôøng hoùa.  Saûn phaåm thuûy phaân: maltose, beta dextrin (maïch daøi) -amylase (3.2.1.3): glucoamylase  Coù ôû vi sinh vaät, gan ñoäng vaät  pHopt = 3.5-5.5 , t0= 60-700C  Thuûy phaân töøng goác glucose, thuûy phaân ñöôïc caû lieân keát 1,4 vaø 1,6-glucoside.  Saûn phaåm thuûy phaân: glucose ÖÙng duïng cuûa E.amylase  Trong coâng ngheä saûn xuaát röôïu bia duøng ñeå ñöôøng hoùa tinh boät, thöôøng ta duøng malt, trong malt vöøa coù amilase vöøa coù tinh boät, bia töø malt laø ngon nhaát.  Saûn xuaát maïch nha, ñöôøng glucose töø tinh boät.  Laøm côm röôïu , baùnh mì, maïch AM vaø AP bò caét 1 phaàn baùnh seõ bung, nôû xoáp hôn, caét nhieàu quaù thì seõ bò xeïp baùnh..  Trong coâng ngheä deät, amilase coøn duøng ñeå taåy saïch lôùp hoà treân vaûi, laøm cho vaûi meàm hôn, deã taåy traéng, deã baét maøu nhuoäm. Ngöôøi ta coøn duøng amilase ñeå wash vaûi jean thay theá cho löïc cô hoïc. [3] Pectinase Pectin trong dòch traùi caây laøm cho ñoä nhôùt dòch quaû taêng leân, neáu saûn xuaát dòch eùp seõ bò hieäu suaát thu hoài thaáp E. pectinesterase COOCH 3 COOH O OH H H OH H H OH H O H O H COOCH 3 O O OH H H OH O H H OH H H OH O H OH H H OH E. polygalacturonase E pectinase = E. pectinesterase + E. polygalacturonase seõ thuûy phaân pectin vaø laøm ñoä nhôùt cuûa dòch quaû giaûm roõ reät (ÖD trong coâng ngheä cheá bieán nöôùc quaû. [4] Cellulase Thuûy phaân cellulose taïo saûn phaåm ñöôøng, ñöôïc boå sung vaøo caùc SP thöïc phaåm cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät giuùp thöùc aên deã tieâu hoùa hôn. Phaù huûy maøng teá baøo thöïc vaät, laøm taêng hieäu suaát trích ly caùc chaát beân trong teá baøo. Thuûy phaân pheá lieäu goã laøm thöùc aên gia suùc. Cellulase coù trong bao töû ÑV nhai laïi, thu nhaän töø canh tröôøng naám moác Asp. Oryzae, Asp. Awamori, … 2. Phaûn öùng oxy hoùa khöû Söû duïng E. oxy hoùa khöû ñeå taïo maøu saéc, höông vò ñaëc tröng cho saûn phaåm  Saûn xuaát traø (tannin - xanh, vaøng, ñoû, ñen)  Saûn xuaát chocolate töø cacao (polyphenol, phaûn öùng Maillard)  Saûn xuaát thuoác laù (nicotin  Saûn xuaát röôïu, bia, giaám, acid höõu cô,… Caùc loaïi E. oxy hoùa khöû  E. Ascorbatoxydase (oxy hoùa vitamin C)  E. Polyphenoloxydase (oxy hoùa polyphenol)  Glucooxydase (oxy hoùa glucose, loaïi oxy trong SP giaøu protein) VI. THU NHAÄN ENZYM 1. Nguyeân lieäu: Teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät vaø vi sinh vaät (n.moác, VK) 2. Quaù trình: Nuoâi caáy laáy sinh khoái hay canh tröôøng Taùch E. khoûi nguyeân lieäu (phaù vôõ voû teá baøo, trích ly) Tinh saïch E (duøng muoái baõo hoøa, tinh saïch baèng phöông phaùp maøng membrane, saéc kyù coät, saéc kyù ñieän di,…) Baûo quaûn E (ñieàu kieän laïnh, kín) 3. Coá ñònh Enzym: Haáp phuï leân chaát mang coù phaân töû löôïng lôùn Gaén treân maïng gel Gaén baèng lieân keát ñoàng hoùa trò Encapsul hoùa VII. XAÙC ÑÒNH HOAÏT TÍNH ENZYM 1. Xaùc ñònh hoaït tính amilase theo wohlgemuth Nguyeân taéc  Phöông phaùp Wohlgemuth döïa vaøo vieäc tìm noàng ñoä Enzym thaáp nhaát ñeå thuûy phaân tinh boät ñeán caùc saûn phaåm khoâng maøu vôùi Iod.  Ñôn vò Wohlgemuth laø löôïng Enzym caàn thieát ñeå thuûy phaân 1mg tinh boät sau 30 phuùt ôû 37oC coù Cl- laøm chaát hoaït hoùa. Tieán haønh khaûo saùt hoaït tính amilase  Chuaån bò daõy 10 oáng nghieäm vôùi noàng ñoä E. giaûm daàn (giaûm 2 laàn ôû oáng keá tieáp sau) coù chaát hoaït hoùa laø NaCl vaø löôïng cô chaát tinh boät baèng nhau ôû caû 10 oáng.  Tieán haønh phaûn öùng E. trong tuû ñieàu nhieät ôû 37 oC. Sau 30 phuùt laáy ra, theâm vaøo moãi oáng nghieäm 1ml H 2SO4 10% (ñeå chaám döùt hoaït tính cuûa Enzym) vaø 2 gioït I2/KI, laéc ñeàu.  Ghi nhaän oáng nghieäm coù noàng ñoä enzym nhoû nhaát xaûy ra thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät, töùc laø oáng maøu vaøng, sau noù laø oáng coù maøu ñoû tím (chöa thuûy phaân hoaøn toaøn) Tính keát quaû Löôïng Enzym ñöôïc cho vaøo oáng nghieäm ñaàu tieân: n m V 1 V2 V1 – Theå tích dòch chieát E cho vaøo oáng nghieäm ñaàu tieân V2 – Theà tích dòch chieát E, mL m – Löôïng maãu caân vaät phaåm chöùa Enzym [mg]  Moät ñôn vò Wohlgemuth (W) : W n F 5 F – ñoä pha loaõng cuûa oáng nghieäm coù noàng ñoä E nhoû nhaát thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät (oáng nghieäm coù maøu vaøng)  Soá ñôn vò Wohlgemuth trong 1mL dòch chieát E (Nw) : 2. Khaûo saùt hoaït tính protease bromelin Nw  n V 1 W Nguyeân taéc Tieán haønh phaûn öùng thuûy phaân caùc cô chaát protein (hemoglobin, casein, albumin,…) baèng E Bromelin. Xaùc ñònh löôïng saûn phaåm acid amin taïo thaønh töø phaûn öùng thoâng qua löôïng Tyrosin taïo thaønh. Do caùc peptid trong saûn phaåm thuûy phaân coù chöùa Tyr. Ñònh löôïng Tyr taïo thaønh baèng caùch so saùnh löôïng Tyr ñoù vôùi löôïng Tyr chuaån, ñaõ bieát tröôùc noàng ñoä. Duøng thuoác thöû Folin, roài so maøu treân maùy quang phoå so maøu. Tính keát quaû  Hoaït tính cuûa enzym Bromelin ñöôïc bieåu thò laø soá g tyrosin sinh ra do söï thuûy phaân Hb (Alb) cuûa enzym coù trong 1mL dung dòch hay 1mg hoãn hôïp chöùa Bromelin trong 1 phuùt.  Coâng thöùc tính hoaït tính Bromelin 450  ODm 1 x1   [UI / ml ] ODt 10 x 2 x1 – soá ml dung dòch tysosin chuaån x2 – soá ml dung dòch chöùa enzym ODm = ODm – ODk ODt = ODt – ODk ODm – ñoä haáp thu cuûa oáng maãu ODt – ñoä haáp thu cuûa oáng tyrosin chuaån ODk – ñoä haáp thu cuûa oáng khoâng