Tài liệu Tiểu luận bacillus cereus

Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Bộ môn Vệ sinh an toàn thực phẩm Tiểu luận: BACILLUS CEREUS Nhóm thực hiện: 1 Lớp học phần:2105016 GVHD: Cô Trần Thị Mai Anh  Thành phố Hồ Chí Minh – 10 / 2011  1 Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh  - Mục lục. - Nhận xét của giáo viên hướng dẫn và danh sách nhóm. PHẦN 1: LỜI MỞ ĐẦU .PHẦN 2: NỘI DUNG I.Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS. 1.Đặc điểm cấu tạo. 2.Đặc điểm nuôi cấy. 3.Tính chất sinh hóa. 4.Nguồn lây nhiễm. 5.Tính chất gây bệnh. 5.1.Độc tố. 5.2.Triệu chứng ngộ độc. 6.Cách phòng ngừa. II.Tác hại khi nhiễm BACILLUS CEREUS. 1.Cơ chế sản sinh độc tố và các loại độc tố. 2.Cơ chế gây bệnh. 2.1.Triệu chứng nôn mửa. 2.2.Triệu chứng tiêu chảy. III.Các phương pháp phát hiện BACILLUS CEREUS trong thực phẩm. 1.Đặc điểm và nguyên tắc. 2.Môi trường và hóa chất. 3.Quy trình phân tích. Định lượng BACILLUS CEREUS bằng phương pháp đếm lạc khuẩn. 3.1.Phát hiện bằng môi trường chọn lọc. 3.2.Các phản ứng khẳng định. 3.3.Các thử nghiệm phân biệt các loài trong BACILLUS CEREUS nhóm 1. 3.4.Cách tính kết quả. 2 Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh 4.Giới thiệu chung các phương pháp phân tích nhanh. 4.1 .Phương pháp miễn dịch. 4.2. Kĩ thuật latex agglutination (LA) . 4.3. Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization). 4.4. Kỹ thuật Microarray, Macroarray. 4.5 .Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR. PHẦN 3:KẾT LUẬN PHỤ LỤC. NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN. …Chân thành nhận lời góp ý của giáo viên hướng dẫn : ……………………………………………….. ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ……………………………… ĐIỂM CHO TỪNG SINH VIÊN STT MSSV HỌ TÊN NHIỆM VỤ 1. 10264641 Trần Đông Phương Phần 1 2. 10259831 Đặng Trần Thị Trúc Tiên Phần 2/I/1,2,3,4 3. 10067621 Nguyễn Nhân Tín Phần 2/I/5,6 4. 10217411 Nguyễn Thị Kim Ngân Phần 2/II 5. 10283711 Phạm Thị Nguyệt Nhi Phần 2/II 6. 10078591 Nguyễn Tuấn Huy Phần 2/III/1,2 7. 10205111 Lê Xuân Thanh Loan 8. 10274011 Trần Minh Thuận Phần 2/III/3+ Powerpoint+presentatio n Phần 2/III/4 ĐIỂM GHI CHÚ 3 Nhóm:1 9. 10249121 10. GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh Trần Thị Ý Yên Phần 3+Phụ lục Powerpoint+presentatio n CAC BAN TIM HIEU VE NHUNG VAN DE SAU DE TRA LOI CAU HOI CUA LOP 1.VK KHONG TAO GIAP MO 2.VK DE MOC 3.MOI TRUONG NA, TSA, BA, MYP, MOSSEL, NB, TSB. 4.PHAN UNG VP (+) 5.PHOSPHOLIPID LA GI 6.AP XE 7.TRYPSIN, PEPSIN 8.PHUONG PHAP MIEN DICH, KI THUAT LATEX AGGLUTINATION KI THUAT LAI PHAN TU KI THUAT MICROARRAY KI THUAT REAL TIME PCR BCET - RPLA REAL TIME - PCR 9.PHUONG PHAP DEM KHUAN LAC PHUONG PHAP MNP 10.PEPTONE DEM 11.KHANG NGUYEN KHANG THE CHAY DIEN DI PHẦN 1:MỞ ĐẦU Ngay cả khi có Pháp lệnh về Thực phẩm, hàng năm nước ta vẫn ghi nhận được hàng vạn ca mắc bệnh truyền qua đường thực phẩm. Đó là một vấn đề cấp thiết của xã hội cần được quan tâm nhiều hơn nữa.Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là do ý thứccủa con người còn quá kém và thực phẩm được sử dụng không an toàn.Vi khuẩn là nguồn gây bệnh chính qua con đường thực phẩm (các vi sinh vật gây bệnh) mà cơ quan thuốc và thực phẩm Mỹ khuyến cáo dân chúng về tác hại, cách phát hiện, cơ chế lây nhiễm và cách đề phòng. Một trong số những loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm đó là Bacillus cereus. Là một vi khuẩn gram dương, hìnhque, kị khí, sinh bào tử. Bacillus cereus có thể làm người bị ngộ độc ói mửa tiêu chảy và trường hợp nặng hơn có thể gây tử vong.Bất cứ ai cũng có nguy cơ lây nhiễm Bacillus cereus. Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ biến. Người ăn phải thực phẩm này thường mắc hai bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn mửa.Dạng ngộ độc gây tiêu chảy bị gây ra bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus có cấu trúc phân tử protein lớn. Loại vi khuẩn này rất dễ dính lên các nhóm thực phẩm như thịt, sữa, rau và cá. Triệu chứng chính củaloại ngộ độc này là đại tiện ra nước và cơ bụng bị chuột rút khoảng sau 615 tiếng kể từ lúc ăn phải. Triệu chứng này kéo dài khoảng 24tiếng. Nôn mửa cũng có thể đi kèm nhưng thường hiếm gặp đối với loại ngộ độc gây tiêu chảy bởi Bacillus cereus trọng lượng phân tử lớn. 4 Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh Các bác sỹ đã ghi nhận được các biểu hiện lâm sàng đáng chú ý khác với những người bị ngộ độc bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus một khi không được chữa trị kịp thời và triệt để. Đó là biểu hiện viêm vú, chứng viêm nhiễm nặng, hoại tử, viêm màng não, nhiễmtrùng, viêm mô tế bào, viêm toàn mắt, áp xe phổi, viêm màng trong tim. Đối với trẻ sơ sinh, thậm chí có nguy cơ gây tử vong. Cách phòng cơ bản để khỏi nhiễm loại vi khuẩn Bacillus cereus là cần thận trọng khâu chế biến thực phẩm và nấu nướng. Về khả năng kiểm tra vi sinh vật Bacillus cereus ở Việt Nam, theo Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), cả nước chỉ có 38 trung tâm y tế dự phòng tỉnh, chiếm 60% tỉnh thành, có năng lực kiểm nghiệm. Viện ở 4 vùng miền đều đủ năng lực xét nghiệm loại vi khuẩn này. Từ 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5.600.000 ca tiêu chảy do nhiễm trùng qua thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12 ca tử vong. Thựctế, theo các chuyên gia, phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố. Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm, cấu trúc của Bacillus cereus mang ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc phòng chống và chữa trị những trường hợp bị ngộ độc do nhiễm Bacillus cereus. Với phạm vi là một đề tài tiểu luận, nhóm chúng em chỉ đề cập đến Bacillus cereus trong Bacillus nhóm 1. PHẦN 2:NỘI DUNG I.Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS. Bacillius cereus là vi khuẩn Gram dương khi chưa trưởng thành nhưng có thể thành Gram âm khi chúng già, hình que, sinh bào tử, kị khí, có khắp nơi trong tự nhiên. Một số chuẩn vi khuẩn Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chuẩn lại có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật, theo phân loại quốc tế thuộc giới Bacteria, ngành (phylum) firmicutes, lớp (Class) Bacilli, bộ (Order) Bacillales, họ (Family) Bacillaceaem,chi (Genius) Bacillus, loài (Species) Cereus. Trong chi Bacillus này ngoài loài Cereus còn có một số loài như:  Bacillus subtilis 5 Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh  Bacillus coagulans  Bacillus thuringiensis  Bacillus natto 6  Paenibacillus larvae Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. 1. Đặc điểm cấu tạo BACILLUS CEREUS. Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. Hình 1: Bacillus cereus trên kính hiển vi Hình 2: Khuẩn lạc Bacillus cereus trên môi trường BA 2. Đặc điểm nuôi cấy. Là loại vi khuẩn dễ mộc Hiếu khí và kị khí tùy nghi. Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC. pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng. Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường Mossel Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP 3. Tính chất sinh hóa. Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol. Khử nitrat thành nitrit. Phản ứng VP (+) . Phân giải Tyroxin . Catalase (+), Citrate (+) . Mọc trên NB + 0,001% lyzozym . 4.Nguồồn lây nhiễễm. Bào tử của B. cereus có thể được tìm thấấy rộng rãi trong tự nhiên, bao gồồm các mấẫu bụi, bẩn, cấy ngũ cồấc, nước, vv, vì vậy nó là một chấất gấy ồ nhiêẫm ph ổ biêấn các mặt hàng nguyên liệu nồng nghiệp.Mức độ ồ nhiêẫm bình th ường là <100/g.3 Các loại thực phẩm giàu tinh bột, chẳng hạn như gạo hoặc khoai tấy, thường đi kèm với nồn B. cereus (nồn) bùng phát độc tồấ. Do quá trình chuẩn bị, một trong những chiêấc xe thực phẩm phổ biêấn nhấất để truyêồn bệnh nồn B. cereus là cơm chiên, và đã có nhiêồu đợt bùng phát báo cáo. Các bào tử của B. cereus được kích hoạt trong việc chuẩn bị ban đấồu của lúa gạo, mà nêấu bảo quản ở nhi ệt đ ộ l ạm dụng (khoảng 59 đêấn 104 ° F hoặc 15 đêấn 40 ° C) cho một th ời gian dài, seẫ phát triển nhanh và sản xuấất một loạiđộc tồấ là nhiệt ổn định và seẫ khồng được bấất hoạt trong quá trình nấấu ăn tiêấp theo. Các chủng gấy tiêu chảy đã được tìm thấấy trong một lựa chọn th ực ph ẩm hơn. Các nguồồn thồng thường bao gồồm các mặt hàng th ịt và rau, súp và các s ản ph ẩm sữa. Khồng giồấng như các chấất độc nồn, chấất độc tiêu ch ảy b ị phá h ủy trong nấấu ăn. Nêấu các bào tử kinh nghiệm điêồu kiện cho phép tăng tr ưởng, h ọ có th ể phát triển đêấn mức độ chấất độc được sản xuấất. 5.Tính chất gây bệnh. Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. 5.1. Độc tố. Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố  Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.  Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipid có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.  Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt. 5.2. Triệu chứng trúng độc.  Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây ngộ độc.  Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ. Nếu ngộ độc do độc tố vi khuẩn, dấu hiệu ngộ độc rõ hơn: nôn, mệt mỏi, nhức đầu, mạch nhanh…nếu không điều trị kịp thời bệnh sẽ tiến triển nặng. Có 2 triệu chứng lâm sàng ngộ độc do Bacillus cereus gây ra: Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt. Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ. Tiêu chảy có thể là một khối lượng nhỏ hoặc dồi dào và chảy nước. Loại này được gọi là "ủ bệnh dài" hay hình thức của bệnh tiêu chảy, và nó tương tự như ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Clostridium perfringens Trường hợp nhiễm type 2: Loại này được đặc trưng bởi buồn nôn và nôn mửa và đau bụng và có một khoảng thời gian ủ bệnh là từ 1 đến 6 giờ, thời gian kéo dài bệnh là 8 đến 10 giờ và trung bình là 9 giờ. Nó giống như Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) gây ngộ độc thực phẩm trong các biểu hiện triệu chứng của nó và thời gian ủ bệnh. Đây là "hình thức ủ bệnh ngắn" hoặc hình thức nôn của bệnh. Đặc tính Bền với nhiệt pH Tính nhạy Bảng so sánh độc tố type 1 và type 2 Type 1 Type 2 0 0 45 /30 phút 120 /90 phút Ổn định ở pH 4-11 Ổn định pH 2-11 Nhạy với enzyme Kháng pepsin và trypsin protease và trypsin 6. Cách phòng ngừa. Thực phẩm có nguồn gốc gây bệnh là sản phẩm ngũ cốc, nước sôt, hoa quả, xôi, cơm dĩa. Ở Mỹ cơm chiên được xem là một trong những nguyên nhân hàng đầu của nhiễm vi khuẩn Bacillus cereus. Chính vì thế mà có người còn gọi là hội chứng cơm chiên. Những loại thực phẩm dễ nhiễm này bào tử Bacillus cereus thường có mặt và có thể sống sót nếu đun nấu không kỹ. Trực khuẩn còn sống sót phát triển sẽ sinh độc tố. Sau khi nấu đối với thực phẩm ướt, nếu ướp lạnh không đủ độ cũng làm vi khuẩn tăng nhanh. Cần thực hiện các biện pháp kiểm soát đề phòng bệnh như đảm bảo vệ sinh khi chế biến, nấu ăn thích hợp và lưu trữ thực phẩm, đặc biệt là gạo đã nấu chín để sử dụng sau này, bảo quản lạnh ở nhiệt độ thích hợp với thực phẩm chưa ăn ngay và không nên chế biến thực phẩm quá lâu trước khi ăn. II.Tác hại khi nhiễm BACILLUS CEREUS. 1.Cơ chế sản sinh độc tố và các loại độc tố. Vì ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (19881993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%). Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995. Bacillus cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến. Nó được phân lập từ nhiều nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, các và các sản phẩm từ thịt cá cũng vậy. Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định Bacillus cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1 và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau, một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng Bacillus cereus gây ra lại xuất hiện ở các công nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc. Ngày nay, bệnh này liên quan đến triệu chứng gây nôn mửa do Bacillus cereus. Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó, những ngộ độc khác do Bacillus cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau. 2. Cơ chế gây bệnh. 2.1 Triệu chứng nôn mửa. Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa được thể hiện ở bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1) Emetic Syndrome Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus Tên của độc tố Cereulide Liều nhiễm độc Số lương B.C 105-108tb/g thực phẩm Khối lượng độc tố 12-32 μg/kg Cấu trúc của độ Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-DAla-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa Thời kỳ ủ bệnh ½ - 5h Khoảng thời gian mang bệnh 6-24h Sinh kháng thể Không (none) Hoạt động sinhlàhọc trên người Cereulide (polypeptide) tên của một độc tố quan trọngGây gây ra nôn triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình Cơ quan nhận cảm 5-HT3 sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13Cytotoxic (13C) liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) No trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino trên hay oxy qua HEp-2 NMR và ESI – MS của phương pháp kính quang Hoạt động tếacid bào Hoạt động không phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của bào nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40%13C kết hợp trong D-Ala của Cereulide. Khả năng chịulà nhiệt 90 phút ở 1210C Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu chứng nôn mửa và triệu chảy.protein Phần lớn những ngộ độc do Bacillus Ảnh hưởng của sự chứng phântiêugiải Không cereus gây ra chỉ mới phát hiện sau này. Cereulide được biết đến với cấu trúc bậc 1, Việc sản sinh ra tuần độchoàn, tố với như thếlậpnào known, với 1 dodecadepsipeptide 12 góc thể trung tâm.(not Hóa học lập thể được ra từ sản phẩm thủy phân là các dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D-Ala, L-Obutchỉprobably enzymatically) Val và L-Val. Đó là 1 ion Kali mạnh, nó liên kết yếu với các ion Li+, ion Na+, ion Cs+, nhưng với ion Rb+ nó lại liên kết mạnh nhất, hơn bất kỳ ion kim loại kiềm nào. Cereulide tạo cấu trúc bậc 2 từ NMR và sự tính toán cơ học các phân tử được biểu thị ở hình 1. Độc tố này là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP và các enzyme lien quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau. Chúng ta bắt đầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương trình phòng chống ngộ độc thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tương tự như dodecadepsipeptide, valinomycin. Agata – một trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình phát triển và sinh độc tố của Bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từ CADM (hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía). Người ta nhận thấy rằng, Bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc bậc 1 và 3 amino acid Val, Leu và Thr là cần thiết. Những nghiên cứu khác về quá trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ là cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm ra phương pháp ngăn chặn những ngộ độc từ thực phẩm. Xét đoán từ cấu trúc của 1, tiền thân của D-Ala, L-O-Val và D-O-Leu sẽ lien quan đến các amino acid như L-Ala, L-Val, và L-Leu. Trong thí nghiệm này chú trọng đến sinh tổng hợp trung gian của 3 amino acid là LVal, L-Leu, và L-Ala (0.1g/L có đến 99% nguyên tử cacbon ở dạng13C trong cacboxylic, tất cả 15 amino acid còn lại (0.1g/L), K2HPO4 (5g/L) và MgSO4.7H2O (0.05g/L), được tiến hành ở nhiệt độ 300C và thời gian là 24h, giữ ở tốc độ lắc là 200 rpm thu được 2mg cereulide có cùng độc tính ở điều kiện này đã được đánh dấu để phục vụ cho phân tích các nghiên cứu tiếp theo.1H NMR của mẫu này là đồng nhất với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ chất đồng vị của cacbon13C. ESI mass (interpreting Electrospray Mass Spectra) của nó xuất hiện ở 7 đỉnh trung tâm với m/z là 1201.48 khá hơn mức bình thường M + K với m/z là 1191.55 (thể hiện ở hình 2), vì vậy cứ trung bình 10 đơn vị mass thì cao hơn bởi vì sự kết hợp cao của13Cs. Chính vì sự liên hợp cao của13Cs vào phân tử cereulide đã thúc đẩy chúng ta trong việc đo lường mức quang phổ NMR13C của ion K+ trong phức hợp CDCl3 để đạt được mức quang phổ như ở hình 3, với số liệu đáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-Leu), 175.7 (L-Val) và 176.2 (D-Ala) đã được chuyển sang mối tương quan giữa C-H của nó. Tương ứng với cường độ của 3 cacbon (C6, C9, C12) của L-O-Val, D-O-Leu và L-Val là nhiều hơn hai lần C6 D-Ala. Tương tự với việc làm riêng các thí nghiệm đã đạt được với bức xạ β proton của 4 hợp phần amino hay oxy – acid. Loại bỏ các kết quả đạt được với α proton của O-Val ở 4.61 ppm với bức xạ β-H của nó ở 2.30 ppm để thay đổi từ bộ ba sang bộ kép (J=3.8 Hz cặp với13C của O- Val). Bức xạ β-H của L-Val ở 2.24 ppm đã làm thay đổi α proton của Val ở 3.82 ppm từ bộ năm thành bộ ba (J=5 Hz). Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợp cao cacbonyl cacbon của13C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val. Chưa có kết quả chính xác nào về sự kết hợp của13C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối với Ala và O- Leu. Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của nó (4.27 ppm) giống như sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và 5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra) có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến 100%). Sự chiếu xạ của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dải sóng tự nhiên của nó quá rộng. Tuy nhiên, quang phổ NMR của13C và những thí nghiệm riêng lẻ là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp13C tiền amino acid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide. Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b protons. Một phần trăm sự kết hợp của13C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản phẩm thủy phân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng kiềm cereulide (1) với 0.1N KOH (hoặc 1N NH4OH) ở rt trong 30 phút. Các sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D- Ala và L-O-Val-L-Val, được phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước MS/MS ở trên Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK). Để làm được điều này các chất đồng vị thừa và13C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha loãng mẫu đó đến độ hòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2% acid formic trước khi bị electrospray ở 5μL/phút. Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ quá trình sinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B. cereus. Một trong những khả năng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α- keto acid và sau đó biến đổi thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạo thành D-Ala. Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì L- Ala là không cần thiết cho B. cereus. Nghiên cứu này có thể giải thích đến 95% sự kết hợp để tạo thành D-O-Leu, L-O-Val, và L-Val khoảng (40%) sự kết hợp để tạo thành D-Ala. 2.1. Triệu chứng tiêu chảy. Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá trình sinh trưởng của Bacillus cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng Bacillus cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng. Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu. Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc xuất hiện những triệu chứng của bệnh. Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong bảng 1-2. Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đường ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau. Diarrheal Syndrome Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh têu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus Đặc tnh Liêều gây nhiêễm 105/g hoặc /ml Độc tốố được sản sinh ra Trong ruột non Loại độc tốố Protein Thời kỳ ủ bệnh 8– 16h Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h Triệu chứng Đau bụng dai Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người bị ảnh hưởng dẳng, đi têu nhiêều nước, thỉnh thoảng sau khi ăn thịt hầm với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105. Lần đầu tiên bùng phát (1992), 17 – 24 buốề n người nốnbị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu nặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h). Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995 khi mà 152 trong số 252 người Na-uy bị ảnh hưởng trong suốt thời gian tham gia giải vô địch về trượt tuyết. Các đối thủ trẻ tuổi (16 – 19 tuổi) bị nhiễm triệu chứng này sau hơn 24 giờ ủ bệnh và họ bị đau từ 1 đến vài ngày. Bào tử của Bacillus cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào Bacillus cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát. Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ Bacillus cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm Bacillus cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan. Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ Bacillus cereus trong tương lai gần. Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào. III.Các phương pháp phát hiện BACILLUS CEREUS trong thực phẩm. 1.Đặc điểm và nguyên tắc. Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa. Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân Ltyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme. 3.Qui trình phân tích. 25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/ 1phút để có độ pha loãng 10.1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp. Định lượng Bacillus Cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 3.1.Phát hiện bằng môi trường chọn lọc: Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC. MYP: do Bacillus cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành. MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định Bacillus cereus. 3.2.Các phản ứng khẳng định: Nhuộm Gram: Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu. Các bước nhuộm Gram: Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương ứn với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô -> đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi (tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa) Tương tự cho hai chủng VSV đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủng đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+). Có hai phương pháp nhuộm Gram: Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây -> dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên 1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài giây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư bằng giấy lọc. Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng dd crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút -> khử màu bằng cách xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút. Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli). Bacillus cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có dạng bào tử nang. Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau. Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí). Hình 1:Thí nghiệm khả năng khử nitrate. Hình 2:Thí nghiệm lên men glucose. Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth -> ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit) Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử. Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính với nitrite. Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetylguanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine. Các bước tiến hành: Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặc đến 10 ngày. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại thuốc thử VP là: • Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH. • Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH. • Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h. Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt môi trường.