Tài liệu Luận văn tốt nghiệp khảo sát môi trường nuôi cấy mô nha đam (aloe sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HOC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ NHA ĐAM (ALOE Sp.) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ XUÂN MAI SINH VIÊN THỰC HIỆN TRƯƠNG QUỲNH TRANG MSSV: 3064488 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 05/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Trương Quỳnh Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trải qua bốn năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên của gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, lời cảm ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến: cô Trần Thị Xuân Mai, cán bộ hướng dẫn, cũng là cố vấn học tập của lớp đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn: Cô Nguyễn Thị Liên và cô Nguyễn Thị Pha, phòng Công nghệ gen thực vật, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài. Các quý thầy cô đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Cám ơn ba mẹ và gia đình đã luôn quan tâm, lo lắng và động viên con trong suốt quá trình học tập. Thân gửi đến tập thể lớp Công nghệ sinh học K32 lời cảm ơn chân thành cùng lời chúc tốt đẹp nhất. Xin chân thành cảm ơn! Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Nha đam (Aloe sp.) là một loại dược liệu quý được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Tuy nhiên tỷ lệ nảy chồi từ cây mẹ quá chậm mà nhu cầu ứng dụng thì ngày càng tăng do đó nuôi cấy mô là một lựa chọn thích hợp để nhân nhanh số lượng. Đề tài “Khảo sát môi trường nuôi cấy mô Nha đam” được thực hiện dựa trên các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới. Qua kết quả thí nghiệm, nhận thấy phương pháp khử trùng kết hợp nước Javel 30 phút + cồn 70o 1 phút đạt tỷ lệ mẫu cấy sống 80% . Thí nghiệm cũng xác định được bộ phận có khả năng tạo chồi ở cây Nha đam là phần đoạn thân gần gốc. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi là môi trường MS bổ sung 1mg/l BA và 0.2mg/l IBA với tỷ lệ nảy chồi 80%, số chồi 3.3 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường đó cũng cho kết quả cao nhất trong giai đoạn nhân chồi (3.61 chồi/mẫu) sau 4 tuần. Số rễ tạo thành tối đa là 7.28 rễ/cây với chiều dài trung bình là 6.07cm sau 4 tuần cấy trong môi trường MS có bổ sung 0.2mg/l NAA, 100% mẫu cấy đều tạo rễ. Khi thuần dưỡng trong nhà lưới đạt tỷ lệ cây sống là 75%. i Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ TÓM LƯỢC.................................................................................................................i MỤC LỤC...................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. v DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................................vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU..........................................................................................1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................2 2.1. Sơ lược về cây Nha đam .....................................................................................2 2.1.1. Nguồn gốc..................................................................................................2 2.1.2. Phân loại ................................................................................................. 2 2.1.3. Đặc điểm hình thái.....................................................................................2 2.1.4. Giá trị dược liệu........................................................................................3 2.1.5. Một số sản phẩm từ Nha đam có mặt trên thị trường................................5 2.1.6. 2.2. Phương pháp nhân giống thông thường ..................................................8 Phương pháp nhân giống in vitro .......................................................................8 2.2.1. Khái niệm và mục đích của vi nhân giống .................................................8 2.2.2. Các giai đoạn của vi nhân giống..............................................................8 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô .................................. 11 2.2.4. Tính ưu việt của vi nhân giống (Nguyễn Đức Thành, 2000)..................... 17 2.3. Những đề tài nghiên cứu về nuôi cấy mô Nha đam ............................................ 17 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................ 19 3.1. Phương tiện thí nghiệm ...................................................................................... 19 3.1.1. Giống...................................................................................................... 19 3.1.2. Thời gian và địa điểm ............................................................................. 19 3.1.3. Phương tiện ............................................................................................ 19 ii Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 3.2. Phương pháp thí nghiệm .................................................................................... 20 3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả của các phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy ............................................................................................................. 20 3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát, đánh giá bộ phận nào của cây Nha đam (đoạn thân gần gốc-1cm, đoạn thân mang lá-2cm) và môi trường nào thích hợp cho sự tạo chồi.............................................................................................................. 23 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự nhân chồi.................................................................................................................... 23 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ ................................................................................................................. 23 3.2.5. Thí nghiệm 5: Chuyển cây sang vườn ươm............................................... 24 3.3. Xử lý số liệu ...................................................................................................... 24 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 25 4.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả của các phương pháp khử trùng..................................... 25 4.2. Thí nghiệm 2: Kết quả tạo chồi từ các bộ phận của cây Nha đam (đoạn thân gần gốc-1cm, đoạn thân mang lá-2cm) và môi trường nuôi cấy ........................................ 26  Đánh giá đoạn nào của cây Nha đam có khả năng tạo chồi .......................... 26  Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy từ đoạn thân.................................................................................................... 27 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự nhân chồi................. 29 4.3.1. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến sự gia tăng chồi từ mỗi chồi cấy..................................................................................................................... 29 4.3.2. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến sự gia tăng chiều cao chồi sau 4 tuần nuôi cấy............................................................................................ 31 4.3.3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến sự gia tăng số lá ở mỗi chồi sau 4 tuần nuôi cấy............................................................................................ 32 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ ......... 33 4.5. Thí nghiệm 5: Chuyển cây sang vườn ươm ......................................................... 35 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 36 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 36 iii Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 37 PHỤ LỤC...................................................................................................................... iv Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các nghiệm thức môi trường ở thí nghiệm 2 ................................................ 22 Bảng 2: Các nghiệm thức môi trường ở thí nghiệm 3 ................................................ 23 Bảng 3: Các nghiệm thức môi trường ở thí nghiệm 4................................................. 24 Bảng 4: Hiệu quả của các phương pháp khử trùng mẫu cấy ....................................... 26 Bảng 5: Hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự tạo chồi sau 4 tuần nuôi cấy ..................................................................................................................... 27 Bảng 6: Số chồi gia tăng sau 2 tuần và 4 tuần nuôi cấy .............................................. 30 Bảng 7: Chiều cao gia tăng sau 2 đến 4 tuần nuôi cấy................................................ 32 Bảng 8: Số lá gia tăng sau 2 đến 4 tuần nuôi cấy........................................................ 32 v Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cây Nha đam dùng làm mẫu cấy.................................................................. 19 Hình 2. Mẫu Nha đam............................................................................................... 22 Hình 3: Mẫu cấy Nha đam ........................................................................................ 27 Hình 4: Hình thành chồi Nha đam sau 4 tuần ............................................................ 27 Hình 5: Sự tạo chồi của mẫu sau 4 tuần nuôi cấy ....................................................... 29 Hình 6: Sự tạo chồi của mẫu sau 4 tuần nuôi cấy ....................................................... 31 Hình 7: Số rễ tạo thành trung bình mỗi nghiệm thức sau 4 tuần ................................. 34 Hình 8: Chiều dài rễ trung bình mỗi nghiệm thức sau 4 tuần...................................... 34 Hình 9: Sự hình thành rễ từ chồi cấy sau 4 tuần ......................................................... 35 vi Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT MS: Murashige & Skoog IBA: indole-3-butyric acid IAA: indole-3-acetic acid NAA: alpha-napthalen acetic acid KIN: kinetin BA: benzynaldenine vii Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU Nha đam (Aloe sp.) còn gọi là lô hội, long tu, lưỡi hổ, …thuộc họ Liliaceae là một loại dược liệu quý không chỉ ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm mà còn dùng trong mỹ phẩm. Theo Phạm Hoàng Hộ (1972), cây Nha đam có thể chữa được nhiều chứng bệnh như sốt, viêm khớp, viêm gan, rối loạn tiêu hóa, ...đặc biệt là các bệnh về da nên được sử dụng để sản xuất các loại mỹ phẩm bảo vệ và dưỡng da, ngoài ra còn dùng làm nước giải khát… Do Nha đam đã được ứng dụng rộng rãi trong chăm sóc sức khỏe con người nên các sản phẩm của nha đam ngày càng được thu hút mạnh trên thị trường trong và ngoài nước. Nha đam được trồng nhiều ở vùng Bắc Phi, Tây Ấn Độ, Nam Mỹ…Ở nước ta cây Nha đam được trồng rãi rác khắp nơi nhưng chủ yếu là qui mô hộ gia đình với số lượng ít. Vị thuốc lô hội trích từ nhựa cây Nha đam dùng trong cả đông y và tây y ở nước ta chủ yếu nhập từ Pháp hay Trung Quốc (Đỗ Tất Lợi, 2003). Nhu cầu ứng dụng cây Nha đam ngày càng tăng mà phương pháp nhân giống truyền thống thì gặp hai bất lợi cơ bản là tỷ lệ nảy chồi ở nách lá chậm và cây đực bất dục (Aggarwal và Barna, 2004). Vượt qua phương pháp nhân giống truyền thống với những ưu điểm vượt trội về thời gian lẫn chất lượng sản phẩm thì phương pháp nuôi cấy mô là một lựa chọn thích hợp. Phương pháp này có khả năng tạo nguồn giống thuần nhất mang đặc điểm của cây mẹ và tạo ra số lượng lớn trong thời gian ngắn, đồng thời còn giúp bảo tồn được nguồn gen trong ống nghiệm. Vi nhân giống cây Nha đam đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả trên thế giới như D. Aggarwal et al, D. Hashemabadi et al, S.Ahemed et al…Mỗi tác giả tìm được những môi trường nuôi cấy khác nhau. Do đó đề tài “Khảo sát môi trường nuôi cấy mô Nha đam” được thực hiện dựa trên các kết quả nghiên cứu đó nhằm mục tiêu: Khảo sát, đánh giá bộ phận của cây Nha đam có khả năng tạo chồi nhiều nhất. Khảo sát hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân chồi. Khảo sát hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình tạo rễ. Tỷ lệ cây sống giai đoạn thuần dưỡng trong nhà lưới. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về cây Nha đam 2.1.1. Nguồn gốc Cây Lô hội có nguồn gốc từ châu Phi. Từ “Lô hội” bắt nguồn từ tiếng Ả Rập là “aneh” có nghĩa là “vị đắng” (Thục Nhàn, 2005). Cách đây 4000 năm về trước, người dân châu Phi đã dùng Lô hội làm thuốc xổ. Ở phương Tây từ trước thế kỷ 15 trước công nguyên, cây Lô hội đã được dùng làm thuốc chữa các loại bệnh và được liệt vào phương thuốc dân gian. Đến thế kỷ 16 cây Lô hội bắt đầu xuất hiện chính thức trên các tài liệu y học. Địa lý chủ yếu của cây Lô hội là đông Châu Phi, Ấn Độ, Châu Mỹ…Ở nước ta cây Lô hội mọc nhiều ở các vùng Phan Thiết, Phan Rang, Phan Rí thuộc các tỉnh Bình Thuận, Ninh Thuận (Đỗ Tất Lợi, 2003). 2.1.2. Phân loại  Ngành: Plantae  Lớp: Liliopsida hay momocotyledonae  Bộ: Liliales  Họ: Liliaceae  Chi: Aloe  Loài: Aloe sp. 2.1.3. Đặc điểm hình thái  Aloe L. (Võ Văn Chi, 2003) Cây không thân hoặc thân hóa gỗ, đơn hay phân nhánh ít. Lá nạc, giòn, có mép hóa sụn hoặc có răng nhưng không gây ngứa, hầu như xếp hình hoa thị. Cụm hoa ở nách lá, hoa thõng xuống, màu vàng hay đỏ, rất ít khi trắng, đều, bao hoa có sáu mảnh dính cao, nhị ít khi thò; bầu tròn. Quả nang mở ô bằng ba kẽ nứt; hạt dẹp, thường có cánh. Gồm 363 loài nhiệt đới mọc chủ yếu ở Nam Phi, Madagaxca, Ả Rập. Ở nước ta có 2 loài. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT  A. vera L. var. chinensis (Haw.) Berg Cỏ mập màu xanh tươi. Thân ngắn, lá dày mọng nước, hình ngọn giáo, đầu nhọn, bìa có gai, mặt trên lõm, có đốm trắng. Trục phát hoa cao khoảng 1m, mang hoa ở chót, hoa có dạng chùm hoặc hoa đơn, màu vàng hoặc xanh, đứng rồi thòng xuống, ống hoa dài bằng phiến hoa. Quả nang hình trứng thuôn, màu xanh, khi già màu nâu, chứa nhiều hạt (Phạm Hoàng Hộ, 1972). Loài của Bắc Phi, Tây Ấn Độ, được trồng khắp nước ta, chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (Võ Văn Chi, 2003). 2.1.4 Giá trị dược liệu Các nhà nghiên cứu đã nhận định có ít nhất 200 – 300 loại Nha đam khác nhau. Trong tất các loại này, chỉ có 5 loại được cho rằng có giá trị dược liệu là: Aloe Barbadensis Miller, Aloe Perryi Baker, Aloe Ferox, Aloe Arborescens và Aloe Saponaria. Aloe Barbadensis Miller là loại được sử dụng rộng rãi nhất. Những nghiên cứu cho thấy rằng lá Nha đam chứa khoảng 75 thành phần khác nhau, những thành phần này có giá trị dược liệu khác nhau và được chia thành các nhóm sau (Peter Atherton, 1997)  Ligin: Là một loại cellulose được tìm thấy trong chất gel có tác dụng thu hút chất dinh dưỡng của Nha đam vào các tổ chức tế bào dưới da, kích hoạt hệ thống tuần hoàn máu dưới da dễ lưu thông hơn.  Saponins: Tạo bọt như xà phòng khi trộn và khuấy với nước. Được sử dụng trong chất tẩy rửa, chất tạo bọt xà phòng và có khả năng thanh lọc các độc tố trong cơ thể.  Anthraquinon: Có khoảng 12 loại trong chất nhựa Nha đam là Aloin, Isobarbaloin, Anthracene, Emodin, Ester của Cinnamonic acid, Chrysophanic acid, Barbaloin, Anthranol, Aloetic acid, Aloe Emodin, Ethereal oil và Resistannol. Những chất này có tác dụng nhuận tràng, giảm đau… chúng còn có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và kháng virus.  Khoáng chất Canxi: Cần thiết cho xương và răng. Mangan: Thành phần cấu tạo của những chất cần thiết cho sự hoạt động của những enzymes khác. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Natri: Đảm bảo cho chất lỏng trong cơ thể không quá acid cũng không quá kiềm. Đồng: làm cho ion Fe có khả năng hoạt động như là chất mang oxy trong tế bào hồng cầu. Magie: được sử dụng bởi những dây thần kinh và màng tế bào cơ giúp dẫn truyền xung động điện. Kali: liên quan đến mức độ acid hoặc kiềm của chất lỏng trong cơ thể Kẽm: thành phần của protein, lipit, carbohydrate. Crom: cần thiết cho chức năng của insulin – kiểm sóat nồng độ đường trong máu Sắt: kiểm soát sự vận chuyển oxy cho cơ thể theo đường hồng cầu.  Vitamins Vitamins A, C và E là chất chống oxi hóa chủ yếu Vitamin B và Choline phối hợp sản xuất năng lượng, amino acid, sự trao đổi chất và phát triển khối cơ. Vitamin B12 chịu trách nhiệm sản xuất ra tế bào hồng cầu. Folic acid giúp cho việc sản xuất tế bào hồng cầu mới.  Amino acids: Thành phần cấu tạo của protein, đơn vị cấu trúc của tế bào. Cơ thể con người đòi hỏi phải có 22 amino acids và trong đó có 8 amino acids thiết yếu. Nha đam cung cấp khoảng 20 trên 22 loại amino acids và 7 trên 8 loại thiết yếu đó.  Enzymes: gồm có peroxidase, aliiase, catalase, lipase, cellulase, carboxypeptidase, amylase và alkaline phosphatase. Các enzymes này giúp phá vỡ cấu trúc thực phẩm hỗ trợ quá trình tiêu hóa. Một vài enzymes tham gia phân cắt lipit, những enzymes khác phân cắt đường và tinh bột.  Đường: Nha đam chứa cả hai loại đường là monosaccharides (glucose, fructose) và polysaccharide. Polysaccharide là một loại đường quan trọng, hỗ trợ quá trình tiêu hóa, giữ ổn định mức cholesterol, cải thiện chức năng gan, tăng khả năng vững chắc của xương. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010  Trường ĐHCT Sterol: là chất kháng viêm quan trọng tìm thấy trong Nha đam như: Cholesterol, Sitosterol, Campesterol và Lupeol. Những sterol này có chứa chất khử trùng và chất giảm đau. Tóm lại trong thành phần cấu tạo Nha đam nước chiếm 99%, 1% còn lại là các hóa chất nêu trên. Mặc dầu chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng lại bao gồm nhiều chất rất quan trọng. Nha đam cung cấp các dưỡng chất thiết yếu, có khả năng diệt một số vi khuẩn, virus, nấm và làm giảm sưng tấy… 2.1.5 Một số sản phẩm từ Nha đam có mặt trên thị trường  Cây cảnh (Nguồn : http://cgi.ebay.com.au) Aloe polyphilla Aloe juvenna Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT  Thực phẩm Nước uống Nha đam http://aloeveravera.info/wp-content Trà Nha đam  Mỹ phẩm Gel dưỡng tóc Bộ sản phẩm dưỡng da gồm gel dưỡng vùng quanh mắt, sáp dưỡng môi, dung dịch rữa mặt, dung dịch làm săn da. Nguồn: http://aloeveravera.info/wp-content Nguồn: http://www.thegioikhuyenmai.com.vn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Mặt nạ Lô hội Nguồn: http://www.hlink.vn/shop/data/products  Dược phẩm WATER-JEL® First Aid Cream with Aloe Vera Kết hợp với thuốc sát trùng giúp trị bỏng nhẹ, đứt tay, côn trùng không độc cắn… Nguồn: http://www.labsafety.com/search/Waterjel Aloe vera for treating inflammation Dùng để trị viêm, sưng đỏ… Nguồn: http://aloeveravera.info/wp-content Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 2.1.6. Phương pháp nhân giống thông thường Nha đam có thể được nhân giống vô tính bằng cách sử dụng lá nha đam. Ngoài ra, một phương pháp khác để nhân giống cây nha đam là cắt bỏ đọt cây mẹ. Một năm sau xung quanh cây mẹ sẽ xuất hiện mấy chục cây con. Khi cây con lớn chừng 10 cm thì có thể được tách rời cây mẹ và ươm trong vườn. Khi cây con lớn chừng 15 - 20 cm thì có thể đem trồng. Đời sống cây nha đam kéo dài khoảng 12 năm (Diwakar Aggarwal, 2004). 2.2 Phương pháp nhân giống in vitro 2.2.1 Khái niệm và mục đích của vi nhân giống Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy mô được duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát. Kỹ thuật nuôi cấy mô mang tính thương mại chủ yếu trên cơ sở vi nhân giống. Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true – to – type) của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giúp giảm giá thành sản phẩm. 2.2.2 Các giai đoạn của vi nhân giống Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành bốn giai đoạn khác nhau: Giai đoạn 0: Chuẩn bị của cây mẹ Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng Giai đoạn 2: Nhân chồi Giai đoạn 3a: Kéo dài Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng Giai đoạn 4: Thuần dưỡng Mỗi giai đoạn có một chức năng riêng. Sự thành công của công việc vi nhân giống phụ thuộc vào cả bốn giai đoạn. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT  Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ Giai đoạn này được hiểu là cải thiện điều kiện vệ sinh cây mẹ. Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật như tưới nhỏ giọt, ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Ngoài ra các thủ tục phát hiện để làm giảm hay loại trừ các mầm bệnh về vi khuẩn, virus là điều cần thiết (George, 1993). Chọn nguyên liệu ban đầu rất quan trọng, nó không chỉ quyết định thành công ban đầu mà cả các quá trình tiếp theo.  Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy Đây là một sự kết hợp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao với mẫu cấy và không bị nhiễm. Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu. Để nâng cao tỉ lệ tiệt trùng, cần chú ý đến nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng. Nồng độ và thời gian khử trùng tùy theo loài và kích thước của mẫu cấy. Các hóa chất khử trùng bề mặt  Dung dịch hypochloride Ion hypochloride có trong sodium hypochloride NaOCl hoặc calcium hypochloride Ca(OCl)2, nồng độ sử dụng là từ 5 – 10% để ngâm mẫu khoảng 20 phút (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Sodium hypochloride hòa tan trong nước ở dạng lỏng. Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox. Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypochloride là cả HOCl và ion OCl-. Người ta cho rằng HOCl hiệu quả hơn OCl-. Dung dịch hypochoride nên được sử dụng ở pH 6-7. Nước Javel thương mại có chứa khoảng 5% NaOCl, có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mẫu cấy. Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, Teepol…hoặc có thể xử lý phối hợp với cồn 70% (Vũ Văn Vụ, 1999).  Cồn Có tác dụng diệt khuẩn đồng thời lấy đi các chất sáp từ mô mẫu cấy. Cồn khử trùng thường được sử dụng là ethanol, nồng độ từ 70-95%. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT  Ion kim loại nặng Chất khử trùng thông dụng nhất là HgCl2. Tuy nhiên việc sử dụng hóa chất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực vật lẫn động vật cũng như chất thải sau khi khử trùng có ảnh hưởng đến môi trường.  Chất khử nấm Benomyl, Carbendazin, Fenbendazol,…là các chất khử nấm của thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng trong khử trùng bề mặt. Nồng độ và liều lượng thay đổi theo từng loại mẫu thực vật. Người ta cũng cho các chất này vào trong môi trường nuôi cấy.  Chất kháng sinh Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy như streptomycin, penicillin, alcide,… Nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng cực kỳ quan trọng. Nếu nồng độ quá cao và thời gian khử trùng khá dài mẫu có thể bị tổn thương và chết. Còn nếu nồng độ quá thấp và thời gian khử trùng quá ngắn thì không giết chết được vi sinh vật. Nồng độ thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả như nồng độ cao và thời gian khử trùng ngắn (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).  Giai đoạn 2: Nhân chồi Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên và tạo chồi bất định (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Số lượng chồi nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và nồng độ kích thích tố sử dụng trong môi trường. Một mẫu cấy có mang chồi đơn và sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm chồi được tạo ra và chuyển sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ (Nguyễn Đức Lượng et al, 2002).  Giai đoạn 3: Kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng. Giai đoạn kéo dài: Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ. Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc có ít hơn lượng cytokinin được sử dụng trong giai đoạn 2. Có thể cần thiết thêm than hoạt tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2. Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc chồi cụm (Pierik, 1987). Giai đoạn kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sử dụng để kích thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất trên môi trường có hàm lượng khoáng thấp. Các rễ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học