Tài liệu BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT BỆNH JOHNE’S (PARATUBERCULOSIS) TRÊN ĐÀN BÒ SỮA HUYỆN CỦ CHI – TP. HỒ CHÍ MINH

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT BỆNH JOHNE’S (PARATUBERCULOSIS) TRÊN ĐÀN BÒ SỮA HUYỆN CỦ CHI – TP. HỒ CHÍ MINH ThS. HỒ QUẾ ANH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2014 1 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT BỆNH JOHNE’S (PARATUBERCULOSIS) TRÊN ĐÀN BÒ SỮA HUYỆN CỦ CHI – TP. HỒ CHÍ MINH CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ThS. Hồ Quế Anh PGS.TS. Lê Xuân Cương CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2014 2 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT 5 ABSTRACT 6 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7 DANH MỤC CÁC BẢNG 8 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 9 PHẦN MỞ ĐẦU 10 1. Tên đề tài/dự án 10 Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì: Thời gian thực hiện: Kinh phí được duyệt: Kinh phí đã cấp: ..... theo Thông báo số ..../TB-SKHCN 2. Mục tiêu 10 3. Nội dung 10 CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 11 1.1- Những nghiên cứu ngoài nước 11 1.1.1 – Đặc điểm chung của bệnh 11 1.1.2.- Phương pháp chẩn đoán bệnh và phát hiện bệnh Johne’s 12 1.1.3.- Tình hình nhiễm bệnh Johne’s của bò sữa ở một số nước 14 1.2- Những nghiên cứu trong nước 15 1.3- Tính cấp thiết của đề tài 15 CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1. Nội dung 1: Xác định hiện trạng nhiễm MAP trên đàn bò 15 sữa tại huyện Củ Chi, TPHCM 3 2.1.1. Mô tả nội dung 15 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.1.3. Thiết bị và vật liệu sử dụng 17 2.1.4. Qui trình kỹ thuật Elisa phát hiện kháng thể kháng 18 bệnh paratuberculosis 2.1.5. Các chỉ tiêu theo dõi 19 2.2. Nội dung 2: Đánh giá sơ bộ một số yếu tố lây lan và 19 nguy cơ gây bệnh paratuberculosis trên bò sữa trong khu vực điều tra và trên toàn huyện Củ Chi, TPHCM. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1. Kết quả điều tra tình hình chăn nuôi bò sữa ở nông 20 hộ thuộc 3 xã khảo sát bệnh Johne's 3.2. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng MAP và các yếu 25 tố lây lan, gây bệnh trên bò sữa trong khu vực khảo sát 3.2.1. Nội dung 1: Xác định hiện trạng nhiễm bệnh 25 Mycobacterium paratuberculosis trên đàn bò sữa tại huyện Củ Chi, TPHCM 3.2.2. Nội dung 2: Đánh giá sơ bộ một số yếu tố lây lan và 29 nguy cơ gây bệnh paratuberculosis trên bò sữa trong khu vực điều tra huyện Củ Chi, TPHCM CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 4.1. Kết luận 37 4.2. Đề nghị 37 PHỤ LỤC 38 1. Phụ lục chuyên môn 38 2. Phụ lục sản phẩm 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 4 TÓM TẮT Thu thập 386 mẫu máu bò đang cho sữa, ở 67 nông hộ tại 03 xã có lượng bò sữa nhiều nhất huyện Củ Chi (số liệu tháng 10/2012): Tân Thạnh Đông (tổng đàn: 16.850 con), Tân Thạnh Tây (tổng đàn: 4.236 con), Trung An (tổng đàn: 3.905con). Kết quả kiểm tra kháng thể kháng Mycobacterium paratuberculosis (MAP) bằng phương pháp ELISA có 16 mẫu dương tính (16/386 mẫu), chiếm 4,15%. Tân Thạnh Đông có số mẫu dương tính cao nhất (13/16 mẫu dương tính). Sự lưu hành MAP trên nông hộ ở mức khá cao, 21,54% (14/67 hộ). Đặc biệt tại Tân Thanh Đông, nơi chăn nuôi bò sữa cao nhất TPHCM số hộ khảo sát có kết quả dương tính với MAP chiếm 30,56% (11/36 hộ), Tân Thạnh Tây là 7,14% (1/14 hộ) và Trung An 13,33% (2/15 hộ). Có mối tương quan thuận giữa sự dương tính của MAP với các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, viêm vú và sinh sản thấp. Có 08 con có các dấu hiệu lâm sàng trên dương tính với MAP (chiếm 50,0%), trong đó có 04 con bị tiêu chảy cho kết quả dương tính với MAP, chiếm 25% trên nhóm dương tính và 5,97% so với nhóm khảo sát. Mối nguy lây lan đến từ việc không phân khu nuôi dưỡng riêng biệt cho từng nhóm bò dẫn đến sự lây nhiễm MAP dễ dàng hơn và hệ thống dẫn nước thải nằm hẳn trong chuồng tạo điều kiện cho MAP hiện diện liên tục trong chuồng và dễ dàng xâm nhập vào cơ thể. 5 ABSTRACT Survey of paratuberculosis in dairy cattle at Cu Chi province – Ho Chi Minh City A total of 386 cross-bred Holland Friesian cattles at the milking period, from 67 farms was studied. The blood samples were collected in 36 farms located at Tan Thanh Dong, 14 farms located at Tan Thanh Tay and 15 farms in Trung An Commune Cu Chi Distrist, Ho Chi Minh City. Sixteen of 386 (4,15%) animals were positive for ELISA test and Tan Thanh Dong showed the highest positive (13/16 positive cattles). Prevalence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) in farms was 21,54% (14/67 farms) in which Tan Thanh Dong also exhibited the highest value with 30,56% (11/36 farms), followed by Tan Thanh Tay with 7,14% (1/14 farms) and Trung An with 13,33% (2/15 farms). There was positive correlation between positive value and clinical signs, such as diarrhoea, mastitis and low reproduce. Eight in sixteen positive cattles displayed clinical signs. Diarrhea was observed as the typical symptom as the four in sixteen infected cattles were positive with MAP (25,0%). The great risk factors in spreading Johne’s are no distribution area for each group of cows and wastewater systems located in the barn so that pathogens was created good conditions for their existence. Keywords: Mycobacterium paratuberculoisis, cattle, ELISA. 6 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT AGID ELISA MAP PCR TPHCM XN THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT Agar Gel Immunodiffusion Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay Mycobacteriurn Avium Subspecies Paratuberculosis Polymerase Chain Reaction Thành phố Hồ Chí Minh Xét nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG 7 SỐ 1 2 3 4 5 6 7 TÊN BẢNG SỐ LIỆU Bảng 1.- Quy mô điều tra khảo sát Bảng 2: Phân bổ số lượng mẫu thu thập Bảng 3.- Tình hình chung Bảng 4.- Phương thức chăn nuôi. Bảng 5.- Biện pháp vệ sinh chuồng trại Bảng 6.- Biện pháp phòng bệnh. Bảng 7.- Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh Johne's TRANG 16 16 20 21 22 13 24 8 thường có tại trại Bảng 8.- Kết quả kiểm tra kháng thể MAP/máu bò sinh 25 9 sản đang cho sữa. Bảng 9.- Mức độ nhiễm bệnh Johne's tại địa bàn điều 27 10 tra. Bảng 10.- Mối liên hệ giữa các dấu hiệu lâm sàng và 28 11 kết quả xét nghiệm kháng thể MAP. Bảng 11.- Quy mô đàn bò (con/hộ) và nguồn gốc đàn bò 29 12 sữa liên quan tới bệnh Johne's tại vùng điều tra. Bảng 12.- Phương thức chăn nuôi liên quan tới bệnh 31 13 Johne's tại vùng điều tra. Bảng 13.- Phương thức vệ sinh chuồng trại liên quan tới 34 14 bệnh Johne's tại vùng điều tra. Bảng 14.- Biện pháp phòng bệnh liên quan tới bệnh 36 Johne's tại vùng điều tra DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ SỐ 1 TÊN HÌNH ẢNH TRANG Hình 1: Bộ KIT ELISA dùng để phát hiện kháng thể 17 2 3 4 5 kháng MAP Hình 2: Hộ có quy mô chăn nuôi trên 30 con Hình 3: Hộ có quy mô chăn nuôi từ 10-30 con Hình 4: Hộ có quy mô chăn nuôi dưới 10 con Hình 5 : Dạng kiểu chuồng có sử dụng chất lót nền 8 30 30 30 32 6 Hình 6: Phương thức chăn nuôi cầm cột với máng ăn 33 7 uống riêng lẻ Hình 7: Phương thức chăn nuôi không cầm cột, không 33 8 9 có máng ăn uống riêng lẻ Hình 8: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm hẳn trong chuồng Hình 9: Kiểu chuồng có hệ thống nước thải nằm ngoài 35 35 chuồng PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tên đề tài: Bước đầu khảo sát bệnh Johne’s (paratuberculosis) trên đàn bò sữa huyện Củ Chi - Thành phố Hồ Chí Minh. Chủ nhiệm đề tài: ThS. Hồ Quế Anh Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện đề tài: 12/2012 đến tháng 12/2013 Kinh phí được duyệt: 80.000.000 đồng Kinh phí đã cấp: theo TB số : 2. Mục tiêu: 9 TB-SKHCN ngày / / Xác định hiện trạng nhiễm Mycobacterium paratuberculosis tại địa bàn chăn nuôi bò sữa chủ yếu khu vực TPHCM. Mục tiêu cụ thể - Xác định hiện trạng nhiễm MAP trên đàn bò sữa tại huyện Củ Chi, TPHCM. - Đánh giá sơ bộ một số yếu tố lây lan và nguy cơ gây bệnh paratuberculosis trên bò sữa trong khu vực điều tra. 3. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện 1. Xác định hiện trạng nhiễm MAP trên đàn bò sữa tại huyện Củ Chi, TPHCM Điều tra thu thập một số thông tin liên quan đến - 80 phiếu bệnh Johne’s: 80 phiếu Lấy mẫu tiến hành phân tích xác định tình trạng - 400 mẫu máu nhiễm MAP bằng phương pháp ELISA: 400 mẫu máu 2. Đánh giá sơ bộ một số yếu tố lây lan và nguy cơ - 01 báo cáo gây bệnh paratuberculosis trên bò sữa trong khu vực điều tra huyện Củ Chi, TPHCM: 01 báo cáo CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 1.1- Những nghiên cứu ngoài nước 1.1.1 – Đặc điểm chung của bệnh.- Theo định nghĩa bệnh Johne’s (paratuberculosis) của từ điển bách khoa toàn thư Việt Nam (cập nhật ngày 20/06/2012) thì bệnh Johne’s có tên gọi là bệnh viêm ruột phó lao. Đây là bệnh truyền nhiễm ở bò và loài nhai lại nhỏ (dê, cừu) do vi khuẩn Mycobacteriurn Avium Subspecies Paratuberculosis (MAP) gây ra [1]. Bệnh này phổ biến ở Châu Âu, lan sang các nước do nhập khẩu bò giống thuần chủng từ Châu Âu. Tuy ít gây chết, nhưng tổn thất lớn về kinh tế do bệnh kéo dài [1]. 10 Bệnh Johne’s thường bắt đầu như là một bệnh nhiễm trùng ở bê và thường không thấy dấu hiệu gì cho đến khi bò được 2-5 năm tuổi (đôi khi lớn tuổi hơn). Việc nhiễm bệnh khó phát hiện được trong giai đoạn đầu. Trước khi các triệu chứng lâm sàng rõ ràng, bò bị nhiễm đã có thể bài xuất vi khuẩn ra môi trường gây ô nhiễm các khu vực đẻ, chỗ ở và lây nhiễm sang con khác trong đàn. Vi khuẩn này gây ra hiện tượng viêm đường ruột, dẫn đến con vật tiêu chảy, giảm cân nặng và sản lượng sữa giảm. Dù không có triệu chứng bệnh rõ ràng nhưng những con bò mắc bệnh thường sản xuất sữa giảm, tỷ lệ loại thải cao, khả năng sinh sản kém và bệnh viêm vú tăng cao [2] . Dấu hiệu của bệnh Johne’s bao gồm giảm cân và tiêu chảy, ăn uống bình thường. Vài tuần sau khi khởi phát bệnh tiêu chảy, có thể có hiện tượng sưng dưới hàm. Hiện tượng này có là do mất protein từ máu vào đường tiêu hóa. Bò bệnh giai đoạn này thường sống không lâu, có thể chỉ được vài tuần [3]. Do bản chất tiềm ẩn của nó, phần lớn bệnh Johne’s không được chú ý nhiều trong chăn nuôi bò sữa và các triệu chứng của nó có thể không quen thuộc với hầu hết người chăn nuôi. Một đàn bò chỉ cần có 10% số bò mắc bệnh với triệu chứng lâm sàng của bệnh Johne’s thì thiệt hại trên toàn đàn là khoảng 200 đô la/bò/năm. Sự thiệt hại này chủ yếu là do sụt giảm sản xuất sữa [7]. Theo Nordlund, 1996 thiệt hại sản xuất sữa từ khoảng 2-19% sản lượng sữa giữa nhóm dương tính với bệnh Johne's so với nhóm âm tính [8] . Một nghiên cứu mới nhất của M. A. Villarino, 2011 thiệt hại ở nhóm có kết quả dương tính thấp so với nhóm âm tính không khác biệt nhiều về mặt thống kê (- 4.397 kg; P<0,05). Tuy nhiên, đối với nhóm có kết quả dương tính rõ ràng thì ý nghĩa thiệt hại rất cao (-7.724 kg; P <0,001) và điều này thiệt hại còn cao hơn đối với nhóm có kết quả dương tính mạnh (-10.972kg; P<0,001) [9]. Ngoài ra, còn thiệt hại do sớm loại thải vì bò bệnh và chết, trọng lượng cơ thể tổn thất khi giết mổ gia súc[8]. 11 Ngày nay, theo công bố chung của tập hợp các tổ chức: Viện nghiên cứu nông nghiệp USDA, APHIS, Tổ chức quốc gia về bệnh Johne's và Tổ chức sức khỏe động vật của Mỹ, tỉ lệ nhiễm bệnh Johne’s trên đàn bò của Mỹ là 10%, làm giảm năng suất và gây thiệt hại cho ngành công nghiệp sữa của Mỹ từ 200 triệu đến 250 triệu đô la hàng năm [18]. Đường lây truyền thường gặp nhất là do ăn phải vi khuẩn trong phân của động vật bị nhiễm bệnh. Một số bê bị nhiễm bệnh khi còn trong bào thai do mẹ truyền qua. Vi khuẩn được bài tiết qua sữa, sữa non và tinh dịch. Cấy chuyển phôi không được coi là đường quan trọng của việc truyền bệnh cho bò nhận, tuy nhiên có thể bò mang thai hộ bị nhiễm bệnh sẽ truyền cho phôi/bào thai [2]. Phương pháp truyền chính là qua sự nhiễm phân của bê bệnh ra môi trường, bao gồm cả ô nhiễm sữa và thức ăn. Ngoài ra, những con bò bệnh - kể cả đã và chưa có biểu hiện lâm sàng - đều có thể truyền MAP vào sữa non và sữa của nó, đặc biệt là trong giai đoạn cuối của nhiễm trùng [10][11]. 1.1.2.- Phương pháp chẩn đoán bệnh và phát hiện bệnh Johne’s .- Có rất nhiều phương pháp như huyết thanh học (ELISA, AGID), phân lập vi khuẩn/nuôi cấy, test qua da, kỹ thuật mô bệnh học, PCR… Trong đó, phương pháp ELISA đã được sử dụng từ rất lâu trong việc chẩn đoán bệnh Johne’s trên đàn bò sữa. Vào năm 1990, Milner đã sử dụng phương pháp ELISA kiểm tra trên 3 đàn bò đã nhiễm bệnh với số lượng bò thí nghiệm là 327 con, kết quả có 57% dương tính với độ đặc hiệu lên đến 98,9%. ELISA giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh Johne’s trên bò sữa [4]. Năm 1991, một cuộc khảo sát huyết thanh học trên bò thịt của bang Louisiana, 1581 mẫu huyết thanh ở 152 đàn đã được thực hiện bằng phương pháp ELISA . Kết quả có 71 mẫu (4,4%) và 46 đàn (30%) cho kết quả dương tính [5]. 12 Hiện nay, ELISA được cho là công cụ nhạy cảm nhất và đặc hiệu trong việc phát hiện kháng thể kháng MAP trong huyết thanh gia súc. Độ nhạy cảm của nó tương đương với kỹ thuật ngưng kết bổ thể trong trường hợp bệnh lâm sàng và cao hơn trong trường hợp bệnh cận lâm sàng. Độ nhạy của ELISA phụ thuộc vào hàm lượng của MAP trong phân và tuổi của động vật [12]. Tuy nhiên, ELISA không được khuyến cáo như là một phương pháp độc lập để kiểm tra cá thể. Nó được sử dụng tốt nhất để đánh giá tình trạng toàn đàn kèm theo nhiều thông tin liên quan đến tình trạng bệnh của đàn bò đó [19]. Những lưu ý khi sử dụng phương pháp ELISA trong chẩn đoán bệnh Johne’s theo khuyến cáo của “Nhóm làm việc với bệnh Johne’s quốc gia Mỹ” (National Johne’s Working Group) [19] là : 1. Đối với kiểm tra đàn gia súc trưởng thành, giá trị độ nhạy chỉ đạt 60% 2. ELISA hữu dụng nhất để đo lường mức độ nhiễm bệnh trên đàn bò trưởng thành. 3. ELISA được sử dụng để đánh giá cá thể gia súc trưởng thành bị nghi ngờ trong giai đoạn cuối của bệnh và/hoặc các cá thể trưởng thành trong các đàn có tỷ lệ nhiễm được biết đến. 4. ELISA hiệu quả không cao trong việc đánh giá tình trạng gia súc chưa trưởng thành (nhỏ hơn 2 năm tuổi). 5. Cần sử dụng thêm nhiều thông tin toàn đàn để đánh giá kết quả. 6. ELISA không được sử dụng trên đàn gia súc đã được chủng ngừa bệnh Johne's. 1.1.3.- Tình hình nhiễm bệnh Johne’s của bò sữa ở một số nước.- Bệnh Johne’s đã được mô tả đầu tiên vào năm 1895 và lan rộng trong chăn nuôi tại Mỹ, gây tốn kém nghiêm trọng cho ngành công nghiệp sữa. Dữ liệu từ cuộc khảo sát 1996 Thú y Quốc gia, kết quả giám sát chỉ ra rằng khoảng 40% đàn bò sữa ở Mỹ và hơn 300 loài động vật bị nhiễm bệnh 13 [13] . Đến năm 2010, tạp chí Johne’s disease dairy của tổ chức USDA-Mỹ công bố 68% các cơ sở chăn nuôi bò sữa Mỹ bị nhiễm Johne’s. Tổ chức giám sát thú y quốc gia Mỹ (National Animal Health Monitoring Systems) cho thấy, đàn bò sữa tổn thất trung bình 40 đô la/ 1con với đàn có tỉ lệ bệnh lâm sàng thấp, ở đàn tỷ lệ lâm sàng ca - tổn thất trên 227 đô la/con [14]. Một phần tư đàn bò sữa ở Mỹ có tỷ lệ nhiễm bệnh Johne's tương đối cao. Mặc dù hầu hết các đàn bò thịt ở Mỹ không bị nhiễm bệnh Johne’s nhưng người ta ước tính rằng 08 trong số 100 đàn bò thịt ở Mỹ (8%) có thể bị nhiễm căn bệnh này [2]. Năm 2003, ở Úc, khoảng 1.350 đàn bò thịt và bò sữa nhiễm bệnh; và tác động của nó tập trung ở ngành công nghiệp sữa, đặc biệt là ở tiểu bang Victoria [15] . Ở Ấn Độ, năm 2007, khi xét nghiệm 115 bò sữa bằng kỹ thuật m-ELISA có 32,1% bò dương tính với bệnh Johne’s [16] . Ở Cameroon, khi kiểm tra 4.000 con bò sữa bằng kỹ thuật ELISA từ năm 2007-2010, cho kết quả dương tính là 132 con và lượng bò này chủ yếu được nhập bò từ Pháp [17] . Ở Comlombia - 2011, khi khảo sát bằng ELISA-C trên 329 con bò sữa, kết quả nhiễm là 1,8% [18]. 1.2- Những nghiên cứu trong nước: Tại Việt Nam , đến nay, chưa có ghi nhận hay nghiên cứu nào liên quan đến bệnh Johne’s dù đây là một trong những bệnh được ghi trong Điều lệ kiểm dịch động vật của Việt Nam. 1.3- Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, với mục tiêu nâng cao chất lượng đàn giống trong nước nên nguồn giống bò nhập ngoại tăng cao, đưa đến hệ lụy làm gia tăng nguy cơ lây lan bệnh từ các nước khác vào Việt Nam. Cá thể mang bệnh Johne’s giai đoạn đầu gần như không biểu hiện bất cứ dấu hiệu lâm sàng nào của bệnh. Tuy nhiên, những cá thể này lại có khả năng phát tán và lây truyền mầm bệnh rất cao. Thực tế cho thấy tình hình nhiễm bệnh Johne’s (paratuberculosis) xuất hiện từ lâu ở nhiều nước có nền chăn nuôi bò sữa nổi tiếng trên thế giới như Mỹ, 14 Đức, Úc, Pháp… và gây ra tổn thất rất lớn cho nền chăn nuôi bò sữa các nước này. Trong khi đó tại Việt Nam căn bệnh này hầu như chưa được biết đến, chưa có ghi nhận hay nghiên cứu nào liên quan đến nó. CHƯƠNG II- NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1- Nội dung 1: Xác định hiện trạng nhiễm MAP trên đàn bò sữa tại huyện Củ Chi, TPHCM 2.1.1- Mô tả nội dung:  Địa bàn khảo sát tình hình nhiễm bệnh Johne’s (paratuberculosis) trên đàn bò sữa 03 xã có lượng bò sữa nhiều nhất huyện Củ Chi (số liệu tháng 10/2012): Tân Thạnh Đông (tổng đàn: 16.850 con), Tân Thạnh Tây (tổng đàn: 4.236 con), Trung An (tổng đàn: 3.905con).  Số hộ chăn nuôi được khảo sát thông tin: 80 hộ/2374 hộ.  Quy mô cụ thể như sau: Bảng 1: Quy mô điều tra khảo sát Qui mô đàn/xã Số bò Số bò Số bò Tổng cộng < 10 con 10-30 con > 30 con Tân Thạnh Đông 20 hộ 20 hộ 10 hộ 50 hộ/1627 hộ Tân Thạnh Tây 06 hộ 06 hộ 03 hộ 15 hộ/408 hộ Trung An 07 hộ 05 hộ 03 hộ 15 hộ/339 hộ Chung 3 xã 33 hộ 31 hộ 16 hộ 80 hộ  Số lượng mẫu thu thập: 400 mẫu máu (chỉ lấy trên bò sinh sản). Cách lấy mẫu: Dùng ống tiêm nhựa vô trùng số 10 và kim tiêm số 20 để lấy máu. Có thể lấy mẫu máu từ tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi. Mỗi con lấy khoảng 5ml máu. Bò được cố định trước khi lấy mẫu máu. Sau khi lấy máu, các ống tiêm này được để ổn định trong thùng trữ lạnh để máu đông tự nhiên. Sau đó, mẫu máu được tách lấy huyết thanh trong điều kiện vô trùng tại phòng thí 15 nghiệm. Mẫu huyết thanh được đánh số, bảo quản ở nhiệt độ -30 0C đến khi dùng làm xét nghiệm. Sự phân bổ mẫu cần lấy: ở mỗi hộ điều tra lấy mẫu máu khoảng 20-30% số con/hộ. Tính bình quân cho các xã như sau: Bảng 2: Phân bổ số lượng mẫu thu thập Địa phương Tân Thạnh Đông Tân Thạnh Tây Trung An 2.1.2- Phương pháp nghiên cứu Số mẫu 250 mẫu 75 mẫu 75 mẫu  Sử dụng phương pháp nghiên cứu hàng loạt (case-series studies): để quan sát và ghi nhận lại những biểu hiện liên quan trên đường tiêu hóa của những bò sữa bị bệnh paratuberculosis.  Sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang (cross-sectional studies): để chụp nhanh hiện trạng chăn nuôi bò sữa hiện nay, nhằm thu thập tòan bộ những thông tin có liên quan phục vụ cho việc phân tích tìm nguyên nhân gây bệnh paratuberculosis.  Sử dụng phương pháp nghiên cứu hồi cứu (retrospective studies): thu thập những thông tin trước đây (từ sổ sách ghi chép của trang trại, nếu có) liên quan đến việc đánh giá tình trạng bệnh paratuberculosis của bò sữa. VD: thu thập những thông tin trước đây về các trường hợp bò sữa bị bệnh trên đường tiêu hóa như tiêu chảy, sút cân...  Phương pháp phân tích trong phòng TN: phương pháp ELISA-kháng thể: được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể đối với paratuberculosis trong máu. 2.1.3- Thiết bị và vật liệu sử dụng:  Phiếu điều tra chuyên biệt - kết hợp thu thập số liệu trên phiếu theo dõi tại trại. 16  Máy ELISA model 680 của Bio-RAD  Bộ kít đặc hiệu cho việc phát hiện kháng thể kháng bệnh paratuberculosis (IDEXX Paratuberculosis Screening Ab Test) Hình 1: Bộ KIT ELISA dùng để phát hiện kháng thể kháng MAP 2.1.4- Qui trình kỹ thuật Elisa phát hiện kháng thể kháng bệnh paratuberculosis 1 Pha dung dịch rửa (1:20) 15 ml “wash solution” + 285 ml nước cất Pha dung dịch tiếp hợp Để được 3 ngày ở to 2-8oC 150µl “Conjugate concentrate” + 14.850µl Anti-ruminant HRPO “Dilution buffer N1” 3 (1/100) Pha loãng mẫu huyết - 100µl mẫu * 100µl “Dilution Buffer N12” 4 thanh thí nghiệm 1:20 Pha loãng mẫu đối chứng - 15µl “Negative control” + 285µl “Dilution 5 âm Pha loãng đối chứng Buffer N12 - 15µl “Postitive control” + 285µl “Dilution 6 dương Buffer N12” - Rung lắc cho mẫu trộn đều với dung dịch pha loãng 7 - Ủ trong 15 phút – 120 phút ở to 18-26oC - 100µl mỗi mẫu đã pha loãng vào từng giếng riêng lẻ (mẫu đối chứng 2 dương cho vào 2 giếng) - Rung lắc cho mẫu trộn đều - Bọc microplate bằng miếng nhôm mỏng 17 8 - Ủ trong 45 phút ở to 18-26oC Rửa giếng - Cho 300µl dung dịch rửa vào giếng ngâm 2 phút trước khi bắt đầu quy trình rửa - Sử dụng 300µl dung dịch rửa cho mỗi giếng 9 - Rửa 3 lần - 100µl dung dịch tiếp hợp (đã được pha ở bước 2) vào mỗi giếng - Bọc microplate bằng miếng nhôm mỏng - Ủ trong 30 phút ở to 18-26oC 10 Rửa giếng Như bước 8 11 - Cho 100µl “TMB substrate N9” vào mỗi giếng - Ủ 10 phút trong phòng tối 12 - 100µl “Stop solution N3” - Lắc nhẹ khay thí nghiệm và lau sạch phần đáy của khay 13 Đưa vào máy đọc kết quả ở bước sóng 450nm 14 Tính kết quả: PCtb = (PC1 + PC2) : 2 S/P (%) = 100 * [(Mẫu – NC) : (PCtb-NC)] 15 - S/P (%) < = 60  âm tính - 60 > S/P > 70  nghi ngờ cần làm lại - S/P > = 70  dương tính 2.1.5- Các chỉ tiêu theo dõi  Phiếu điều tra nông hộ (Phụ lục).  Điều tra cá thể thu thập mẫu máu (Phụ lục). 2.2- Nội dung 2: Đánh giá sơ bộ một số yếu tố lây lan và nguy cơ gây bệnh paratuberculosis trên bò sữa trong khu vực điều tra và trên toàn huyện Củ Chi, TPHCM. Dựa trên kết quả chẩn đoán xét nghiệm sự hiện diện của kháng thể kháng M. paratuberculosis từ các mẫu máu thu thập được và dựa trên các thông tin điều tra được từ các trại chăn nuôi (nội dung 1), tiến hành phân tích để tìm các 18 yếu tố khác biệt giữa hai nhóm bò sữa có và không nhiễm bệnh, giữa trại/khu vực, có tỷ lệ nhiễm bệnh cao và thấp. Từ đó, tìm ra một số yếu tố lây lan và nguy cơ gây bệnh paratuberculosis trong phạm vi khu vực khảo sát. CHƯƠNG III- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1- Kết quả điều tra tình hình chăn nuôi bò sữa ở nông hộ thuộc 3 xã khảo sát bệnh Johne's Bảng 3.- Tình hình chung Chỉ tiêu Tân Thạnh Tân Thạnh Trung Đông 50/1627 696 Tây 15/408 233 An 15/339 295 ∑ 3 xã 80/2374 1224 - Bình quân số bò/ hộ (con) Bò sinh sản (con) 13,9 381 15,5 116 19,7 163 15, 3 660 - Bình quân số bò/ hộ (con) Bê và bò tơ (con) Đàn bò được gây tạo từ : 7,6 315 7,7 117 10,8 132 8, 25 564 * n ( hộ) 22 5 4 31 *% 44 33,3 26,7 38,75 28 10 11 49 66,7 73,3 61,25 5 8 33 Số hộ điều tra (hộ) Tổng đàn bò (con) - Mua từ một nguồn: - Mua từ nhiều nguồn: * n ( hộ) * % Tăng đàn do mua thêm: * n (hộ) 20 *% 40,0 33,33 53,33 41,25 Số liệu bảng 3 cho thấy: bình quân số bò/hộ là 13,5 con trong đó có 8,5 con bò sinh sản. 61,3% số hộ gây tạo đàn bò từ nhiều nguồn và 41,2% số hộ 19 tăng đàn do mua thêm từ bên ngoài. Việc tăng đàn bằng cách mua thêm - nếu không được kiểm soát chặt chẽ những bò mua trước khi đưa vào trại - là một mối nguy lớn trong việc truyền nguồn bệnh giữa các trại. Bảng 4.- Phương thức chăn nuôi. Chỉ tiêu Tân Thạnh Tân Thạnh Trung An Đông Tây dưỡng nhóm bò: * n (hộ) 42 11 11 64 *% Có sử dụng chất lót nền: 84,0 73,33 73,33 80,0 29 7 10 45 58,0 46,67 66,67 56,25 50 15 15 80 100,0 100,0 100,0 100,0 48 15 13 76 96,0 100,0 86,67 95,0 31 12 11 54 62,0 80,0 73,33 67,5 Không phân khu nuôi * n (hộ) *% Bò cầm cột tại chuồng: * n (hộ) *% Máng ăn uống riêng cho từng con: * n (hộ) *% Thức ăn thừa cho bò khác ăn: * n (hộ) *% ∑ 3 xã Số liệu bảng 4 cho thấy: 80,0% hộ chăn nuôi vẫn chưa phân khu nuôi dưỡng cho từng nhóm bò, thức ăn thừa của bò này lại cho bò khác ăn (chiếm 67,5% số hộ) dẫn đến nguồn bệnh từ nhóm bò này dễ dàng lây truyền cho nhóm khác, hay từ con này sang con khác. Đặc biệt đối với bệnh Johne’s, mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu do ăn phải vi khuẩn. Tuy nhiên, với phương thức chăn nuôi 100% cầm cột tại chuồng, kèm theo việc cho ăn riêng biệt từng con, 20