Tài liệu Khoá luận tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn các chủng aspergillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ Sinh học và TS.Nguyễn Nhƣ Ngọc, giảng viên trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, là ngƣời đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin cảm ơn các thầy, cô trong Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong những năm em học tập ở đây. Kiến thức đó không chỉ là nền tảng, là cơ sở trong quá trình học tập và nghiên cứu mà còn là hành trang quý báu để em bƣớc vào đời một cách vững chắc và tự tin nhất. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Nguyễn Nhƣ Ngọc đã tạo điều kiện thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè những ngƣời đã động viên cổ vũ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2018 Sinh Viên Vũ Thị Mến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU........................................ 2 1.1. Khái quát về enzyme laccase ......................................................................... 2 1.1.1. Khái niệm .................................................................................................... 2 1.1.2. Cấu tạo của enzyme laccase ........................................................................ 2 1.1.2. Đặc tính enzyme laccase ............................................................................. 3 1.2. Cơ chế hoạt động của enzyme laccase ........................................................... 4 1.3. Ứng dụng của laccase..................................................................................... 6 1.3.1. Ứng dụng của enzyme laccase .................................................................... 6 1.3.2. Xử lý màu thuốc nhuộm .............................................................................. 7 1.3.3. Xử lý sinh học và phân hủy sinh học .......................................................... 7 1.3.4. Tẩy trắng bột giấy ....................................................................................... 7 1.3.5. Các ứng dụng khác ...................................................................................... 8 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc của laccase ................................. 8 1.4.1. Trong nƣớc .................................................................................................. 8 1.4.2. Nƣớc ngoài .................................................................................................. 9 1.5. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase ....................... 10 1.5.1. Trong thực vật ........................................................................................... 10 1.5.2. Trong vi khuẩn và xạ khuẩn ...................................................................... 10 1.5.3. Trong nấm ................................................................................................. 11 1.5.4. Trong côn trùng ......................................................................................... 11 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 12 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 12 2.3.Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 12 2.4. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 12 2.4.1 Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy ............................................................... 12 2.4.2. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................ 13 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 14 2.5.1. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ gỗ mục .............................................. 14 2.5.2.Phƣơng pháp giữ giống nấm ...................................................................... 14 2.5.3. Định tính sự có mặt của enzyme laccase .................................................. 15 2.5.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm mốc ........................................... 16 2.5.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của nấm đƣợc tuyển chọn .......................................................................................... 16 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 18 3.1. Phân lập, làm thuần tạo bộ sƣu tập các chủng nấm mốc từ gỗ mục ............ 18 3.2. Kết quả thử hoạt tính các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase ............................................................................................................................. 21 3.2.1. Kết quả tuyển chọn enzyme laccase trên cơ chất...................................... 21 3.2.2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme laccase ngoại bào trong môi trƣờng lỏng 23 3.3. Định danh, định tên chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase ... 25 3.3.1. Định danh chủng nấm CN1 ....................................................................... 25 3.3.2. Định danh chủng nấm CN2 ....................................................................... 26 3.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của nấm đƣợc tuyển chọn .......................................................................................... 27 3.4.1. Khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc ................................................ 27 3.4.2. Khả năng phân giải cellulose của nấm mốc .............................................. 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 29 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 29 4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 30 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 14 Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc .............. 18 Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng xuất hiện phản ứng màu laccase của các chủng nấm mốc ...................................................................................................................... 22 Bảng 3.3. Đƣờng kính vòng xuất hiện phản ứng màu laccase............................ 24 Bảng 3.4. Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột của chủng nấm CN1,CN2 ........ 27 Bảng 3.5. Đƣờng kính vòng phân giải cellulose của chủng nấm CN1,CN2 ...... 28 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc không gian enzyme laccase ..................................... 3 Hình 1.2. Hình ảnh trung tâm hoạt động của laccase ........................................... 3 Hình1.3. Cơ chế phản ứng của enzyme laccase .................................................... 6 Hình 3.1. Một số chủng nấm mốc đƣợc giữ giống ............................................. 21 Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính enzyme laccase trên cơ chất ............................. 23 Hình 3.3. Enzyme trong môi trƣờng lỏng ........................................................... 24 Hình 3.4. Vòng phân giải acid tanic của các chủng nấm .................................... 24 Hình 3.5. Hình thái nấm và cơ quan sinh sản của CN1 ...................................... 25 Hình 3.6. Hình thái nấm và cơ quan sinh sản của CN2 ...................................... 26 DANH MỤC VIẾT TẮT PCB Polychlorinated biphenyl EPR Lò phản ứng hạt nhân LB Luria Bertani SNA Agar Spezieller Nahrstoffarmer ABTS Axit 2,2’-azino-bis 3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic MỞ ĐẦU Việc sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống ngày càng đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đang đƣợc sử dụng phổ biến ở nhiều nƣớc đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn, đặc biệt các enzyme có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng. Điển hình trong số đó là enzyme laccase. Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic và là một polyphenol oxydase, do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan. Ƣu điểm vƣợt trội của laccase là có tính oxy hóa mạnh, laccase đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp và nguồn nƣớc thải ô nhiễm. Laccase còn đƣợc biết đến nhƣ một enzyme thân thiện với môi trƣờng do trong phản ứng laccase chỉ cần lấy oxy từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nƣớc Laccase có thể đƣợc thu từ các nguồn khác nhau nhƣ nấm mốc, thực vật, vi khuẩn, côn trùng nhƣng phổ biến nhất là từ nấm mốc. Hiện nay nhiều chủng nấm sợi đã đƣợc phát hiện khả năng tổng hợp laccase cao nhƣ: Trametes versicolor[2], Melanocarpus albomyces, Trametes modesta [4]. Hơn nữa, nấm mốc có khả năng sinh trƣởng phát triển mạnh nên thuận lợi rất nhiều cho việc sản xuất laccase ở quy mô lớn phục vụ trong công nghiệp và đời sống. Trong những năm gần đây, laccase đƣợc ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm thông qua việc đƣa vào các quy trình xử lý sinh học. Ngoài ra, laccase còn đƣợc sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nƣớc thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏ các hợp chất phenol, xử lý phụ phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác. Ứng dụng của laccase đƣợc mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các mediator (chất trung gian) làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol (non-phenol). Với các vấn đề cấp thiết về nguồn enzyme laccase nên tôi đã tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase”. Để có thể tăng thêm số lƣợng các chủng có khả năng sinh enzyme laccase phục vụ cho đời sống con ngƣời. 1 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Khái quát về enzyme laccase 1.1.1. Khái niệm Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic có khả năng oxy hóa mạnh các hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, lignin, dioxin,...và phân giải các hợp chất vô cơ nhƣ iot [5]. Laccase đƣợc ký hiệu là p- benzenediol: oxygen oxidoreductase (EC 1.10.3.2) và là một polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trong trung tâm hoạt động [5]. 1.1.2. Cấu tạo của enzyme laccase Nguyên tử đồng có chứa 1,4-benzenediol: oxy oxidoreductases. Chúng khác nhau về trình tự axit amin và một số tính chất về động học xúc tác [6]. Laccases chứa 4 nguyên tử đồng đƣợc gọi là nguyên tử đồng T1 (nơi chất nền giảm liên kết) và cụm nguyên tử đồng T2 / T3 (nơi oxy liên kết và giảm xuống nƣớc) [8]. Ba loại đồng đƣợc phân biệt bằng cách sử dụng quang phổ UV có thể nhìn thấy đƣợc và quang điện cộng hƣởng (EPR). Nguyên tử đồng T1 chịu trách nhiệm về màu xanh của protein và có thể phát hiện EPR. Nguyên tử đồng loại T2 không thay đổi màu sắc nhƣng có thể phát hiện EPR. Nguyên tử đồngT3 gồm một cặp nguyên tử đồng không phát hiện tín hiệu EPR [8]. Năm 1894 Gabrie Bertrand lần đầu tiên nghiên cứu laccase trong nhựa cây sơn mài Nhật Bản, đây là nơi nó giúp tạo thành sơn mài [16]. 2 Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc không gian enzyme laccase Hình 1.2. Hình ảnh trung tâm hoạt động của laccase 1.1.2. Đặc tính enzyme laccase Các nguyên tử đồng loại 1, loại 2, loại 3 trong enzyme laccase bị ràng buộc ở một số khu vực. Nguyên tử đồng loại 2 và loại 3 đƣợc gọi là một cụm trinuclear. Nguyên tử đồng loại 1 có sẵn để hoạt động dung môi, chẳng hạn nhƣ nƣớc. Nó có thể đƣợc di chuyển bằng thủy ngân, đƣợc thay thế bởi coban hoặc 3 loại bỏ qua một phức hợp đồng. Loại bỏ đồng loại 1 làm giảm hoạt động của laccase [21]. Tính chất hóa sinh của enzyme laccase: trọng lƣợng phân tử, pH, nhiệt độ tối ƣu, nguồn carbon nito,... Trọng lƣợng: Năm 1998 Judewicz và cộng sự đã ƣớc tính đƣợc trọng lƣợng phân tử của enzyme laccase Cerrena unicolor là 59 kDa [9]. Ảnh hƣởng của pH: laccase hoạt động tốt trong khoảng pH 3 – 8, khi tăng hoặc giảm pH sẽ làm ức chế hoạt tính laccase do ion hydroxide. Hoạt tính của enzyme laccase ở các pH khác nhau vì sự tăng chênh lệch thể oxi hóa khử và tác dụng ức chế trong nguyên tử đồng 3 của ion hydroxide [7]. Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30oC– 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote [10]. Ảnh hƣởng của nguồn Carbon và Nitơ: Hệ thống lignolytic của nấm thối trắng đƣợc kích hoạt trong giai đoạn chuyển hóa thứ cấp của nấm và đƣợc kích hoạt bởi sự suy giảm nitơ. Các nguồn carbon dƣ thừa sẽ cản trở sự phát triển enzyme. Một số ảnh hƣởng khác: Các chất ức chếnhƣ axit amin, axit béo, florua,... Laccase gây ức chế hoạt động của enzyme bằng cách liên kết với nguyên tử đồng loại 2 hoặc 3, dẫn đến sự gián đoạn quá trình truyền electron bên trong (các ion kim loại nhƣ halogenua azide, xyanua), biến đổi axit amin thay đổi cấu hình của Cu chelation (ion kim loại, axit béo), loại bỏ chọn lọc nguyên tử đồng bằng dimethyl glyoxime. Năm 2009 Valeriano và cộng sự tìm thấy là hoạt động của laccase tinh khiết từ Stereum ostrea và ổn định ở pH tối ƣu 6.0 và nhiệt độ 40°C [11]. 1.2.Cơ chế hoạt động của enzyme laccase Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù 4 hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lƣợng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [9]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục cácphản ứng không cần xúc tác enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa [8]. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nƣớc. Nguyên tử đồng T1 đƣợc giảm bởi một chất nền, do đó T1 bị oxy hóa. Điện tử sau đó đƣợc chuyển từ T1 đến một cụm trinuclear đƣợc tạo thành từ các nguyên tử đồng T2 và T3 (Hình 3). Phân tử O2liên kết với cụm trinuclear đểkích hoạt bất đối xứng và nó đƣợc mô phỏng rằng túi liên kết O2 dƣờng nhƣ hạn chế sự tiếp cận của các tác nhân oxy hóa khác với O2. Khi một quá trình oxy hóa chất nền điện tử đƣợc kết hợp với sự giảm oxy bốn electron, cơ chế phản ứng không thể hoàn toàn đơn giản. Laccase có thể đƣợc cho là hoạt động nhƣ một pin, lƣu trữ các điện tử từ các phản ứng oxy hóa riêng lẻ để giảm oxy phân tử. Do đó, quá trình oxy hóa của bốn phân tử chất nền giảm là cần thiết để giảm hoàn toàn oxy phân tử thành nƣớc. 5 Hình1.3. Cơ chế phản ứng của enzyme laccase Chất nền oxy hóa bằng laccase là phản ứng một electron tạo ra gốc tự do. Sự suy giảm lignin bởi gốc phenoxy dẫn đến sự oxy hóa ở Cα-carbon hoặc sự phân cắt liên kết giữa Cα-carbon và Cβ-carbon. Sự oxy hóa này dẫn đến một gốc tự do lấy oxy làm trung tâm, sau đó có thể đƣợc chuyển đổi thành phản ứng xúc tác enzyme thứ hai thành quinine (hợp chất thơm). Quinone và các gốc tự do có thể trải qua quá trình trùng hợp [8,11]Sự có mặt của các nhóm thế điện tử thu hồi ở nhóm phenoxy và các nhóm cồng kềnh khó bị oxy hóa hơn [8]. Chất trung gian tổng hợp phổ biến là 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline6-sulfonate) (ABTS) và acid hydroxyanthranilic 3. Trong sự có mặt của oxy ABTS mức độ hấp thụ bởi laccase nhanh hơn HOBT [15,22]. 1.3. Ứng dụng của laccase 1.3.1. Ứng dụng của enzyme laccase Enzyme laccase là loại enzyme quan trọng vì nó oxy hoá cả các chất độc và không độc hại. Nó đƣợc sử dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp chế biến gỗ, công nghiệp dƣợc phẩm và công nghiệp hóa chất,... 6 1.3.2. Xử lý màu thuốc nhuộm Ngành công nghiệp dệt sử dụng khối lƣợng lớn nƣớc và hóa chất để sản xuất. Những hóa chất này từ các hợp chất vô cơ và hợp chất hữu cơ. Cấu trúc hóa học của thuốc nhuộm cung cấp khả năng chống phai khi tiếp xúc với ánh sáng, nƣớc và các hóa chất khác. Năm 2008 Dube và cộng sự đã thử hoạt tính khử màu một số thuốc nhuộm tổng hợp (xanh methylen, methyl xanh, toluidin xanh, đỏ Congo, methyl cam và hồng) và nƣớc thải công nghiệp (SITEX Black) đạt đƣợc nhờ vi khuẩn S. maltophilia AAP56 trong môi trƣờng tăng trƣởng LB [12]. 1.3.3. Xử lý sinh học và phân hủy sinh học Laccases cũng cho thấy hữu ích cho việc loại bỏ các hợp chất độc hại thông qua enzym oxy hóa ghép các chất gây ô nhiễm, dẫn đến các cấu trúc phức tạp không hòa tan [13]. Các hợp chất phenolic có mặt trong chất thải từ một số quá trình công nghiệp, nhƣ chuyển đổi than, tinh chế dầu mỏ, sản xuất hóa chất hữu cơ và sản xuất dầu ô liu trong số những ngƣời khác [14]. Laccase cố định đƣợc chính minh loại bỏ phenolic và clo hóa chất gây ô nhiễm phenolic một cách hiệu quả [18]. Laccase có vai trò chuyển đổi 2,4,6trichlorophenol thành 2,6-dichloro-1,4-hydroquinol và 2,6-dichloro-1,4- benzoquinone [15]. Một số tác giả thấy rằng nấm thối trắng có thể oxy hóa các chất alken, carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene và dibenzothiophene khi có mặt HBT và ABTS làm trung gian [16] 1.3.4. Tẩy trắng bột giấy Trong quá trình chuẩn bị công nghiệp giấy, việc tách và phân hủy lignin thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng Cl2 và O3. Tuy nhiên trong những năm qua ngƣời ta đã dùng laccase thay cho các hợt chất của Cl để àm trắng giấy. Mặc dù đây là một phƣơng pháp mới, nhƣng quá trình sử dụng laccase vẫn thể hiện đƣợc tính hiệu quả bởi vì quá trình hoạt động trong điều kiện nhẹ hơn sạch hơn và mặc dù phân hủy lignin nhƣng vẫn giữ đƣợc sự tròn vẹn của cellulose. Nếu không giữ đƣợc sự tròn vẹn của cellulose sẽ không làm đƣợc giấy. 7 1.3.5. Các ứng dụng khác Trong ngành công nghiệp thực phẩm, laccase đƣợc sử dụng để loại bỏ các hợp chất phenolic không mong muốn trong quá trình nƣớng, xử lý nƣớc trái cây, ổn định rƣợu và xử lý sinh học nƣớc thải. Laccase cải thiện không chỉ tính năng mà còn cả các đặc tính cảm giác [18]. Laccase cung cấp sự ổn định mà còn tăng tuổi thọ của bia. Để cải thiện kết cấu, khối lƣợng, hƣơng vị và độ tƣơi của bánh mì, nhiều loại enzym đƣợc sử dụng. Khi laccase đƣợc thêm vào bột, sức mạnh của cấu trúc gluten trong bột và các sản phẩm nƣớng đƣợc cải thiện: tăng khối lƣợng sản phẩm, cải thiện cấu trúc crumb, và sự mềm mại của các sản phẩm nƣớng diễn ra [19]. Laccase có khả năng làm giảm mùi hôi phát sinh từ các bãi chôn lấp, trang trại chăn nuôi và các nhà máy bột giấy. Do các chất kết tụ xúc tác các phản ứng truyền điện tử mà không có các điều kiện bổ sung, chúng cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣ là các cảm biến sinh học để phát hiện các hợp chất phenol khác nhau, oxy và azide. Ngoài ra laccase có thể phát hiện morphine, codeine, catecholamine, ƣớc tính phenol hoặc các enzyme khác trong nƣớc trái cây và flavonoid thực vật [17]. Laccases có thể đƣợc sử dụng để giải độc các loại đất có chứa các chất ô nhiễm phenolic và các chất độc do thuốc trừ sâu,... do phạm vi bề mặt rộng của enzyme. Năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh đã nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu nhằm xử lý đất ô nhiễm có thuốc trừ sâu làm cho đất không còn bị ô nhiễm nữa. 1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc của laccase 1.4.1. Trong nước 8 Ở nƣớc ta hiện nay việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không nhiều nhƣ các nƣớc phát triển khác. Tuy nhiên việc đƣa các nghiên cứu và ứng dụng của quá trình xử lý các hợp chất đang đƣợc các nhà nghiên cứu khoa học tiến hành từ lâu đời. Năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh đã “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu”. Kết quả đạt đƣợc các chủng nấm Aspergillus sp phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất, sau 7 ngày Aspergillus sp sẽ loại bỏ DDE, DDD và DDT lần lƣợt là 92,69 %, 97,19 % và 97,23 %. Aspergillus sp không phát triển trên nguồn carbon là lactose và cellulose, phát triển yếu trên nguồn nitơ là Aspergillus sp. sinh tổng hợp laccase trong điều kiện 30oC, pH. Năm 2013 Dƣơng Minh Lam, Trƣơng Thị Chiên với đề tài “Nghiên cứu một sốđặc tính sinh học của chủng nấm đảm trametes maxima cpb30 sinh laccase ứng dụng trong xử lí màu nƣớc ô nhiễm do thuốc nhuộm”. Kết quả đạt đƣợc là Chủng T. maxima CPB30 là chủng ƣa ấm, sinh trƣởng và sinh laccase tốt nhất ở 30oC. Giá trị pH ban ñầu của môi trƣờng tốt nhất cho sinh trƣởng và sinh laccase là 2,5-3,0. Enzyme laccase từ T. maxima CPB30 hoạt động mạnh nhất tại 50oC và có khả năng oxi hóa khử màu thuốc nhuộm vải trong thời gian ngắn ở nồng độ 2,5% dịch enzyme 1000U/ml. Năm 2015 Đinh Thị Thu Hằng và các cộng sự đã “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase sinh tổng hợp từ chủng nấm đảm Pycnoporus sp. fbv60 phân lập từBa Vì”. Kết quả đạt đƣợc chủng phân lập làPycnoporus coccineus ứng dụng trong khử độc các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm bằng phân hủy sinh học, là loại màu thuốc nhuộm ở các cơ sở dệt nhuộm qui mô công nghiệp [20]. 1.4.2. Nước ngoài Trong những năm gần đây, các enzym đã đạt đƣợc tầm quan trọng lớn trong ngành công nghiệp; laccases là một trong số chúng có mặt rộng rãi trong tự nhiên. Vì thế enzyme laccase đã đƣợc các nhà nghiên cứu về ứng dụng của nó. 9 Năm 2015 Ursula fillat và cộng sự đã nghiên cứu “Biobleaching of orange tree pruning cellulose pulp with xylanase and laccase mediator systems” đã đạt đƣợc sự kết hợp của laccase từ T.Villosa với acetosyringone LMS làm tăng tính chất quang học của giấy tẩy trắng [16]. Năm 2008 Dube và cộng sự quan sát thấy axít tetraacetic ethylene diamine (EDTA)(5 mM) hoàn toàn ức chế hoạt động của laccase. EDTA, SDS và arginine có tác dụng ức chế nổi mạnh nhất đối với hoạt động của laccase [4]. Năm 2017 Amit Kumar và cộng sự đã thanh lọc dựa trên gel và nghiên cứu sinh hóa của Isozym Laccase sản xuất từ Ganoderma sp. Kết quả đạt đƣợc các isozyme laccase từ G. Lucidum đã đƣợc tìm thấy có vai trò chống oxy hóa và do đó có khả năng trong các gốc tự do nhặt rác trong quá trình sinh bệnh. Đây là nghiên cứu chi tiết đầu tiên về đặc điểm sinh hóa của tất cả các isozyme laccase đƣợc tinh chế bằng phƣơng pháp mới dựa trên gel. 1.5. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase Laccase rất phổ biến trong tự nhiên, chúng đƣợc tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. 1.5.1. Trong thực vật Laccase lần đầu tiên đƣợc phát hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera, laccases đƣợc tìm thấy trong cải bắp, củ cải, khoai tây, lê, táo và các loại rau khác. Chúng đã đƣợc phân lập từ nấm Ascomyceteous,Deuteromycteous và Basidiomycetous với hơn 60 chủng nấm [13]. 1.5.2. Trong vi khuẩn và xạ khuẩn Nguồn laccase từ vi khuẩn thƣờng lấy từ đất, nƣớc thải dệt, chất thải đô thị, vỏ cây, một số loại nấm sản xuất lacier thuộc lớp Ascomycete và Basidiomycete cũng đƣợc phân lập là Coriolopsis byrsina, Cerrena unicolor, Diaporthe phaseolorum , Pestalotiopsis uvicola là nấm có nguồn gốc từ biển. Các vi khuẩn sản xuất laccase quan trọng nhƣ Bacillussubtilis, Azospirillum lipoferum, Streptomyces coelicolor,... 10 Xạ khuẩn: streptomyces,... 1.5.3. Trong nấm Laccase từ nấm đƣợc nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces, ngoài ra còn có các nấm nhƣ Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces,... Nấm Basidiomycetes màu trắng thối có hiệu quả làm suy giảm lignin so với Ascomycetes và Deuteromycetes làm oxy hóa các hợp chất phenolic để tạo ra các gốc phenoxy và quinin [14]. 1.5.4. Trong côn trùng Laccase đã đƣợc tìm thấy trong lớp biểu bì của nhiều loài côn trùng từ nhộng tằm, lớp biểu bì của bọ cánh cứng màu đỏ, Tribolium castaneum. Gần đây, một laccase trong tuyến nƣớc bọt của N. Cincticeps [4]. 11 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase từ rừng núi Luốt. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu gỗ thu thập từ rừng ở núi Luốt. - Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase cao. - Xác định sơ bộ các đặc điểm sinh hóa của chủng nấm tuyển chọn. - Xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của nấm đƣợc tuyển chọn. 2.3.Vật liệu nghiên cứu Các đoạn gỗ mục, sợi tơ nấm bám trên gỗ ở núi Luốt Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp. 2.4. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm là hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm nhƣ: C72H56O46, KH2PO4, KNO3, MgSO4.7H2O, KCl, glucose, agar, CMC, tinh bột, cogo red,... 2.4.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 2.4.1.1. Hóa chất sử dụng Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm là hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm nhƣ: C72H56O46, KH2PO4, KNO3, MgSO4.7H2O, KCl, glucose, agar, CMC, tinh bột, cogo red,... 2.4.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu - Môi trƣờng thạch PDA dùng để phân lập nấm Hóa chất g/l Dịch chiết khoai tây 200 Glucose 20 Agar 20 Kháng sinh Chloramphenicol 2 12 - Môi trƣờng giữ giống SNA dùng để cất giữ giống Hóa chất g/l KH2PO4 1 KNO3 1 MgSO4.7H2O 0,5 KCl 0,5 Glucose 0,2 Sacarose 0,2 Agar 15 - Môi trƣờng định tính Laccase là môi trƣờng tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh enzyme laccase Hóa chất Dịch chiết khoai tây Glucose Agar Acid Tannic - Môi trƣờng PDB lỏng g/l 200 20 20 0,4 - 0,8% Hóa chất g/l Dịch chiết khoai tây 200 Glucose 20 - Môi trƣờng phân giải tinh bột hoạt tính enzyme laccase qua vòng phân giải Hóa chất Agar Tinh bột - Môi trƣờng phân giải cellulase Hóa chất Agar CMC(mặn, ngọt) 2.4.2. Dụng cụ, thiết bị g/l 15 0,5% g/l 15 0,5% Dụng cụ, thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các loại máy móc, trang thiết bị có ở phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, gồm: - Dụng cụ: + Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri; + Cốc đong, ống đong, ống fancol, ống effendof; + Đầu côn; 13 + Một số dụng cụ khác. - Thiết bị sử dụng: Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm STT Tên thiết bị Xuất xứ STT Tên thiết bị Xuất xứ 1 Box vô trùng Mỹ 6 Bếp điện/ bếp từ Hàn Quốc 2 Tủ ấm Trung Quốc 7 Tủ lạnh Nhật 3 Nồi hấp khử trùng Trung Quốc 8 Máy lắc Hàn Quốc 4 Cân điện tử Anh 9 Tủ sấy Đức Lò vi sóng Mỹ 10 5 Kính hiểm vi quang học Đức 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp phân lập nấm mốc từ gỗ mục - Lấy mẫu và phân lập mốc từ gỗ mục + Mẫu nấm đƣợc thu trên các thân cây gỗ mục từ núi Luốt Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp và đƣợc giữ trong các túi nylon vô trùng khác nhau. Ghi tên mẫu, đánh số thứ tự các vị trí lấy. Tại phòng thí nghiệm, các mẫu chƣa phân tích ngay sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC. + Tạo ra các khuẩn lạc nấm riêng rẽ từ các mẩu gỗ mục. - Tiến hành + Các mẫu gỗ mục đƣợc rửa bằng nƣớc sạch, dùng dao vô trùng cắt gỗ mục thành các mảnh nhỏ và đƣợc rửa lại qua nƣớc cất khử trùng. + Dùng que cấy vô trùng lấy sợi nấm bám trên gỗ cấy trực tiếp lên môi trƣờng thạch PDA (bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,2%) + Nấm đƣợc nuôi ở nhiệt độ 30oC sau 2 -5 ngày. Sau đó làm thuần nấm bằng cách tiếp tục cấy truyền các tản nấm trên bề mặt môi trƣờng PDA có bổ sung chloramphenicol từ 2 - 3 lần. 2.5.2.Phương pháp giữ giống nấm 14