Tài liệu Nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hướng ghép tự thân trong điều trị vết thương mạn tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------- ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------- ĐỊCH THỊ KIM HƢƠNG NGHIÊN CỨU, PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO GỐC MỠ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TỰ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG MẠN TÍNH Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS.BS. Đinh Văn Hân 2. PGS. TS. Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.BS. Đinh Văn Hân và PGS. TS. Nguyễn Lai Thành – những người thầy đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong những năm qua, những kiến thức nền tảng mà thầy cô nhiệt tâm truyền lại sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai. Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học Tế bào - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho em hoàn thành khóa học. Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh, chị, em tại Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng trong điều trị Bỏng, khoa Liền vết thương – Viện Bỏng Quốc Gia đã quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài. Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành bản luận văn này! Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2016 Học viên Địch Thị Kim Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 ........................................................................................................................ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3 1.1. Tổng quan về tế bào gốc ....................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm tế bào gốc ..................................................................................... 3 1.1.2. Phân loại tế bào gốc ....................................................................................... 3 1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) và tế bào gốc trung mô từ mô mỡ...................................................................................................................... 5 1.3. Vết thương và các yếu tố tham gia liền vết thương .............................................. 9 1.3.1. Diễn biến quá trình liền vết thương ............................................................... 9 1.3.2. Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương ............................ 11 1.4. Vết thương mạn tính ........................................................................................... 12 1.4.1. Các đặc điểm chính của vết thương mạn tính ............................................. 12 1.4.2. Một số loại vết thương mạn tính điển hình ................................................. 13 1.4.3. Nguyên nhân và điều trị vết thương mạn tính ............................................. 15 1.5. Vai trò của tế bào gốc trong liền vết thương ...................................................... 18 1.6. Một số ứng dụng tiêu biểu của tế bào gốc trung mô trên lâm sàng.................... 20 1.6.1. Ứng dụng trên điều trị tổn thương mạn tính do xạ trị ................................. 20 1.6.2. Ứng dụng trên điều trị vết loét mạn tính do tiểu đường .......................... 2021 1.7. Đánh giá an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh ............................ 221 1.7.1. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua nhiễm sắc thể đồ .................................................................................................. 223 1.7.2. Đánh giá an toàn tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh thông qua định lượng enzyme telomerase .................................................................................... 245 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 28 2.1. Đối tượng, nguyên - vật liệu nghiên cứu ............................................................ 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 28 2.2.2. Hóa chất cơ bản cho nghiên cứu ................................................................. 28 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 299 2.2.1. Thu mô mỡ và phân lập tế bào .................................................................. 299 2.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào ASCs .................................................................. 30 2.2.3. Xác định số lượng tế bào ............................................................................. 30 2.2.4. Bảo quản và phục hồi tế bào sau bảo quản.................................................. 31 2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái tế bào trong nuôi cấy tăng sinh ..................... 32 2.2.6. Xác định khả năng tạo dòng của tế bào ....................................................... 32 2.2.7. Lập kiểu nhân của tế bào ............................................................................. 32 2.2.8. Tách chiết và định lượng enzyme telomerase của tế bào sau nuôi cấy tăng sinh......................................................................................................................... 33 2.2.9. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc mô mỡ đến nguyên bào sợi in vitro .............................................................................................................. 34 2.2.10. Theo dõi bệnh nhân có vết thương mạn tính được ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ........................................................................................................ 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................ 377 3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ........................................................... 377 3.2. Đặc điểm phân lập và hình thái tế bào ............................................................... 38 3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc mỡ............................................................. 40 3.4. Nuôi cấy tăng sinh và nhân rộng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .................... 444 3.5. Về việc đánh giá tính an toàn của ASCs sau nuôi cấy tăng sinh ...................... 455 3.6. Tác động của tế bào gốc mỡ bệnh nhân lên nguyên bào sợi da in vitro ............ 51 3.7. Theo dõi quá trình liền vết thương ở một ca sau ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .............................................................................................................................. 52 KẾT LUẬN ................................................................................................................. 56 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả xử lý mẫu mô mỡ và test mycoplasma ........................................... 36 Bảng 3.2. Số lượng tế bào thu được từ mô sau khi xử lý bằng collagenase ................. 38 Bảng 3.3. Tỷ lệ tạo colony của hỗn dịch tế bào thu được từ mô mỡ …… ............... …41 Bảng 3.4. Khả năng tạo CFU-F theo các thế hệ tế bào ................................................ 44 Bảng 3.5. Thời gian đạt trạng thái cận che phủ hoàn toàn của tế bào gốc mô mỡ ........ 46 Bảng 3.6. Nồng độ Telomerase của các thế hệ tế bào nuôi cấy tăng sinh .................... 49 Bảng 3.7. Số lượng tế bào ở mẫu nghiên cứu và đối chứng ........................................ 51 Bảng 3.8. Tỷ lệ sống của nguyên bào sợi sau khi trypsin ............................................. 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vết thương do nhiễm trùng ........................................................................... 11 Hình 1.2. Vết thương sau xạ trị ..................................................................................... 12 Hình 1.3. Vết loét mạch máu ......................................................................................... 13 Hình 1.4. Vết loét chi dưới do bệnh tiểu đường ............................................................ 13 Hình 1.5. Vết loét do tì đè ............................................................................................ 14 Hình 1.6. Cấu trúc vùng T-loop của telomere ............................................................... 24 Hình 1.7. Chiều dài telomere và hoạt tính của telomerase ở các dòng tế bào ung thư phổi .............................................................................................................................. 26 Hình 3.1. Hình thái tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy .......................................................... 39 Hình 3.2. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 1) ....................................... 42 Hình 3.3. Các đĩa colony sau khi nhuộm giemsa (mẫu số 15) ..................................... 42 Hình 3.4. Hình thái colony của các mẫu nghiên cứu theo thời gian ............................ 43 Hình 3.5. Đường cong tăng trưởng của tế bào gốc mỡ ................................................. 44 Hình 3.6. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ định dạng theo từng nhiễm sắc thể .... 47 Hình 3.7. Bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mỡ ở lần cấy truyền thứ 5 (P5) ................. 48 Hình 3.8. Chiều dài telomere và sự biểu hiện của telomerase ở một số dòng tế bào .... 50 Hình 3.9. Vết thương sau khi ghép ở các thời điểm theo dõi ........................................ 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AB Antibiotic/Antimycotic - Kháng sinh ASCs Adipose-derived Stem Cells - Tế bào gốc mỡ bFGF Basic fibroblast growth factor – Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi D’MEM Dubeco’s Modified Eagle Medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM EGF Epidermal Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal Bovine Serum - Huyết thanh bào thai bò FGF Fibroblasts Growth Factor - Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi MSCs Mesenchymal stem cells - Tế bào gốc trung mô P Passage- Cấy truyền PBS Phosphat Buffer Saline - Dung dịch đệm phosphate TNF – β Tumor Necrosis Factor – β – Nhân tố gây hoại tử khối u β TB Tế bào VEGF Vessle Endothelial Growth Factor – Nhân tố tăng trưởng tế bào nội mô MỞ ĐẦU Ứng dụng của tế bào gốc đã tạo ra tiềm năng lớn cho y học tái tạo nhờ khả năng duy trì được đặc tính gốc trong thời gian dài cùng với đặc tính biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau trong những điều kiện nhất định. Tế bào gốc có khả năng thay thế các tế bào bị hư hỏng và nhờ đó có khả năng điều trị bệnh. Đặc tính thay thế này đã được sử dụng trong điều trị bỏng sâu, rộng; khôi phục hệ thống máu ở những bệnh nhân bị các bệnh rối loạn về máu; chữa trị các tổn thương trong gan và não bộ. Đồng thời, nó mở ra triển vọng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư. Tế bào gốc là công cụ rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tật và có tiềm năng lớn để sử dụng trong lâm sàng. Cho đến nay, các loại tế bào gốc không phải là tế bào gốc phôi được ứng dụng trong y học thành công hơn cả mặc dù tiềm năng của chúng đã ít nhiều bị hạn chế hơn so với tế bào gốc phôi. Loại tế bào gốc hiện đang được sử dụng cho điều trị bao gồm 3 nhóm chính: Tế bào gốc tạo máu; Tế bào gốc trung mô và Tế bào gốc biểu mô. Trong số 3 nhóm nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (Adipose Derived Stem Cells – ASCs) đã và đang được quan tâm rất nhiều bởi tiềm năng to lớn trong ứng dụng điều trị. Thứ nhất, mô này rất phổ biến, có nhiều trong cơ thể người, dễ dàng thu nhận mà không gây xâm hại lớn tới cơ thể như tủy xương. Điều này đồng nghĩa với việc thu nhận được lượng tế bào gốc trung mô trong mỡ phong phú hơn so với tủy xương. Hơn nữa, để thu thập mô mỡ, bệnh nhân chỉ cần phải gây tê cục bộ và vết thương trên bệnh nhân sau khi thu mỡ dễ dàng liền lại trong thời gian ngắn. Thứ hai, mô này dễ dàng được tự bồi đắp trong cơ thể. Thứ ba và đây là lý do quan trọng nhất, nó là nguồn tế bào gốc thuận lợi cho sử dụng để ghép tự thân. Với những lý do nói trên, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được coi là nguồn tế bào gốc trưởng thành tự thân lý tưởng cho các nghiên về y học tái tạo, công nghệ mô và liền vết thương. Vết thương mạn tính là hệ quả của nhiều căn bệnh như dị ứng, tiểu đường, bỏng sâu, bệnh về hệ cứu thống miễn dịch da hoặc các trường hợp tai nạn giao thông dẫn tới liệt hoặc những người già ốm nằm một chỗ lâu ngày gây loét da... Các vết thương này nếu không điều trị nhanh chóng thì sẽ gây viêm nhiễm kéo dài làm cơ thể mất dịch, mất chất dinh dưỡng và suy kiệt. Trường hợp cơ thể có sức đề 1 kháng kém sẽ dẫn tới viêm phổi, viêm đường tiết niệu, thậm chí là nhiễm trùng máu và gây tử vong. Có rất nhiều phương pháp điều trị vết thương mạn tính như dùng thuốc kích thích sự phát triển tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser nhưng hiệu quả thấp, các can thiệp phẫu thuật thường thất bại hoặc ít khi được áp dụng do sức khỏe bệnh nhân không cho phép phẫu thuật hoặc khổng thể tự phục hồi vết thương. Vì vậy, nhu cầu điều trị vết thương bằng ghép tế bào gốc là rất lớn, nhu cầu này đặc biệt tăng cao ở những bệnh nhân lớn tuổi. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc mỡ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mỡ định hƣớng ghép tự thân trong điều trị vết thƣơng mạn tính” nhằm hai mục tiêu sau: 1. Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào gốc mỡ trong nuôi cấy ở bệnh nhân có vết thương mạn tính 2. Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc mỡ sau nuôi cấy tăng sinh 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về tế bào gốc 1.1.1. Khái niệm tế bào gốc Tế bào gốc là loại tế bào có khả năng phân chia không giới hạn để tạo ra các tế bào gốc có chức năng tương tự (duy trì tính gốc) và trong những điều kiện nhất định, chúng có thể biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng riêng biệt nhằm bổ sung và/ hoặc thay thế các tế bào bị tổn thương hay già cỗi. Tế bào gốc được phân biệt với tế bào thông thường bởi 2 đặc điểm chính: Thứ nhất, chúng là các tế bào chưa biệt hóa có khả năng tự đổi mới thông qua quá trình nguyên phân, thường ở trạng thái ít hoạt động (đôi khi chúng ở trạng thái bất hoạt trong thời gian dài). Thứ hai, dưới tác động của các điều kiện môi trường xung quanh, chúng có thể biến đổi thành các tế bào đặc hiệu cho mô hoặc cơ quan với các chức năng đặc biệt. Ở một số cơ quan như niêm mạc ruột, biểu bì da hay tủy xương, các tế bào gốc thường phân chia liên tục để sửa chữa và thay thế các tế bào già yếu hoặc bị tổn thương. Tuy nhiên, ở nhiều cơ quan khác như tụy, tim, cơ, thần kinh thì các tế bào gốc chỉ phân chia dưới các điều kiện đặc biệt [14]. 1.1.2. Phân loại tế bào gốc Dựa theo khả năng biệt hoá, tế bào gốc có thể phân loại thành các loại sau [51]: - Tế bào gốc toàn năng (Totipotent Stem Cells): chỉ thấy ở thời kỳ sớm của phôi thai trong giai đoạn phôi 8 tế bào. Mỗi tế bào đều có khả năng tạo thành một cơ thể hoàn chỉnh với khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể. - Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent Stem Cells): Loại tế bào này tồn tại dạng không biệt hoá ở lớp tế bào trong của túi phôi, có thể biệt hóa thành hơn 200 loại tế bào khác nhau trong cơ thể. - Tế bào gốc đa tiềm năng (Multipotent Stem Cells): Đây là loại tế bào có nguồn gốc từ mô của bào thai, máu cuống rốn, và tế bào gốc trưởng thành. Chúng có thể biệt hóa thành một số loại tế bào có quan hệ mật thiết với nhau. 3 - Tế bào gốc vài tiềm năng (Oligopotent stem cells): Loại tế bào này sở hữu khả năng biệt hóa thành một số ít loại tế bào như các tế bào gốc lympho. - Tế bào gốc đơn tiềm năng: Đây là loại tế bào có khả năng biệt hóa thành một loại tế bào nhất định. Hầu hết các mô biểu mô đều được tự đổi mới trong suốt đời sống nhờ sự có mặt của các tế bào gốc đơn tiềm năng này. Theo nguồn gốc tế bào, cho đến nay, các nhà khoa học đã tiếp cận với 4 loại tế bào gốc trong cơ thể người và động vật: Tế bào gốc phôi, tế bào gốc trưởng thành, tế bào gốc ung thư và tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (iPSCs). Tế bào gốc phôi là các tế bào gốc được tách từ phôi dâu và phôi nang ở giai đoạn phát triển trước khi làm tổ trong tử cung. Sự biệt hóa đầu tiên ở tế bào gốc phôi người xảy ra vào khoảng ngày thứ 3 - 5 của sự phát triển. Khi đó, các tế một bào ở lớp ngoài trở thành phần của nhau thai và phân biệt với khối tế bào bên trong (Inner cell mass – ICM) – tế bào nút phôi. Mỗi tế bào nút phôi đều có tiềm năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào thuộc các có quan khác nhau trong cơ thể như như tim, phổi, tinh trùng, trứng và các mô khác nhưng khả năng này của chúng giảm nhanh chóng sau khi làm tổ. Tuy nhiên, nếu khối tế bào bên trong được tách khỏi môi trường bình thường của phôi và được nuôi cấy trong một số điều kiện thích hợp, các tế bào có nguồn gốc từ nút phôi có thể tiếp tục phân chia và vẫn duy trì được tiềm năng biệt hóa để tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể. Chúng là những tế bào vạn tiềm năng [51]. Tế bào gốc trưởng thành là tế bào gốc của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến cơ thể trưởng thành, được tìm thấy ở mô hay cơ quan xác định và thường tồn tại trong các ổ (stem cell niche) như máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, tủy xương,... Chúng là các tế bào gốc đơn tiềm năng hay đa tiềm năng vì có thể tự đổi mới và biệt hóa thành một hay một số loại tế bào đặc hiệu mô. Vai trò chính của các tế bào gốc trưởng thành trong cơ thể sống là duy trì và sửa chữa mô mà chúng có khả năng biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa cho mô đó. Gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung khai thác các tế bào gốc từ bánh nhau, dây rốn. Thành công về công nghệ đã có thể tách và nhân lên các tế bào gốc nhưng chỉ có những bệnh nhân có bảo quản dây rốn - bánh nhau khi sinh ra mới có cơ hội được dùng những nguồn tế bào gốc này. Hiện nay, chỉ có số ít người lưu trữ dây rốn hay bánh nhau của em bé sau khi sinh do chi 4 phí bảo quản khá tốn kém và xác suất những người lưu trữ mô lại có bệnh cần được điều trị bằng tế bào gốc này cũng không phải cao. Các tế bào gốc ung thư được định nghĩa là những tế bào gốc có mặt trong khối u. Chúng có khả năng tự biến đổi và phân chia mà không có khả năng kiểm soát số lượng tế bào. Tuy chiếm tỷ lệ rất ít trong khối u nhưng chúng lại có trách nhiệm trong sự tăng trưởng của khối u. Các tế bào gốc ung thư hiếm gặp đã được phân lập từ một số khối u của con người, bao gồm ung thư máu, não, ruột và ung thư vú. Các khái niệm ung thư tế bào gốc có ý nghĩa quan trọng trong điều trị ung thư. Năm 2006, các nhà khoa học đã tạo ra một bước đột phá bằng cách xác định các điều kiện có thể cho phép các yếu tố và gen quan trọng biểu hiện nhằm duy trì các đặc tính của tế bào gốc phôi ở tế bào đã biệt hóa. Đây là loại tế bào gốc nhân tạo, được gọi là tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem Cells - iPSCs). Các iPSCs của chuột đã chứng tỏ các đặc tính quan trọng của tế bào gốc vạn tiềm năng, bao gồm biểu hiện một số marker đặc trưng cho tế bào gốc, hình thành các tế bào u có nguồn gốc từ 3 lớp mầm và có thể tham gia vào tạo nhiều mô khác nhau khi tiêm vào phôi chuột ở giai đoạn phát triển phôi sớm. Các iPSCs của người cũng biểu hiện các marker tế bào gốc và có khả năng tạo ra các tế bào với các đặc tính của 3 lớp mầm (ngoại phôi bì, trung phôi bì và nội phôi bì). Mặc dù cần có các nghiên cứu bổ sung về iPSCs nhưng loại tế bào này đã trở thành những công cụ hữu ích cho việc phát triển thuốc và nghiên cứu bệnh tật. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu và hy vọng sẽ sử dụng chúng trong y học cấy ghép đặc biệt là ghép tự thân. Công nghệ tạo tế bào iPSCs vạn tiềm năng cùng với những nghiên cứu về các loại tế bào gốc đa tiềm năng khác sẽ góp phần giúp các nhà nghiên cứu tìm ra cách tái lập trình các tế bào để sửa chữa các mô tổn thương trong cơ thể người. 1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) và tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Đặc điểm chung và sự phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô Việc phát hiện ra tính chất đa tiềm năng của tế bào gốc trung mô là một bước đột phá trong lĩnh vực tế bào gốc. Tế bào gốc trung mô lần đầu tiên được mô tả là dạng tế bào từ tủy xương có khả năng tạo dòng, bám dính bề mặt nuôi cấy và có khả 5 năng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào xương và tế bào sụn. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy trong nhau thai, máu cuống rốn, lớp Wharton's jelly, dịch ối, tủy răng, mô mỡ, lớp trung bì của da [61]. Chúng có khả năng duy trì tính gốc và biệt hóa thành một vài loại tế bào chuyên hóa khác nhau như tế bào xương, sụn, mỡ và mô liên kết. Vai trò nội sinh của MSC nói chung là duy trì các ổ tế bào gốc và từ đó, chúng tham gia vào cân bằng nội môi, chữa lành vết thương, và tái tạo mô. Nguồn tế bào gốc này vượt trội hơn so với tế bào gốc phôi hay tế bào gốc trưởng thành bởi những ưu điểm sau: - Không gặp phải vấn đề về y đức: Việc sử dụng mỗi tế bào gốc phôi đồng nghĩa với việc phá hủy một cá thể người nên tế bào gốc phôi bị cấm sử dụng trong các nghiên cứu khoa học. Trong khi đó, việc sử dụng tế bào gốc mỡ rất ít ảnh hưởng tới sức sống của người hiến và mô mỡ khá dễ được tái tạo trở lại. - Giảm thiểu hiện tượng đào thải miễn dịch - Có khả năng sinh sản mạnh mẽ khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp và tiềm năng biệt hoá cao Nhờ những ưu điểm này mà MSCs thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu và là nguồn tế bào hứa hẹn đầy triển vọng trong tái tạo mô. Trước đây, nguồn tế bào gốc tạo máu như tủy xương và tế bào gốc máu cuống rốn được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu và điều trị các bệnh về máu, còn các bệnh nhân cần có sự tái tạo thuộc hệ thống trung mô rất thường gặp như các vết thương, vết loét, bệnh lý hệ mạch, não, tim,…thì lại rất ít được ứng dụng. Nuôi cấy và phân lập tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô ở người được phân lập dựa trên đặc tính bám dính và có khả năng phân chia tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Tuy nhiên, phương pháp này dẫn tới sự hình thành nhiều loại tế bào không đồng nhất (các tế bào gốc tồn tại cùng các tế bào tiền thân của chúng). Vì vậy, thiết lập một quy trình hoàn thiện về phân lập, xác định đặc điểm và nuôi cấy tăng sinh MSCs là điểm mấu chốt để sử dụng chúng một cách thành công trong y học tái tạo [34]. MSCs từ tủy xương, máu ngoại vi và dịch khớp đã được phân lập bằng phương pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng nhờ sử dụng dung dịch Ficoll rồi cấy vào các đĩa nhựa [60, 46, 37]. Trong quá trình phân lập MSCs từ tủy xương, một số tế bào gốc tạo máu cũng bám dính vào đĩa 6 nuôi cấy nhưng chúng dần dần được loại bỏ thông qua các lần cấy truyền và cuối cùng, chỉ còn lại các tế bào tương tự nguyên bào sợi [14]. MSCs từ các nguồn khác như mô mỡ, tủy răng, nội mạc tử cung, da, nhau thai, Wharton’s Jelly thường được phân lập sau khi sử dụng collagenase và được nuôi cấy ở các mật độ khác nhau [53, 63]. Gần đây, một phương pháp hiệu quả để phân lập MSCs từ tủy xương là sử dụng thiết bị lọc tủy xương. Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian và tránh nguy cơ nhiễm do các yếu tố bên ngoài. MSCs từ các mô khác nhau đều được nuôi cấy trong môi trường D’MEM, D’MEM-F12, αMEM, D’MEM-LG, D’MED-HG và RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) [51, 63]. Môi trường nuôi cấy nguyên thủy được bổ sung 10% FBS hoặc huyết thanh bê (FCS - fetal calf serum). Bên cạnh môi trường cùng các yếu tố bổ sung, nồng độ oxy cũng ảnh hưởng tới sự phát triển của MSCs [45]. Sự tăng trưởng của MSCs trong môi trường D’MEM có nồng độ glucose thấp cũng được ghi nhận khi có sự tham gia của FGF, EGF và B27 [48]. Môi trường D’MEM có bổ sung 10% FBS là loại môi trường được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy MSCs in vitro. Kỹ thuật đánh giá sự tăng sinh, phát triển của MSCs sau nuôi cấy Phương pháp phổ biến nhất để đánh giá sự phát triển của MSCs trong môi trường in vitro là xác định tỷ lệ sống/ chết của các tế ở đĩa sau một thời gian nuôi cấy dựa trên sự hấp thụ với một số loại thuốc nhộm nhất định. Chẳng hạn, xanh trypan, xanh methylene, eosin,…được dùng để nhuộm tế bào chết. Theo đó, các tế bào sống và tế bào chết được phân biệt bởi khả năng bắt màu thuốc nhuộm của tế bào bị chết do màng tế bào thay đổi tính thấm và cho phép thuốc nhuộm đi qua màng. Trái lại, tế bào sống không cho phép thuốc nhuộm hay các chất gây độc tế bào đi qua màng nên không bắt màu thuốc nhuộm. chúng. Phức tạp hơn, người ta có thể sử dụng kỹ thuật đánh giá sự hô hấp nội sinh ở tế bào còn sống như kỹ thuật MTT (MTT assays). Phương pháp này dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím nhờ enzyme hô hấp ở ty thể. Số lượng tế bào tỷ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị OD -570 nm. 7 Để phân tích sự tăng sinh của tế bào có khả năng bám dính vào bề mặt nuôi cấy theo thời gian, người ta còn sử dụng hệ thống xCELLigence dựa trên việc sử dụng các đĩa nuôi cấy được tráng một lớp fibronection hoặc laminin, collagen,…và có gắn điện cực vàng ở đáy. Thông thường, tế bào được nuôi cấy ở mật độ 2x105 tế bào/ giá thể trong 14 ngày cho đến khi độ che phủ đạt khoảng 80 90%. Điện trở của hỗn dịch tế bào được đo sau mỗi 1h và liên tục trong khoảng thời gian chừng 10 ngày. Từ đó, đường cong tăng trưởng của tế bào được xây dựng dựa trên thời gian tăng sinh của chúng. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (Adipose-derived stem cells – ASCs) Tế bào gốc đa tiềm năng được phát hiện trong mô mỡ của người được gọi là tế bào gốc mô mỡ (ASC). Tế bào gốc mô mỡ lần đầu tiên được xác định là tế bào gốc trung mô vào năm 2001 [71] và từ đó mô mỡ được nghiên cứu trong công nghệ mô và y học tái tạo. Các nhà nghiên cứu đề xuất nhiều cách thức phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô chủ yếu dựa vào hình thái cùng đặc tính bám dính vào bề mặt nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường nuôi cấy cũng được công bố ở nhiều dạng công thức khác nhau. Các môi trường cơ bản thường được dùng là D’MEM, DMEM-F12, CMRL1066... với thành phần và hàm lượng các chất bổ sung như glucose chưa có sự thống nhất. Do tế bào gốc mô mỡ biểu hiện các marker tế bào đặc hiệu cho tế bào gốc trung mô: CD34, CD44, CD106, CD117, và STRO-1 mà không biểu hiện các marker dòng tạo máu (CD31, CD144, yếu tố von Willebrand) nên các nhà nghiên cứu dựa vào sự liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên bề mặt tế bào gốc trung mô để tách tế bào gốc trung mô khỏi nhóm các tế bào khác [31]. Các tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong điều kiện nuôi cấy có thể biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn, nguyên bào cơ, và các dòng tế bào mầm của mô mỡ [51]. Ngày nay, tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ được xác định là rất giống nhau về quần thể tế bào và kiểu hình tế bào [34, 58]. Có hai kiểu mô mỡ chính khác nhau về hình thái và chức năng: mô mỡ màu trắng và mô mỡ nâu. Mỡ trắng trữ năng lượng dưới dạng lipid (triglyceride) và sản xuất các hormone trong khi mỡ nâu cung cấp nhiệt lượng cho cơ thể. ASCs được tìm thấy ở mô mỡ trắng ở khu vực quanh mạch máu. Zuk và cs [71] đã phát 8 triển một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân lập ASCs từ mô mỡ trắng vào năm 2001: Mô mỡ được cắt nhỏ và bị phân cắt với enzym collagenase loại II rồi ly tâm. Sau khi ly tâm, phần lắng được gọi là phân lớp mạch nền (stroma vascular fraction - SVF) chứa khoảng 2.000.000 - 6.000.000 tế bào sau khi tách từ 1ml mỡ hút được sau khi xử lý. SVF chứa gồm các loại tế bào khác nhau như tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mỡ, tế bào gốc tạo máu và các tế bào không phải tế bào gốc như nguyên bào sợi, tế bào máu, tiền thân tế bào mỡ và tế bào quanh mao mạch, các tế bào nội mô, tế bào tiền thân nội mô, các tế bào cơ trơn, bạch cầu, hồng cầu. Nhưng hiệu quả của kỹ thuật này còn thấp do tỷ lệ tế bào gốc trong phân lớp mạch nền không cao [31]. Để phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, tất cả các tế bào đều được nuôi trên bề mặt nuôi cấy plastic trong một khoảng thời gian. Khi đó, các tế bào có khả năng bám dính bám trên bề mặt nuôi cấy có khả năng sống sót trong khi các tế bào phát triển huyền phù như tế bào tạo máu không có khả năng tăng sinh sẽ bị loại bỏ trong quá trình nuôi cấy. Sau vài lần cấy truyền, các tế bào không phải tế bào gốc như tế bào nội mô có khả năng tăng sinh và chu kỳ sống có giới hạn không thể duy trì trong điều kiện nuôi cấy nên cũng mất đi trong quá trình nuôi. Quần thể tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy này có thể được duy trì trong điều kiện in vitro trong thời gian tương đối dài với khả năng tăng sinh ổn định và có khả năng biệt hóa thành các dạng tế bào khác nhau. 1.3. Vết thƣơng và các yếu tố tham gia liền vết thƣơng Vết thương là tình trạng tổn thương thường gặp do tai nạn hoặc do các thủ thuật can thiệp chẩn đoán và điều trị. Ngoài ra, vết thương còn là biến chứng của nhiều bệnh nội – ngoại khoa khác như loét do tỳ đè, loét do tiểu đường, loét do suy tĩnh mạch hay xạ trị,…[1]. 1.3.1. Diễn biến quá trình liền vết thương Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua 4 giai đoạn chính: giai đoạn đông máu, giai đoạn viêm, giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tái lập mô [22]. Đây là quá trình mà mô bị tổn thương được phục hồi, tái tạo các tế bào mới và tổ chức, sắp xếp lại các thành phần của mô để tạo sẹo hoặc phục hồi chức năng của mô/ cơ quan. Giai đoạn đông máu: Ngay sau khi bị thương, tiểu cầu cùng các yếu tố tăng trưởng, các yếu tố đông máu được hoạt hóa và tác động tới các mao mạch nhỏ. Từ 9 đó, cục máu đông hình thành và ngăn chặn sự chảy máu tại vết thương. Khi vết thương quá sâu hoặc mạch máu lớn bị tổn thương thì cục máu đông này khó kịp hình thành nên cần garo, băng gạc để ngăn chặn sự chảy máu. Giai đoạn viêm: Giai đoạn này diễn ra trong khoảng thời 24 – 48h sau khi bị thương, tính thấm thành mạch tăng lên để các kháng thể và các protein chủ chốt tham gia liền vết thương như fibrin, fibronectin đi vào mô. Bạch cầu đa nhân trung tính tham gia dọn dẹp những vật thể lạ xâm nhập vào vết thương bằng cách thực bào. Sự kích hoạt quá trình viêm sẽ gửi đi các tín hiệu mang tính hóa ứng động để lôi kéo các bạch cầu đơn nhân tới vết thương để loại bỏ những vật ngoại lai còn lại và thúc đẩy các yếu tố tăng trưởng tạo ra nhiều tín hiệu liền vết thương khác nhau. Giai đoạn tăng sinh: Sau giai đoạn cầm máu và loại bỏ các yếu tố ngoại lai thì giai đoạn tăng sinh bắt đầu diễn ra, thường ở ngày thứ 2 sau khi bị thương. Giai đoạn này được đặc trưng bởi hàng loạt các sự kiện nhằm duy trì tính toàn vẹn của mạch, thay thế mô bị tổn thương và tái tạo vết thương. Trong đó, các mạch mới được tạo ra trong vùng tổn thương, các nguyên bào sợi tăng sinh và sản xuất chất nền ngoại bào, mép vết thương co rút và tế bào sừng di cư che phủ kín vết thương. Để tạo được mạch máu mới đưa dinh dưỡng đi tới mô tổn thương, tế bào nội mô được tách khỏi những mạch máu lành lặn, di cư tới vùng tổn thương và tăng sinh tại đó. Các yếu tố tăng trưởng, các yếu tố hóa ứng động và các protein do các tế bào viêm tiết ra có trách nhiệm khởi đầu sự di cư của các tế bào nội mô mạch máu. Các yếu tố tăng trưởng đóng vai trò chính trong điều khiển toàn bộ quá trình tăng sinh mạch gồm: FGF, TNF – β, EGF và yếu tố tăng sinh mạch vùng tổn thương (WAF – Wound Angiogenesis Factor). TNF – β tác động trực tiếp bằng cách kích thích đại thực bào di cư và sau đó giải phóng yếu tố sinh mạch, từ đó tạo ra hệ thống mao mạch mới nuôi dưỡng vết thương [44]. Quá trình tăng sinh nguyên bào sợi diễn ra khi những nguyên bào sợi ở những vùng xung quanh di chuyển tới vết thương, những nguyên bào sợi này tăng sinh, kết hợp với collagen, proteoglycan, glycosamin sẽ hình thành nên chất nền mô liên kết tế bào hạt. Thời kỳ này thường diễn ra trong vòng 7 – 14 ngày sau khi bị thương, trong đó có sự giảm nhanh của đại thực bào và thay thế vào đó là sự tăng sinh của nguyên bào sợi. Thêm vào đó, nguyên bào sợi được kích thích tiết ra 10 PDGF, TNF – β để điều khiển quá trình tổng hợp và lắng đọng các thành phần đệm gian bào bao gồm: fibronectin, laminin, glycosaminoglycans (GAGs) và collagen [50]. Sự kết hợp giữa nguyên bào sợi với các thành phần đệm gian bào hình thành chất nền mô liên kết, thúc đẩy quá trình hình thành cấy trúc mô bị tổn thương và tạo ra độ bền vững cho vết thương. Sau khi có đệm gian bào, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra nhằm tái lập hàng rào bảo vệ bề mặt vết thương và được xem là quá trình then chốt của quá trình liền vết thương. Với vết thương nhỏ, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra nhanh hơn và vì vậy vết thương mau lành. Ở vết thương lớn hoặc vết thương mạn tính, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra khó khăn hơn, đôi khi phải nhờ tớiphẫu thuật cấy ghép để hỗ trợ quá trình liền vết thương. Giai đoạn tái lập mô và liền sẹo: Giai đoạn này bắt đầu vào khoảng tuần thứ 3 sau khi bị thương và kéo dài nhiều tháng tới nhiều năm nhằmđảm bảo tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của mô. Đặc trưng của giai đoạn tái lập mô là tăng liên kết chéo collagen để tăng tính bền vững của mô liên kết; collagenase được kích hoạt để giảm sự tích tụ quá mức của collagen, hạn chế sẹo; giảm mạng lưới mao mạch; giảm thành phần proteoglycan và thay thế bằng thành phần nước của mô. 1.3.2. Các thành phần tế bào chủ yếu tham gia liền vết thương Diễn biến liền vết thương nói chung đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo. Tuy quá trình liền vết thương có nhiều cơ chế phức tạp nhưng kết quả cuối cùng là tạo ra các tế bào mới thay thế các tế bào đã bị tổn thương. Yếu tố tế bào chủ yếu tham gia vào liền vết thương trên da bao gồm 2 loại tế bào: nguyên bào sợi (Fibroblasts) và tế bào sừng (Keratinocytes). Nguyên bào sợi là tế bào tạo ra lớp trung bì còn tế bào sừng tạo ra lớp biểu bì. Hai loại tế bào này có những chức năng khác nhau nhưng lại tương tác, kết hợp với nhau để tạo ra cấu trúc da hoàn chỉnh. Khi da bị tổn thương, nguyên bào sợi là tế bào tổng hợp ra đệm gian bào, tiết các yếu tố tăng trưởng tạo điều kiện cho tế bào sừng từ bờ mép vết thương tăng sinh che phủ bề mặt và kết quả là làm lành vết thương [1]. Nguyên bào sợi: là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn tăng sinh, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá và cung cấp các sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó 11 giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thương. Chúng tạo ra các protein đệm mà trong đó collagen tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô. Đồng thời, nguyên bào sợi là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng có tác dụng kích thích liền vết thương như TGF-β, PDGF, KGF. Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts (nguyên bào sợi dạng cơ) tạo nên sự co rút và liền vết thương nhanh hơn. Ngoài ra, nguyên bào sợi còn tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo sau khi liền ở những vết thương lâu năm. Tế bào sừng: tạo nên lớp biểu bì bảo vệ da nhờ sự sắp xếp chặt chẽ thành nhiều lớp tế bào. Lớp mầm (còn gọi là lớp đáy) chứa các tế bào gốc biểu bì có khả năng tự tái sinh nhiều lần và nhanh trong suốt đời sống của cơ thể người. Giữa các tế bào sừng có các thể liên kết (desmosome) giúp chúng kết nối chặt chẽ với nhau. Các tế bào lớp đáy có cấu trúc cầu nối khác với các lớp ở trên, chúng có thể dễ dàng bị xoá bỏ và cũng tự tái tạo lại để các tế bào sừng mới sinh ra di chuyển lên trên tạo ra các lớp tế bào biệt hoá ở phía trên. Bình thường sự phân chia tế bào sừng lớp mầm cân bằng với sự sừng hoá bong vảy của biểu bì nhưng khi da bị tổn thương thì chúng tăng cường phân chia để tạo ra nhiều tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô sẽ di cư vào trung tâm của vết thương ở dạng đơn lớp cho đến khi các tế bào tiếp xúc trực tiếp với nhau thì tốc độ phân chia chậm lại và biệt hoá thành các lớp gai, lớp hạt, lớp sừng ở phía trên để thực hiện chức năng bảo vệ của biểu bì. Trong quá trình di cư chúng cần đệm gian bào đủ chất lượng như trung bì, chúng cần có các sợi decorin, laminin…để bám vào và trượt dọc theo các sợi đó để di chuyển vào trung tâm vết thương. Thông thường, một vết thương sẽ lành trong vòng một vài tuần. Tuy nhiên, có những vết thương lại không lành mặc dù đã trải qua các quá trình điều trị phục hồi về mặt giải phẫu và chức năng trong thời gian trên 3 tháng - những vết thương này được xếp vào nhóm vết thương mạn tính khó lành [22]. 1.4. Vết thƣơng mạn tính 1.4.1. Các đặc điểm chính của vết thương mạn tính Vết thương mạn tính có các đặc điểm chính sau: - Các quai mạch máu thoái triển, già và ít, các tế bào nội mô giảm phân chia nên tân mạch giảm, chất lượng mô hạt kém 12