Tài liệu Nghiên cứu sản xuất đường erythritol từ nấm men moniliella phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Nguyễn Thị Ánh Thao NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƢỜNG ERYTHRITOL TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Thị Ánh Thao NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƢỜNG ERYTHRITOL TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LÊ ĐỨC MẠNH TS. LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc tới PGS.TS. Lê Đức Mạnh và TS. Lê Hồng Điệp đã tận tình hƣớng dẫn, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các Cán bộ của Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và môi trƣờng - Viện Công nghiệp thực phẩm đã chia sẻ, hƣớng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình. Tôi c ng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo của Khoa Sinh học c ng nhƣ các thầy, các cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức nền tảng bổ ích. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố m , ông bà và những ngƣời thân trong gia đình đã luôn dành tình cảm và động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập. Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Ánh Thao Khóa 2014 - 2016 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. Đƣờng erythritol ...............................................................................................3 1.1.1. Cấu tạo và tính chất của đƣờng erythritol..................................................3 1.1.2. Lợi ích cho sức khỏe của đƣờng erythritol ................................................3 1.1.3. Ứng dụng của đƣờng erythritol .................................................................4 1.2. Công nghệ sản xuất ertythritol từ tinh bột ...............................................................4 1.3. Tình hình sản xuất erythritol trên thế giới và ở Việt Nam ...............................6 1.4. Nấm Moniliella...................................................................................................7 1.4.1. Đặc điểm cơ bản của nấm men Moniliella ................................................7 1.4.2. Ƣu điểm và ứng dụng của nấm men đen Moniliella trong sản xuất erythritol...............................................................................................................9 1.4.3. Con đƣờng sinh tổng hợp đƣờng erythritol của nấm men ......................10 1.5. Một số phƣơng pháp thu nhận erythritol trong dịch lên men .........................14 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................17 2.1. Đối tƣợng, nguyên vật liệu nghiên cứu ..........................................................17 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................................17 2.1.2. Các môi trƣờng nghiên cứu. ....................................................................17 2.1.3. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu .......................................................18 2.1.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .....................................................18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................19 2.2.1. Phƣơng pháp lên men sinh tổng hợp erythritol .......................................19 2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký HPLC. .....................................................................19 2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm men Moniliella. ..20 2.2.4. Phƣơng pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp đƣờng erythritol ..........................................................................22 2.2.5. Các phƣơng pháp làm sạch dịch lên men thu hồi đƣờng erythritol .........23 2.2.6. Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình kết tinh.........24 2.2.7. Phƣơng pháp kiểm tra một số chỉ tiêu chất lƣợng đƣờng erythritol ........26 Khóa 2014 - 2016 i Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Chƣơng 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................................27 3.1. Sàng lọc các chủng nấm men đen Moniliella có khả năng sinh tổng hợp đƣờng erythritol .....................................................................................................27 3.2. Đặc điểm cơ bản của chủng nấm men M. megachiliensis TBY 3406.6 ........30 3.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng TBY 3406.6 ............30 3.2.2. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng M. megachiliensis TBY 3406.6 ....31 3.3. Nghiên cứu các điều kiện lên men sinh tổng hợp erythritol của chủng M. megachiliensis TBY 3406.6 từ dịch đƣờng thủy phân là sản phẩm của quá trình dịch hóa đƣờng hóa tinh bột sắn. ...........................................................33 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn hàm lƣợng đƣờng glucose .....................................33 3.3.2. Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ cao nấm men .................................................35 3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ ure ..........................................................................36 3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ...........................................................................37 3.3.5. Ảnh hƣởng của pH ...................................................................................37 3.3.6. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy lắc .............................................................38 3.3.7. Ảnh hƣởng của thời gian .........................................................................39 3.4. Nghiên cứu quá trình làm sạch và thu hồi eyrthritol ......................................41 3.4.1. Nghiên cứu loại bỏ tạp chất trong dịch lên men - Xử lý than hoạt tính (khử mùi, khử màu) ...........................................................................................41 3.4.1.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ than hoạt tính ..................................................41 3.4.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý chất hấp phụ ....................................42 3.4.2. Xử lý dịch đƣờng trên cột trao đổi ion (tẩy khoáng) ...............................42 3.4.3. Nghiên cứu điều kiện kết tinh đƣờng erythritol ......................................43 3.4.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ chất khô hòa tan tới quá trình kết tinh ............................................................................................................43 3.4.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tỉ lệ mầm tinh thể tới quá trình kết tinh .. 44 3.4.3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh ................ 46 3.4.3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình kết tinh ............... 46 Khóa 2014 - 2016 ii Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 3.4.4. Nghiên cứu điều kiện sấy và thu hồi sản phẩm .......................................48 3.4.4.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy đến chất lƣợng đƣờng .......48 3.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian sấy kết hợp với các mức nhiệt độ đến độ ẩm của đƣờng thu đƣợc ........................................................48 3.5. Sơ đồ quy trình công nghệ ..............................................................................50 3.6. Sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm ............................................51 3.7. Phân tích đánh giá sản phẩm ..........................................................................54 3.7.1. Đánh giá cảm quan đƣờng erythritol thu nhận đƣợc ...............................54 3.7.2. Phân tích đánh giá thành phần sản phẩm đƣờng erythritol .....................54 3.7.3. Đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật ....................................................................54 3.7.4. Đánh giá chỉ tiêu kim loại nặng ...............................................................55 3.8. Một số ứng dụng đƣờng erythritol vào những sản phẩm thƣơng mại. ...........55 3.8.1. Qui trình sản xuất viên nén đƣờng erythritol ...........................................56 3.8.2. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm nƣớc uống có thành phần erythritol....57 KẾT LUẬN ...........................................................................................................60 KIẾN NGHỊ...........................................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................61 PHỤ LỤC ..............................................................................................................65 Khóa 2014 - 2016 iii Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ AMG o Bx CFU CNTP CTPT DE DNA DNS DSMZ Amyloglucosidase (Glucoamylase) Độ Brix - Nồng độ chất khô hòa tan Colony Forming Unit Công nghiệp thực phẩm Công thức phân tử Dextrose equivalent Deoxyribonucleic acid acid dinitrosalicylic Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sƣu tập Vi sinh vật và Tế bào của Đức, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Food and Agriculture Organization Frozen Carbonated Beverage Glycemic index General High fructose corn syrup High fructose corn syrup High-performance liquid chromatography of high-pressure liquid chromatography Joint Expert Committee on Food Additives Khối lƣợng phân tử Kilo Novo Unit alpha-amylase Nicotinamide adenine diculeotide phosphate Polymerase Chain Reaction ARN riboxom Tiêu chuẩn Việt Nam Volume/volume Volatile fatty acids Weigh/volume Weigh/weigh World Health Organisation Yeast Malt Association of Official Analytical Chemist Hiệu suất chuyển hóa FAO FCB GI GSFA HFCS HFCS HPLC JECFA KLPT KNU NADPH PCR rARN TCVN v/v VFA w/v w/w WHO YM AOAC HSCH Khóa 2014 - 2016 iv Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Monilliela [4]..........................................................................8 Bảng 2.1. Bảng thành phần dịch đƣờng thủy phân sau khi cô đặc 120 phút ............ 17 Bảng 2.2. Danh sách các nguồn cơ chất....................................................................20 Bảng 3.1. Hàm lƣợng erythritol tích l y của các chủng nấm men đen sau 8 ngày nuôi cấy trong môi trƣờng chứa 20% ........................................................................ 27 Bảng 3.2. Hàm lƣợng erythritol tích l y trong dịch lên men của các chủng thuộc loài M. megachiliensis ...............................................................................................28 Bảng 3.3. Khảo sát sơ bộ sự sinh tổng hợp erythritol của 2 chủng TBY 3406.6 và TBY 3438.2 ...............................................................................................................30 Bảng 3.4. Bảng đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 3406.6 ...........31 Bảng 3.5. Một số đặc điểm cơ bản của M. megachiliensis TBY 3406.6 ..................31 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng M. megachiliensis TBY 3406.6 ...............................................................................................................32 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch đƣờng đến quá trình chuyển hóa erythritol của chủng M. megachiliensis TBY 3406.6 ...............................................................34 Bảng 3.8. Đánh giá dịch sau khi lên men của chủng sau 13 ngày nuôi cấy .............41 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tỷ lệ than hoạt tính ..........................................................42 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý than hoạt tính ........................................42 Bảng 3.11. Thành phần dịch đƣờng sau khi làm sạch ..............................................43 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ chất khô hòa tan quá trình kết tinh..................44 Bảng 3.13. Kết quả ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình kết tinh ........................47 Bảng 3.14. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sấy (sấy trong 3 giờ) .....48 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian sấy đến độ ẩm của đƣờng ..............................49 Bảng 3.16. Chỉ tiêu cảm quan đƣờng erythritol ........................................................54 Bảng 3.17. Kết quả các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm đƣờng erythritol. .....................54 Bảng 3.18. Các chỉ tiêu vi sinh vật của erythritol .....................................................55 Bảng 3.19. Hàm lƣợng kim loại nặng .......................................................................55 Khóa 2014 - 2016 v Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức hóa học của erythritol [10] ........................................................3 Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var. suavedens nuôi cấy trên đĩa thạch [7]...........................................................................................7 Hình 1.3. Hình ảnh sinh sản nảy chồi của nấm men đen [2] ......................................8 Hình 1.4. Quá trình sinh tổng hợp erythritol của nấm men và vi khuẩn [26] ...........11 Hình 1.5. Tác động của 2 enzym chuyển hóa Transketolase và Transaldoase trong con đƣờng pentose – phosphate [26].........................................................................12 Hình 1.6. Con đƣờng pentose phosphate chuyển hóa đƣờng glucose thành đƣờng erythritol [26] ............................................................................................................13 Hình 3.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch đƣờng tới khả năng tích l y erythritol của chủng M. megachiliensis TBY 3406.6 ................................................................................34 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cao nấm men đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng TBY 3406.6 ....................................................................................................35 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cao nấm men đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng TBY 3406.6. ...................................................................................................36 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng tích l y erythritol của chủng TBY 3406.6 ........................................................................................................................37 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trƣởng phụ thuộc vào pH. ............................38 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ khuấy lắc đến khả năng sinh tổng hợp erythritol ....................................................................................................................39 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện tốc độ sinh trƣởng phụ thuộc vào thời gian lên men .....40 Hình 3.8. Hình ảnh đƣờng erythritol kết tinh ở các nồng độ khác nhau trong cùng khoảng thời gian 16 giờ.............................................................................................44 Hình 3.9. Quá trình kết tinh khi lƣợng mầm tinh thể bổ sung thay đổi ....................45 Hình 3.10. Đồ thị mối liên hệ giữa lƣợng mầm tinh thể và hiệu suất kết tinh ..........45 Hình 3.11. Đồ thị sự ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất kết tinh đƣờng .. 46 Hình 3.12. Quá trình kết tinh đƣờng theo thời gian ..................................................47 Hình 3.13. Sơ đồ quy trình sản xuất erythritol quy mô phòng thí nghiệm ...............50 Khóa 2014 - 2016 vi Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 3.14. Quá trình lên men thu dịch len men sử dụng chủng 3406.6 ...................51 Hình 3.15. Dịch lên men trƣớc và sau ly tâm ...........................................................52 Hình 3.16. Dịch lên men đƣợc lọc qua than hoạt tính và chất trợ lọc ......................52 Hình 3.17. Quá trình kết tinh đƣờng erythritol .........................................................53 Hình 3.18. Đƣờng đƣợc rửa sau kết tinh ...................................................................53 Hình 3.19. Sản phẩm đƣờng erythritol ......................................................................53 Hình 3.20. Quy trình sản xuất viên nén đƣờng erythritol .........................................56 Hình 3.21. Các ví viên nén đƣờng erythritol.............................................................57 Hình 3.22. Quy trình sản xuất nƣớc uống quả dâu tằm erythritol ............................58 Hình 3.23. Sản phẩm thử nghiệm nƣớc dâu tằm có chứa thành phần erythritol ......59 Khóa 2014 - 2016 vii Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao MỞ ĐẦU Thừa cân, béo phì, tiểu đƣờng và những hệ lụy của nó đang là một vấn nạn về sức khỏe con ngƣời của thế kỉ 21, nguyên nhân sâu xa của nó là việc sử dụng các thực phẩm giàu dinh dƣỡng, nhiều đƣờng, mất cân bằng trong thực đơn hàng ngày. Bên cạnh các biện pháp điều trị thì việc sử dụng các thực phẩm chức năng hỗ trợ c ng rất hiệu quả trong việc phòng và hỗ trợ những căn bệnh trên. Đƣờng thấp năng lƣợng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng, đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe nhƣ: chống béo phì, tiểu đƣờng, sâu răng, kích thích tiêu hóa nhƣ là sorbitol, xylitol, maltitol, erythritol trong đó erythritol đƣợc biết đến là một rƣợu đƣờng (hoặc polyol) 4 phân tử cacbon là loại đƣờng thấp năng lƣợng với độ ngọt khoảng 70-80% so với sucrose trong khi năng lƣợng của nó chỉ là 0,24 cal/g tức là chỉ bằng 10% so với các đƣờng chức năng polyol khác chính vì vậy erythritol đƣợc xem nhƣ một thực phẩm chức năng vàng cho bệnh nhân tiểu đƣờng, béo phì và ăn kiêng. Với những nhu cầu thực tế hiện tại erythritol đang đƣợc nghiên cứu và sản xuất trên nhiều nƣớc trên thế giới với quy mô công nghiệp. Một trong những phƣơng pháp tối ƣu để sản xuất loại đƣờng chức năng thấp năng lƣợng này là sử dụng vi sinh vật, cụ thể là sử dụng các chủng nấm men Moniliella. Moniliella là nhóm đối tƣợng đƣợc đặc biệt quan tâm vì hiệu suất chuyển hóa đƣờng để tạo erythritol tƣơng đối cao, đây là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi khi sử dụng trong quy mô công nghiệp nhƣ là khả năng chịu nhiệt, khả năng chịu nồng độ muối cao và những đặc tính khác. Ở Việt Nam vẫn chƣa có một quy trình công nghệ nào cụ thể để sản xuất ra đƣờng erythritol, các nghiên cứu về đặc tính c ng nhƣ các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thu hồi, sản xuất ở Việt Nam của loại đƣờng này vẫn còn rất ít. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “Nghiên cứu sản xuất đƣờng erythritol từ nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam” nhằm Khóa 2014 - 2016 1 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao thu nhận đƣờng erythritol và đƣa ra quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm từ đó tạo tiền đề cho sản xuất công nghiệp phục vụ cho việc ứng dụng vào việc sản xuất các loại thực phẩm chức năng ít năng lƣợng nhằm hỗ trợ và điều trị cho ngƣời ăn kiêng, béo phì và tiểu đƣờng và trong sinh hoạt sử dụng đƣờng của mỗi ngƣời hằng ngày. Khóa 2014 - 2016 2 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đƣờng erythritol Erythritol là một rƣợu đƣờng (hoặc polyol) 4 cacbon đã đƣợc phê duyệt để sử dụng nhƣ một phụ gia thực phẩm ở Mỹ và nhiều nƣớc trên thế giới. Mỗi gam erythritol chỉ cung cấp 0,24 calo, tƣơng đƣơng 6% lƣợng calo cho 1 gam đƣờng sucrose [5] 1.1.1. Cấu tạo và tính chất của đường erythritol Erythritol có màu trắng, không hút ẩm, có dạng bột mịn hay tinh thể với vị ngọt nh và có hình dạng giống sucrose. Erythritol là một đƣờng đa chức với 4C. Kích thƣớc phân tử nhỏ và có nhiều tính chất độc đáo [10]. CTPT: C4H10O4 đƣợc thể hiện ở hình 1.1. Hình 1.1. Công thức hóa học của erythritol [10] Erythritol có tính ổn định cao, không có đầu khử nên bền với nhiệt và axit. Nó không bị phân hủy trong cả hai môi trƣờng axit và kiềm. Không hòa tan trong một số dung môi phân cực khác và thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với maltitol [26]. 1.1.2. Lợi ích cho sức khỏe của đường erythritol Không calo Erythritol đƣợc coi là một loại chất ngọt không cung cấp calo, vì lƣợng calo trong 1 gam rất thấp [13, 30]. Khóa 2014 - 2016 3 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Lợi ích về răng miệng Lợi ích về răng miệng của erythritol đã đƣợc kiểm nghiệm bằng cách: Trong ống nghiệm, tiến hành ủ erythritol với một loạt các loài Streptococcus (liên cầu khuẩn). Trong thử nghiệm vi sinh vật này cho thấy rằng Streptococcus đã không thể sản xuất mảng bám cao phân tử khi ủ trên erythritol, trái ngƣợc với kết quả khi Streptococcus đƣợc ủ trên sucrose [21]. Không làm gia tăng lượng đường huyết Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả F. Bornet và cộng sự đã kiểm tra đƣờng huyết ở các thời điểm từ khi bắt đầu sử dụng đến 3 giờ sau khi uống một liều duy nhất 1g erythritol/kg trọng lƣợng cơ thể, kết quả cho thấy erythritol không ảnh hƣởng tới đƣờng huyết và mức insulin [11]. Kết luận này c ng đƣợc nhóm nghiên cứu Yoshida và cộng sự đƣa ra [37]. Sự an toàn của erythritol đã đƣợc các tổ chức WHO/FAO Uỷ ban chuyên gia về phụ gia thực phẩm (JECFA) xác nhận vào 21-24 tháng 6 năm 1999. Erythritol c ng đã đƣợc Cơ quan Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ công nhận là đồ gia vị trong thực phẩm kể từ năm 2001 [18]. 1.1.3. Ứng dụng của đường erythritol Erythritol đƣợc sử dụng an toàn nhƣ là một chất tạo ngọt không năng lƣợng ở nhiều nƣớc do không có khả năng trao đổi chất trong cơ thể. Các số liệu khuyến cáo chỉ ra rằng erythritol không gây ra phản ứng bất lợi nào khi sử dụng với các thực phẩm khác. Dựa trên các số liệu nghiên cứu công bố, erythritol đƣợc chứng nhận là an toàn khi sử dụng trong thực phẩm. Erythritol là thành phần trong khẩu phần ăn của con ngƣời từ hàng nghìn năm nay khi có mặt trong lê, nho… và các thực phẩm lên men: rƣợu, nƣớc tƣơng 1.2. Công nghệ sản xuất ertythritol từ tinh bột Đƣờng erythritol đã đƣợc đƣa vào sản xuất quy mô lớn bằng phƣơng pháp hóa học và bằng quá trình lên men vi sinh vật. Erythritol có thể đƣợc tổng hợp từ tinh bột biến tính bằng phản ứng hóa học ở nhiệt độ cao với sự có mặt của hóa chất Khóa 2014 - 2016 4 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao xúc tác nike [31]. Phƣơng pháp sản xuất này đã không đƣợc đƣa ra sản xuất quy mô công nghiệp vì hiệu quả thấp. Ngày nay, sự tổng hợp erythritol từ vi sinh vật đang đƣợc nghiên cứu và phát triển mạnh. Erythriyol là polyol đầu tiên đƣợc sản xuất hoàn toàn bằng quy trình công nghệ sinh học của một số nhóm nấm men, đặc biệt là nhóm ƣa thẩm thấu có khả năng tích l y đƣờng này ở hàm lƣợng lớn. Đa số là đƣợc tổng hợp từ nấm men nhƣ: Pichia, Cadida, Torulopsis, Trigonopsis, Moniliella, Aureobasidium và Trichosporon spp... Tuy khác nhau về vi sinh vật sử dụng nhƣng các phƣơng pháp đều sử dụng nguyên liệu là các loại ng cốc, quy trình sản xuất đều trải qua các bƣớc sau:  Tách tinh bột từ ng cốc  Thủy phân tinh bột thành glucose bằng enzym thủy phân  Lên men glucose nhờ vi sinh vật  Lọc, tinh chế, kết tinh, làm khô sản phẩm Ngày nay việc ứng dụng quá trình lên men trong sản xuất các loại đƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi là 1 quá trình đơn giản chỉ cần 1 vài bƣớc và ít tốn kém bởi các chất nền ban đầu thấp, chi phí sản xuất thấp. Quá trình sản xuất công nghiệp erythriol dựa trên quá trình lên men tự nhiên, sử dụng nấm Moniliella pollinis. Nấm men M.pollinis lần đầu tiên đƣợc phân lập từ phấn hoa tƣơi tìm thấy trong một tổ ong, sau đó dƣới các điều kiện có sẵn sinh vật này sẽ sản sinh đƣờng erythritol ở mức tƣơng đối cao. Các nguyên liệu ban đầu là dextrose hoặc sucrose hay tinh bột ngô đƣợc thủy phân bằng enzym tạo ra glucose rồi tiến hành lên men bằng M.pollinis sau đó đƣợc tiến hành kết tinh, lọc, rửa và sấy khô thu nhận đƣợc erythritol có độ tinh khiết lên đến 99,5%. Ngoài ra còn thu đƣợc ra 1 hỗn hợp polyol chứa chủ yếu là erythritol, glycerol và ribitol. Vi sinh vật là một yếu tố quan trọng góp phần quyết định hiệu suất của quá trình lên men. Các vi sinh vật này biến đổi glucose thành erythritol nhờ enzym erythose reductase, đây là enzym hoạt động phụ thuộc vào NADPH. Khóa 2014 - 2016 5 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 1.3. Tình hình sản xuất erythritol trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay trên thế giới erythritol đang đƣợc sản xuất thƣơng mại ở quy mô công nghiệp sử dụng các chủng Moniliella. Công nghệ sản xuất erythritol sử dụng nấm men Moniliella ở các khía cạnh khác nhau đƣợc bảo vệ bằng một loạt các sáng chế bởi các công ty hóa chất và viện nghiên cứu. Ví dụ nhƣ: USP (United States Patent) #8187847 (2012) của công ty hóa chất Jungbunzlauer Austria AG (Aó) bảo hộ cho việc sử dụng môi trƣờng chứa nitrate cho lên men erythritol sử dụng Moniliella tomentosa (=Moniliella pollinis) [32]. Tƣơng tự, công ty Nikken Chemicals Co., Ltd. (Nhật) sở hữu USP#5916797 (1999), USP#6074857 (2000), USP#610715 (2000), USP#6214605 (2001); Mitsubishi Chemical Corporation (Nhật) sở hữu USP#5902739 (1999), USP#5981241 (1999)... Các loài nấm Moniliella có khả năng lên men các loại đƣờng đơn giản để sản xuất erythritol. Sàng lọc và đột biến đƣợc sử dụng để xác định chủng cải tiến của Moniliella có khả năng sản lƣợng sản xuất erythritol hiệu quả [24]. Cho đến nay chƣa có một nhà máy hay cở sở sản xuất nào ở Việt Nam sản xuất erythritol. Đƣờng erythritol hiện tại phụ thuộc chủ yếu vào nguồn nhập khẩu trong khi đó nhu cầu sử dụng đƣờng thấp năng lƣợng ngày càng tăng. Đƣờng erythritol đƣợc Bộ Y tế Việt Nam cho phép đƣợc sử dụng trong thực phẩm nhƣ chất tạo ngọt, chất giữa ẩm, chất điều vị tại thông tƣ 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012. Đƣờng erythritol có trong danh sách polyol đang đƣợc sử dụng để sản xuất bánh k o tại các nhà máy, công ty sản xuất bánh k o Hải Hà, Hải Châu, Kinh Đô, Hữu Nghị, Bibica, Tràng An; đƣợc sử dụng trong nƣớc giải khát Tribeco, Hoàng Gia, Acecook,...Ngoài ra, đƣờng erythritol còn đƣợc sử dụng trong dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, đồ ăn uống ăn kiêng cho bệnh nhân tiểu đƣờng. Hiện tại giá đƣờng erythritol bán trên thị trƣờng Việt Nam là 150.000đ/400g. Chính vì vậy việc tìm ra một quy trình công nghệ phù hợp hiệu quả cao, chi phí rẻ để sản xuất erythritol là hết sức có ý nghĩa và cấp thiết Khóa 2014 - 2016 6 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 1.4. Nấm Moniliella 1.4.1. Đặc điểm cơ bản của nấm men Moniliella Vào khoảng cuối thế kỉ 19 con ngƣời biết đến nấm men đen Moniliella là một nhóm phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng phƣơng pháp nẩy chồi. Nảy chồi là phƣơng pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men đen, ngoài ra nấm men còn có một số hình thức sinh sản khác nhƣ: sinh sản bằng cách phân đôi, sinh sản bằng bảo tử [2, 8]. Nhƣng nấm men đen lại là một loại nấm rất khó để nhận biết về hình thái, hình dạng nên những hiểu biết về loại nấm này vẫn chƣa đƣợc hoàn chỉnh [6]. Điều tạo nên sự khác biệt giữa nấm men đen và các nhóm nấm men khác là chúng có melain trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có mầu vàng lục, mầu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines [1]. Moniliella là nấm men đen có khuẩn lạc hình tròn hầu hết khi còn non sẽ có màu trắng còn khi già sẽ chuyển sang màu xám đen, đen oliu hoặc có thể màu xám hay xanh xám. Bề mặt khuẩn lạc nhẵn mƣợt [7]. Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var. suavedens nuôi cấy trên đĩa thạch [7] Khóa 2014 - 2016 7 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 1.3. Hình ảnh sinh sản nảy chồi của nấm men đen [2] Bảng 1.1. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Monilliela [4] Đặc điểm hình thái Chi Moniliella Phân bố Khuẩn lạc mịn, sau đó bông xù, thƣờng từ Phân bố ở những nơi có màu trắng rồi chuyển dần sang màu xanh, nhiều dầu mỡ hoặc những xám, đen. Sinh sản bằng phƣơng thức nảy nới có áp suất thẩm thấu cao chồi hoặc phân đốt. Thành tế bào dày, có nhƣ mật ong, phấn hoa. sắc tố đen. Geotrichum Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù giống Moniliella nhƣng khuẩn lạc không chuyển sang màu xám đen. Chi sinh sản bằng phân đốt, không nảy chồi. Tế bào to và dài, khoảng xấp xỉ 10 Phân bố trong đất, nƣớc và không khí. Trichosporon Khuẩn lạc màu kem, ƣớt hoặc khô, có hoặc không bông xù. Tế bào bé mỏng. Sinh sản bằng nảy chồi hoặc phân đốt. Kích thƣớc từ 5-10 µm. Phân bố trong đất hoặc nơi nhiều dầu mỡ. Candida Phân bố nhiều trong tự nhiên, thƣờng ở những nơi có nồng Tế bào hình tròn hay elip. Sinh sản vô tính độ đƣờng cao nhƣ mật mía, theo kiểu nảy chồi một số chi xuất hiện ở những nơi nhiều dầu mỡ nhƣ C. sake, C. haemulonii. Khuẩn lạc ban đầu mầu trắng, sau chuyển sang mầu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi Aureobasidium nấm từ 2-10 µm. Sinh sản theo phƣơng thức nảy chồi. Khóa 2014 - 2016 8 Phân bố trong đất, xác thực vật, lá cây Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Ngoại trừ M. fonsecae, các loài Moniliella rất đặc biệt trong Basidiomycota với khả năng lên men và ƣa áp suất thẩm thấu cao. Thành tế bào của Moniliella có cấu trúc đa lớp, không chứa xylose và fructose. Vách ngăn liên bào chứa dolipore với khe liên thông h p [25]. Moniliella phản ứng dƣơng tích với Diazonium blue. Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. 1.4.2. Ưu điểm và ứng dụng của nấm men đen Moniliella trong sản xuất erythritol Đối với công nghệ lên men thì yếu tố chủng giống, nguồn gen vẫn là yêu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sản lƣợng sản phẩm trong sản xuất với quy mô lớn. Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có khả năng sản xuất erythritol từ glucose, ví dụ nhƣ là: nấm men đen Moniliella, Pichia, Candida, Torulopsis, Trigonopsis, Auriobasidium, Delbaryomyces, Aspergillus, Eurotium, Fennellia, and Yarrowia [20, 23]. Hiện nay trên thế giới các nhà khoa học đã sử dụng một vài chủng phổ biến để lên men, sản xuất erythritol nhƣ là: Yarrowia lipolytica, Trichosporonoides madida DS 91, Moniliella pollinis… Yarrowia lipolytica có khả năng sinh một vài loại polyol nhƣ là erythritol, glycerol và một vài loại axit hữu cơ nhƣ là axit xitric. Để sản xuất erythritol nhóm các nhà nghiên cứu Gholam Reza Ghezelbash, Iraj Nahvi, Mohammad Rabbani đến từ Iran đã sử dụng chủng Y. lipolytica DSM70562 đƣợc lựa chọn từ bộ sƣu tập giống DSMZ [16]. Chủng đƣợc lựa chọn nuôi cấy trong môi trƣờng bao gồm 200 g/l glucose, 10 g/l cao nấm men, 10 mg/l MnSO4.4H2O và 2 mg/l CuSO4.5H2O và thời gian lên men là 48 giờ ở điều kiện nhiệt độ là 30oC. Theo kết quả nghiên cứu ở điều kiện nuôi cấy trên thì chủng Y. lipolytica DSM70562 cho hiệu suất chuyển hóa đƣờng thành erythrtitol lên đến 60 % trong tổng số toàn bộ polyol đƣợc tạo thành [16]. Trichosporonoides madida c ng đƣợc biết đến là một trong những loài có hiệu suất cao trong công nghiệp sản xuất erythritol. Thậm chí một chủng thuộc loài Trichosporonoides madida đã đƣợc đề cập đến trong bằng sáng chế của tác giả Jin Byung Park, USA Patent No. US6060291 A, 2000 [28]. Khóa 2014 - 2016 9 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Moniliella là nhóm đối tƣợng đƣợc đặc biệt quan tâm vì hiệu suất chuyển hóa đƣờng để tạo erythritol tƣơng đối cao, đây là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi khi sử dụng trong quy mô công nghiệp nhƣ là khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, ƣa lipit, khả năng chịu nồng độ đƣờng cao….Nổi bật trong chi Moniliella là loài Moniliella pollinis, đã đƣợc sử dụng ở rất nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Mỹ, Đức, Nga để sản xuất erythritol trên quy mô công nghiệp [12]. Từ khía cạnh công nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ƣu điểm nhƣ khả năng sinh sản nhanh trong điều kiện hiếu khí, phát triển dạng đơn bào trong môi trƣờng lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến hiện nay. Ngoài ra, Moniliella còn có khả năng phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao tƣơng đƣơng với nồng độ glucose lên đến 60 %. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sản xuất thƣơng mại khi cần nâng cao nồng độ cơ chất và sản phẩm. Tính ƣa áp suất thẩm thấu c ng góp phần giảm thiểu sự tạp nhiễm trong quá trình lên men. So với các nấm men khác c ng nhƣ vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliela có kích thƣớc khá lớn, thuận lợi cho công nghệ thu hồi sản phẩm (lọc và ly tâm). Ngoài ra, trên môi trƣờng cơ chất rắn, Moniliella có thể phát triển ở dạng sợi, thích hợp với công nghệ sản xuất lên men bề mặt [36]. 1.4.3. Con đường sinh tổng hợp đường erythritol của nấm men Nấm men đen Moniliella sinh tổng hợp đƣờng erythritol c ng nhƣ các sản phẩm khác bằng con đƣờng phổ biến nhất đối với các loại nấm men c ng nhƣ các loại vi sinh vật có nhân điển hình đó là con đƣờng – Pentose phosphat (hay còn gọi là con đƣờng hexo-monophosphate). Đây là đặc điểm hoàn toàn khác biệt so với khả năng tích l y đƣờng erythrtitol từ vi khuẩn (hình 1.6) [26]. Con đƣờng sản xuất erythrytol từ vi khuẩn bắt đầu là quá trình oxy hóa khử glucose 6-phosphate để hình thành fructose 6-phosphate. Tiếp sau đó là phản ứng phân cắt fructose-6-phosphate thành acetyl phosphate và erythrose-4-phosphate nhờ phosphoketolase có trong acid heterolactic của vi khuẩn. Dƣới tác dụng của enzym phophatease đã thủy phân của erythritol-4- phosphate để hình thành erythritol. Khóa 2014 - 2016 10