Tài liệu Nhân giống cây bình vôi tím bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ: SV 2013-01 Tên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour) BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT” CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : Đào Bá Tuyên Thái Nguyên , 2014 KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ: SV 2013-01 Tên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour) BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT” : Đào Bá Tuyên Chủ trì đề tài Những người tham gia : Thời gian thực hiện : Từ 03/2013 – 03/2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS. Vi Đại Lâm Địa điểm nghiên cứu : Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Sau 1 năm tham gia thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học, nay em đã hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Nhân dịp này em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Ths. Vi Đại Lâm và Ths. Nguyễn Thị Tình, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng 03 năm 2014 Sinh viên Đào Bá Tuyên TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: “Nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour)bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật” - Mã số: SV 2013-01 - Chủ nhiệm đề tài: Sv. Đào Bá Tuyên - Tell: .(+84)1658889205 E-mail: [email protected] - Cơ quan chủ trì đề tài: Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Cơ quan phối hợp thực hiện : - Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học - công nghệ thực phẩm, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014 1. Mục đích Hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 2. Nội dung chính - Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây Bình Vôi tím. - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi tím. 3. Kết quả chính đạt được - Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học - Sản phẩm ứng dụng: Bước đầu hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. SUMMARY - Research Project Title “ Propagation of Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture techni que ”. - Code number: T2013-01 - Coordinator: Dao Ba Tuyen - Tell: 01658889205 Email: [email protected] - Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agricultural and Forestry - Cooperating Institution: Faculty of Biotechnology and Food Technology. - Duration: March 2013 to March 2014 1. Objectives: Implement the Plant breeding on Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture 2. Main contents: - The effects of chemical disinfection on ability to produce sterilized materials - The influences of growth stimulants substance on ability to produce roots of Stephania rotunada Luour - The influence of growth stimulants on ability to regenerate and proliferate roots of Stephania rotunada Luour 3. Obtained results: - Scientific Result: 01 Scientific researched Report - Applied Result: Construct the general process of Plant breeding on Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture M ỤC L ỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU........................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................1 1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................................2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................................2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn...................................................................................................2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 2.1. Giới thiệu về cây Bình vôi.......................................................................................3 2.1.1. Phân loại khoa học ................................................................................................3 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố.............................................................................3 2.2. Vai trò của cây bình vôi tím ....................................................................................5 2.2.1. Giá trị về kinh tế ...................................................................................................5 2.2.2. Giá trị về dược liệu ...............................................................................................5 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật...............................................................7 2.3.1. Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào ............................................................7 2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ..................................................................8 2.3.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................................................8 2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................................................8 2.3.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................................9 2.3.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro .................................................. 13 2.3.4.1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ. ........................................................................ 13 2.3.4.3. Nhân nhanh ..................................................................................................... 13 2.3.4.4. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh ............................................................................ 14 2.3.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên ............................................ 14 2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình vôi..................................................... 14 2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước ................................................ 15 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 18 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu........................................................................ 18 3.2. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ nuôi cấy mô .......................................................... 18 3.2.1. Thiết bị ............................................................................................................... 18 3.2.2. Hoá chất ............................................................................................................. 18 3.2.3. Dụng cụ .............................................................................................................. 18 3.3 . Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 18 3.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 19 3.4.1. Phương pháp pha chất kích thích sinh trưởng .................................................. 19 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng.............................................................................................................................. 19 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh cây Bình Vôi tím ...................................................................................... 21 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây Bình Vôi tím .......................................................................................................... 22 3.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 24 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. ....................................................................................................................... 24 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn........................................... 24 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn ............................................... 25 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ chồi nách trên thân cây Bình Vôi .................................................................... 26 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi .......................................................... 27 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Bình vôi ........................................................................................................... 28 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 30 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 30 5.2. Kiến nghị................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 31 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1] ......................... 3 Bảng 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng.............. 20 bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn. ............ 20 Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn. ..................................... 20 Bảng 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ chồi nách trên thân cây Bình Vôi ..................................................................... 21 Bảng 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi ................................................................. 22 Bảng 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và đến ................................23 khả năng ra rễ của cây Bình Vôi ..................................................................... 23 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn ................. 24 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn .............................. 25 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng ......... 26 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Bình vôi ........................................................................ 27 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Bình vôi sau 4 tuần nuôi cấy................................................................ 28 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour).............................................. 4 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bình Vôi tím, dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là “cà tòm đeng” có nghĩa là bình vôi đỏ, tên khoa học là “Stephania rotunada lour” thuộc họ tiết dê (Menispermaceae). Bình Vôi tím là một cây dây leo giống như các loại Bình Vôi khác, dưới gốc rễ hình thành củ, mọc bám vào vách đá nhưng củ Bình Vôi tím nhỏ hơn loại trắng nhiều (chỉ nặng khoảng 0,5kg - 1kg), vỏ củ mầu nâu, dây mầu tím, phần thịt củ mầu đỏ, nhựa dây cũng mầu đỏ. Phần dây leo và lá y hệt cây bình vôi trắng, nhưng lá nhất là lá ngọn và lá non mầu tím. Cây Bình Vôi tím phân biệt đực cái rõ vì hoa đực và hoa cái khác gốc, củ cũng khác, củ cây cái thường tròn, củ cây đực thường dài hơn. Bình Vôi tím là một loại dược liệu quý, ít gặp, thuộc loại hiếm. Dùng để điều trị các bệnh về đường ruột (như viêm loét dạ dầy, viêm đại tràng, lỵ cấp mãn…) các bệnh về khớp và thần kinh. Đặc biệt, nếu dùng bột củ bình vôi tím với liều lượng 5g - 10g/ngày còn có tác dụng tiêu u (u đại tràng, u phổi). Dùng củ tươi giã nát tẩm nước vo gạo để đắp các u lành tính bên ngoài kể cả biếu basedow thì có hiệu quả tốt, u nhỏ lại trông thấy chỉ sau một đợt điều trị từ 10 ngày - 15 ngày. Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng tăng và việc khai thác liên tục trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác làm Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour) vốn phân bố khá phổ biến ở các tỉnh miền núi phía bắc hiện đang bị suy giảm nghiêm trọng, và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và hệ số nhân lớn. Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển những loài cây thuốc quí có tiềm năng. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada lour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ”. 1.2. Mục tiêu của đề tài Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bình Vôi tím (Stephania rotunada lour)bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 1 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống cây Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là cơ sở nhân nhanh loài dược liệu quí có nguy cơ cạn kiệt. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kĩ thuật nhân giống Bình vôi, nhân nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quí hiếm. Thực hiện đề tài giúp sinh viên hoàn thiện về cả kiến thức lý thuyết và thực tiễn, mang lại những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học cho công tác sau này. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Bình vôi 2.1.1. Phân loại khoa học Bảng 2.1. Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1] Giới (regnum) Plantae Ngành Magloliophyta Phân lớp Magloliosida (Dicotyedones) Bộ (ordo) Ranunculales Họ (familia) Menispermaceae Chi (genus) Stephania Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia[21]. Chi Bình vôi có khoảng trên 45 loài. Một số loài công bố ở Việt Nam: Stephania glabra (Roxb) Miers, S. kuinanensis, S. Pierrei Diels, S. Sinica Diels, S.rotunda Lour [14],… 2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae). Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác như là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,.. Các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: dây leo, thân nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm. Thân nhẵn hơi xoắn vặn. Rễ củ đa dạng, có thể rất to, vỏ ngoài xù xì màu nâu - nâu đen. Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3; phiến lá mỏng, hình tim, gần hình tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thường là 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng. Quả hạch hơi dẹt, mọng nước màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang 4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa có lỗ thủng hoặc không. Mùa hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [5],[15]. 3 Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) Bình vôi là cây mộc hoang dại, sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21-230C, lượng mưa 2000 - 2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5-7. Các loại Bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc, Trung, Nam. Thường tập trung ở vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học của chúng. Đặc điểm riêng của một số loài [15]: Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ biến ở các rừng thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,… Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa. S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt. S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác. S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng. S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ lệch một bên. S. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ. S. sinica Diels: Giá noãn không có lỗ. 4 2.2. Vai trò của cây bình vôi tím 2.2.1. Giá trị về kinh tế Cây Bình vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của nước ta không chỉ có tác dụng về mặt y học cây Bình vôi còn có giá trị về mặt kinh tế và đây cũng là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao. Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt trước việc khai thác ồ ạt của người dân. Bình vôi là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉ cần đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước là có thể phát triển tốt. Nó không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng. Cây Bình vôi sẽ là cây có tiềm năng lớn trong y học là nguồn nguyên liệu cho ngành dược và mang lại kinh tế cho người trồng. 2.2.2. Giá trị về dược liệu Cây Bình vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu. Bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu ứ, chỉ thống, khu phong. Hoạt chất được nhiều nhà khoa học chiết xuất từ cây Bình vôi là rotundin. Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột cống trắng cho thấy Bình vôi có tác dụng an thần, gây ngủ. Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình vôi được dùng để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,… Trong y học hiện đại, rotundin được dùng làm thuốc an thần gây ngủ, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ dai dẳng do nguyên nhân tâm thần [4]. Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian. Củ Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng. Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alcaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần. Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin. Trong đó quan trọng nhất là rotundin. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của một số chất trong cây như sau: Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là 5 rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn, đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật; 1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc...). Theo Ngô Đại Quang (1999) tác đụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [9]. Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn lá cao của chế phẩm. Rotundin ít độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v... Theo Fakhrutdinov Sf(1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế. Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương. Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong. Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp [17]. Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada và Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần hoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu 6 hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổi khi dùng cepharanthin. Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện [20]. 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[5]. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [5]. Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu… Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt. Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng [8]. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau. 2.3.1. Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan 7 điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [11]. 2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau. Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng. 2.3.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. 2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật a) Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [12]. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: NaOCl, cồn 700, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để khử trùng. b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH - Ánh sáng Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [12] Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. 8 Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 - 40cm. - Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [11]. - pH pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [16]. 2.3.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men… a) Nước Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị cho nuôi cấy protoplast, tế bào hay 9 meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [11]. b) Dinh dưỡng vô cơ Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật. Giống như cây trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển. Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [11]: - Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S). - Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo). Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật. Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng. Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính. Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô. Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [11]. c) Đường Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí 10