Tài liệu Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhạn dạng một số nguồn gen hoa lan hoàng thảo (dendrobium) bản địa của việt nam [tt]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số : 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2015 Luận án được hoành thành tại: VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 2. TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ Phản biện 1:……………………………………………………... Phản biện 2:……………………………………………………… Phản biện 3:……………………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào lúc:……giờ…….ngày…….tháng…..năm….. Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009). Vùng Đông Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân bố rộng rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước. Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ cho việc xác định các giống/loài khác nhau mà còn nhằm tìm hiểu mối quan hệ về di truyền giữa các giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen. Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học. Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của loài và quần thể. Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ các chương trình kinh tế trọng điểm đất nước. cơ sở , chúng tôi đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam”. 2. Mục tiêu của luận án - Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới. - Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng ADN mã vạch. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ sở để tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới; 1 - Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số giống/loài lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ các nguồn gen quý, có giá trị kinh tế và đăng kí trên ngân hàng gen thế giới. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam; góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo quý hiếm của Việt Nam bảo tồn, l . 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Là các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng miền Việt Nam. 4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014. 5. Những đóng góp của luận án Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS. Kết quả của luận án có ý nghĩa trong việc phân loại, phục vụ cho việc bảo tồn, , phong l . CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về chi lan Hoàng Thảo 1.1.1. Hệ thống phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật (Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009; Evans và cs., 2012). Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium. sw) ở Việt Nam thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985). Hệ thống này rõ ràng, không phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo ở Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007). 1.1.2. Đặc điểm hình thái 1.1.2.1. Thân 2 Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120cm hoặc đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm (Trần Hợp, 1998). Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên hay có dạng tràng hạt. 1.1.2.2. Rễ Rễ của các đại diện chi lan Hoàng Thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống. 1.1.2.3. Lá Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân, ít khi không có bẹ. Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt thường nhẵn. Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài (Averyanov, 2004). 1.1.2.4. Nhóm hoa Nhóm hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc. Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Trần Hợp, 1998). 1.1.2.5. Hoa Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số các loài có hương thơm. 1.1.2.6. Quả Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh.. 1.1.3. Phân bố vùng sinh thái Ở hơn 100 loài phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc, Trung, Nam và ở trên một số đảo ven biển nước ta (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004). 1.2. Giá trị sử dụng củaa hoa lan Hoàng Thảo Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số loài Hoàng Thảo cũng là một vị thuốc dân tộc cổ truyền h và cs., 2004; Cai và cs., 2012; Feng và cs., 2013). 1.3. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định maker nhận dạng ở thực vật 1.3.1. Khái niệm về đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. 1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và rất quan trọng đối với con người. 3 1.3.3. Các phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 1.3.3.1. Phƣơng pháp dựa vào chỉ thị hình thái Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là thân, lá, hoa. 1.3.3.2. Phƣơng pháp dựa vào các chỉ thị hóa sinh Các isozyme được định nghĩa như các dạng khác nhau của một enzyme (protein) có chức năng giống hay gần gũi nhau có ở cùng một cá thể (Salazar, 2003). 1. 3. 3. 3. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử ADN Các chỉ thị ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-simple sequence repeats (ISSRs) (Singh và cs., 2012; Shangguo và cs., 2013; Swati Das và cs., 2014). 1.3.3.4. Các phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình tự gen * Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã. Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá bảo ôn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012). * Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng nhiều để dựng cây phát sinh loài. Tuy nhiên, đối với mối quan hệ di truyền ở mức dưới loài thì sự phân tích trên gen này gặp nhiều hạn chế (Kress và Erickson, 2007). * Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK): Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina và cs., 2010; Sharma và cs., 2012). 1. 4. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới 1.4.1.1. Nghiên cứu ở mức độ hình thái Đối với loài Lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có rất nhiều các nghiên cứu về cây lan Hoàng Thảo như các nghiên cứu của Pellegrino và cs., 2005; Krishnan và cs., 2011). 4 1.4.1.2. Nghiên cứu ở mức độ phân tử * Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RFLP trên ADN lạp thể Đối với cây hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất Surin và cs., 2014 đã sử dụng kĩ thuật RFLP để xác định định dạng 25 giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Thái Lan. 23 trong số 25 giống này đã được nhận dạng, chỉ duy nhất có hai loài là D. crumenatum và D. formosum không xác định được. * Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RAPD Đã có các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình ở lan, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số loại như lan Kiếm (Cymbidiums), lan Hài (Paphiopedilum), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea) và lan Hoàng Thảo (Dendrobium) (Bateman, 2001; Choi và cs., 2006; Goh và cs., 2005; Li và cs., 2007; Parab và cs., 2008; Zha và cs., 2009; Chattopadhyay và cs., 2012; Paromik và Suman, 2014). Trên cây hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất, Pritam Chattopadhyay và cs., 2012 đã sử dụng 5 mồi RAPD để phân tích mối quan hệ di truyền giữa 5 loài lan Hoàng Thảo tại phía Bắc của Ấn Độ. Kết quả cho thấy, với tổng số 124 băng ADN được phân tích thì phát hiện có 25 băng cá biệt giữa các giống lan Hoàng Thảo. * Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị SSR Đối với . Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), chỉ có một vài nghiên cứu về sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền trong những năm gần đây như các nghiên cứu của Fan và cs., 2009, Cai và cs., 2012; Liu và cs., 2014). * Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị ISSR Với hoa lan Hoàng Thảo, năm 2009 tác giả Wang và cộng sự đã sử dụng 17 chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 31 loài hoa lan Hoàng Thảo được thu thập ở Trung Quốc. Kết quả cho thấy, trong số tổng 2368 băng được khuếch đại thi có 278 ISSR locus có độ đa hình là 100%. * Các nghiên cứu dựa vào trình tự ADN Công trình đầu tiên trên thế giới sử dụng mã vạch ADN để phân biệt Dendrobium là công trình của nhóm tác giả Trung Quốc công bố năm 2009 (Yao và cs., 2009). Trong nghiên cứu này, các tác giả giải mã vùng chen giữa psbA-trnH nằm trên genome lục lạp của 17 loài Dendrobium. Cũng trên đối tượng Dendrobium, nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cs., 2010) lại sử dụng trình tự gen matK và rbcL để phân định loài đồng thời nghiên cứu sự phát sinh chủng loài của nhóm Dendrobium dùng trong y học. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam Từ năm 1985 đến nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học như Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Đại học Nông Nghiệp I, Đại học Lâm Nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau hoa quả đã tập trung vào nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ một số tập đoàn phong lan ở nước ta. Đối với cây hoa lan Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cộng sự., 2012 đã nghiên 5 cứu dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D.pulchellum, D.Gatton Sunray và D.moschatum có mối quan hệ rất gần nhau, mức tương đồng lần lượt là 96,5% và 95%. : “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium . rker nhận dạng trên đối tượng lan Hoàng Thảo dựa trên giải trình tự các vùng gen ITS, matK, rbcL . Mới đây nhất, Trần Hoàng Dũng và cộng sự 2012 đã ứng dụng công nghệ ADN để phânn loại và nhận diện lan Hoàng thảo trầm rừng (D.parishii) và Phi điệp (D.anosmum) tại Việt nam. CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu phục vụ cho nghiên cứu bao gồm: - Kế thừa nguồn vật liệu của đã có của Viện Di truyền Nông nghiệp và GS. TS. Trần Duy Quý, 32 mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo (độ tuổi từ 2-3 năm) được thu thập ở các tỉnh miền của cả nước và được lưu giữ tại vườn lan thuộc Trung tâm công nghệ cao, Viện Di truyền Nông nghiệp và nhà vườn số 422, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam 2.2.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức hình thái 2.2.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức độ phân tử bằng chỉ thị RAPD 2.2.2. Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa trong tập đoàn nghiên cứu 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2. 3.1. Phƣơng đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái - Mô tả hình thái hoa lan theo phương pháp của Pellegrino, 2005 là phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài. 2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử bằng chỉ thị RAPD 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 2.3.2.2. Điện di kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số 2.3.2.3. Kiểm tra ADN bằng trên gel agarose 2.3.2.4. Kiểm tra ADN bằng máy đo quang phổ 6 2.3.2.5. Phản ứng RAPD Các loại mồi RAPD thuộc nhóm OPA và OPN do hãng Operon cung cấp; mồi ITS do Sigma cung cấp. 2.3.3. Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân 2. 3.3.1. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR Vùng ITS được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 và ITS4. 2.3.3.2. Giải trình tự sản phẩm PCR 2. 3.3.3. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank 2. 3.3.5. Xây dựng cây phát sinh loài 2.4. Phần mềm xử lý số liệu - Số liệu nghiên cứu được phân tích, xử lý dựa trên các phần mềm Excel version 5.0, phần mềm PCORD, phần mềm NTSYS, MEGA: phiên bản 5.2.1, để xây dựng cây phát sinh loài. 2. 5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu: 2010-2014. 3.1. CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN tập đoàn chi lan Hoàng Thảo hoa lan nhà vườn số 422 Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội Thảo C 3 (D2 - . Các mẫu giống hoa như: D4, D7, D8, D12, D13, D14, D17, D19, D20, D21, D22, D23, D24 và D25 có dải phân bố rộng từ Bắc đến Nam. Các mẫu giống hoa còn lại chỉ tìm thấy ở một số địa phương của một vài tỉnh miền Trung hoặc phía Nam, trong đó có mẫu giống hoa Hoàng thảo Vani (D27), Hoàng Thảo Đại Bạch hạc (D32) chỉ tìm thấy ở Kontum. 3.1.1. Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái Thân của các đại diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, có nhiều hình dạng như: hình con suốt, hình chùy, hình vuông, hình tràng hạt, thuôn tròn, và phổ biến nhất là hình trụ. Thân cũng có nhiều dạng khác nhau như, thân mảnh thân bám, thân phình to mập, thân dài, thân ngắn phình to, nhưng đa số là thân dài, buông thõng xuống. Cá biệt có loài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như không có, làm thân có dạng tràng hạt (D2) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D28). Đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận dạng hoa lan Hoàng Thảo Điện Biên (D2) là loài đặc hữu của Điện Biên. 7 Bảng 3.1. Các Ký hiệu D1 D2 Tên tiếng Việt Hoàng Thảo Long nhãn Lai Châu Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện Biên Tên Latin Xuất xứ Ký hiệu Tên tiếng Việt Tên Latin Xuất xứ D. fimbriatum Lai Châu D17 Hoàng Thảo Kim Điệp D. capillipes Lâm Đồng D. findlayanum Điện Biên D18 Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc D. findlayanum Kontum D. farmeri Đồng Nai D. chrysotoxum D. chrysotoxum Kontum Lâm Đồng Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng Nai Hoàng Thảo Tiểu hoàng lạp Hoàng Thảo Đại hoàng lạp D3 Hoàng Thảo Thái Bình D. moschatum Thái Bình D19 D4 D5 Hoàng Thảo Phi Điệp tím Hoàng Thảo Trầm tím D. anosmum D.parishii Hòa Bình Sơn La D20 D21 D6 Hoàng Thảo trầm trắng D.parishii.var alba Điện Biên D22 Hoàng Thảo bạch hạc langbiang D. wattii Lâm Đồng D7 Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng D. chrysanthum Yên Bái D23 Hoàng Thảo Hạc vĩ D. aphylum Đà Lạt Hoàng Thảo Phi điệp vàng D. chrysanthum Điện Biên D24 Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ D.lindleyi QuảngTrị D9 Hoàng Thảo Long tu Bắc D. primulinum Sơn La D25 Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung D. lindleyi Lâm Đồng D10 Hoàng Thảo Trúc D. hancockii Ninh Bình D26 Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà D. haveyanum D11 Hoàng Thảo Xoắn D. tortile Ninh Bình D27 D12 D13 Hoàng Thảo Hoàng Thảo Kiều vàng D. amabile D. thyrsiflorum D28 Tuyên Quang D29 Hoàng Thảo Đùi gà Hoàng Thảo Long tu đá D14 Hoàng Thảo Kiều trắng D. farmeri Tuyên Quang D30 Hoàng Thảo Môi tơ D15 Hoàng Thảo Tam Đảo D. daoense Tam Đảo D31 Hoàng Thảo Nhất Điểm Hồng D32 Hoàng Thảo Đại bạch hạc Hoàng Thảo Hoàng lạp Tây D. chrysotoxum Bắc Ghi chú: D. Dendrobium D16 8 Hoàng Thảo Vani Lâm Đồng D. aduncum Kon Tum D. nobile D. primulinum D. delacourii Guill D. draconis Rchb.f Đà Lạt Tây Nguyên D. christyanum Kontum Tây Nguyên Lâm Đồng Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân. Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2-6 chiếc ở đỉnh thân cũng có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà không có lá. Lá thường tồn tại khi cây ra hoa. Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều (D15 trung bình 35,9 lá/cây; D23 trung bình 31,7 lá/cây) đến rất ít (D22 trung bình 6,46 lá/cây). Lá có thể cứng hoặc mềm, bề mặt thường nhẵn. Đa số lá của lan Hoàng Thảo trong 32 mẫu giống nghiên cứu có lá dạng hình lưỡi mác, mộit vàu lá hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, nhọn lệch hoặc tù. Nhóm hoa có thể có nhiều hoa, hoặc có ít hoa. Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, hoặc mọc so le (Hình 3.4). Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có sự khác biệt rõ rệt với nhau về kích thước, số lượng, cách sắp xếp và màu sắc, hình dạng lá đài, cánh hoa, cánh môi. Hoa thường không quá lớn, đường kính dao động trong khoảng 1,35-5,8cm. Cánh môi của các mẫu giống nghiên cứu có nhiều màu sắc khác nhau như màu vàng sẫm hay vàng nhạt, màu trắng có đốm vàng hoặc cam ở giữa, hay màu trắng họng đen (D3) hoặc màu tím (D4), màu vàng họng đen (D1), màu tím nhạt họng vàng vv.. Hình dạng cánh môi thường gặp là hình tròn, hình gần tròn hình rô, hình phễu, hình tim, hình bầu dục, hình trứng hay hình cằm (D32). Từ các kết quả về số liệu hình thái như thân, lá, hoa của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo, chúng tôi sử dụng phần mềm Pcord 4.0 để xây dựng sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo (Hình 3.6). Hình 3.4. Một số kiểu hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Xét ở mức độ tương đồng 37%, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo chia làm 5 nhóm chính: Nhóm I: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6, D10, D11, D15 ở mức độ tương đồng từ 55-100% và chia làm hai nhóm phụ: + Nhóm phụ thứ 1 bao gồm 6 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6 và D11 trong đó 3 giống D4, D5 và D6 được xếp vào một nhóm là các mẫu HT Phi điệp tím (D4), Hoàng thảo trầm tím (D5) và Trầm trắng (D6) có hệ số tương đồng di truyền từ 95 đến 100% trong đó mẫu D5 và D6 có hệ số tương đồng di truyền 100%. + Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo) 9 I II III IV V Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái Nhóm II: gồm 15 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo khác nhau có hệ số tương đồng di truyền từ 37-100% bao gồm các mẫu giống D2, D7, D9, D12, D13, D14, D17, D18, D19, D22, D23, D26, D27, D29, D30 ở mức độ tương đồng di truyền từ 37-100%. Ở mức độ tương đồng di truyền 43% các mẫu này lại chia thành hai nhóm phụ khác nhau bao gồm: Nhóm phụ II.1: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D2, D9, D17, D18, D23, D27, D29 và D30 trong đó hai mẫu D2 và D18 có hệ số tương đồng di truyền là 100%. Nhóm phụ II.2: Bao gồm các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo gồm D7, D12, D13, D14, D17, D19 và D26 ở mức độ tương đồng di truyền 68%. Nhóm phụ thứ II.2 chia thành hai nhóm nhỏ hơn trong đó D7 và D17 vào một nhóm còn lại là 5 mẫu giống D12, D13, D14, D19, và D26 tạo thành một nhóm. Đây là các giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều của miền Bắc hay gọi là Thủy Tiên theo cách gọi của người miền Nam. Các mẫu giống hoa trong nhóm này về đặc điểm hình thái như thân, lá, hình dạng hoa khá giống nhau, chỉ khác nhau về màu hoa.. Nhóm này bao gồm các loài mang đặc điểm là có hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi. Tuy vậy sự khác biệt lớn ở đây là thân có hình con suốt, lá tập trung ở đỉnh, cụm hoa thường nhiều hoa (Clements, 2003; Dương Đức Huyến, 2007). Nhóm III: Bao gồm 4 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là D8, D28, D31và D32. Trong số 4 mẫu giống này thì hai mẫu giống D31 và D32 rất dễ nhầm khi chúng có đặc điểm hình thái như thân, lá, rễ, hoa tương đối giống nhau. Hai mẫu giống này chỉ khác nhau về đặc điểm hình dạng cánh môi, mẫu giống D31 có hình dạng hình mác, còn mẫu giống D32 có dạng hình cằm. Nhóm IV: Bao gồm 3 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là các mẫu giống D16, D20 và D21. Trong số 3 mẫu giống này thì hai mẫu giống D20 và D21 được phân bố ở hai tỉnh Đồng Nai và Lâm Đồng. Về mặt hình thái chúng có màu hoa giống nhau hơn nữa hình thái như thân, lá, rễ cũng như nhau, chỉ khác nhau về kích thước lá. 10 Nhóm V: gồm hai mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25). Đây là hai mẫu giống phân bố ở khắp ba miền Bắc, Trung và Nam có đặc điểm hình thái như nhau và chỉ khác nhau về kích cỡ lá. Có thể nhận thấy rằng hai giống này là một loài và chỉ khác nhau ở vùng phân bố nên khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng có ít sai khác đặc biệt là lá. Sự phân loại chi Dendrobium từ trước đến nay một trong những vấn đề phức tạp trong họ Orchidaceae do sự đa dạng về hình thái, phạm vi phân bố rộng, số lượng các loài lớn, và do sự biến đổi hình thái chồng chéo giữa các loài. Cho tới nay, đại đa số các nhà phân loại đều chia chi lan Hoàng Thảo thành các nhóm (section). Một vài tác giả đã chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân chi (subgenra)(Dressler, 1993; Kumar và cs., 2011; Schuiteman, 2011). Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, việc sử dụng chỉ thị hình thái để đánh giá đa dạng di truyền chỉ được tương đối chính . Tuy nhiên, trong việc phân loại các loài thuộc chi lan Hoàng Thảo của Việt Nam ở mức hình thái và bằng chỉ thị RAPD. 3.1.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử 3.1.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số . 3.1.2.2. Kết quả thực hiện mẫu ổng số 408 loại 4,5 2. Với 20 mồi ngẫu nhiên, mồi OPN9 có tổng số băng nhân lên được nhiều nhất (254 băng), mồi OPN7 có tổng số băng nhân lên thấp nhất (84 băng). Dưới đây là một số mồi RAPD điển hình (Hình 3.11). Trong tổng số 20 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu có 26 loại băng cá biệt hoặc băng khuyết xuất hiện. Mồi OPN7 cho năm loại băng khác nhau. Còn lại là các mồi OPN1, OPN2, OPN3, OPN6, OPN8, OPN11, OPN12, OPN13, OPN16, OPN19, OPN20, OPA3 và OPA6 xuất hiện 1-2 băng cá biệt/hoặc băng khuyết. V mẫu . * 1 11 Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN11; Giếng 1-32: Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa (D1-D32); M: 1kb ladder 3.1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo quan hệ hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ cây của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo 3.13). Xét ở mức độ tương đồng di truyền 32%, 32 . Hình 3.13. dựa trên chỉ thị phân tử RAPD : 34- 100%. Nhóm phụ thứ nhất (I.1) gồm 6 mẫu giống bao gồm các giống D1 (Hoàng Thảo Long Nhãn Lai Châu), D3 (Hoàng Thảo Thái Bình), D11 (Hoàng Thảo Xoắn), D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo), D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D30 (Hoàng Thảo Môi tơ) có hệ số tương đồng di truyền từ 50-80%. Nhóm phụ thứ 2 (I.2) bao gồm 5 mẫu giống là các giống D4, D5, D6, D7 và D17. Trong nhóm này, 3 giống D4 (Hoàng Thảo Phi điệp tím), D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng) có hệ số tương đồng di truyền là rất cao từ 80-100%. (Hình 3.14). Trong 3 mẫu giống trên thì hai mẫu giống D5 và D6 có hệ số tương đồng là 100%. Đây là hai giống Hoàng Thảo trầm được thu thập ở hai vùng Sơn La và Điện 12 Biên có đặc điểm hình thái như thân, lá, kiểu hoa giống nhau nhưng khác về màu sắc hoa. Kết quả này tương tự như tác giả Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 khi nghiên cứu tập đoàn lan Hoàng Thảo bản địa với hai loài Trầm rừng (Dendrobium parishii) và Phi điệp (Dendrobium anosmum) tại Việt Nam (Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 ). Nhóm phụ thứ ba (I.3) hai mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo) với hệ số tương quan di truyền là 53%. Hai giống hoa này được thu thập ở miền Bắc là Ninh Bình và Tam Đảo, chúng khác nhau hoàn toàn về thân, lá và hoa. Hình 3.14. Giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5 (Trầm tím), D6 (Trầm trắng) Nhóm II: Gồm 8 mẫu giống là D9, D12, D13, D14, D29, D19, D26 và D27 được chia thành hai nhóm phụ khác nhau ở mức độ tương đồng di truyền 47%. Nhóm phụ thứ nhất (II. 1) gồm bốn mẫu giống là D9, D29, D27 và D26 có hệ số tương đồng dao động từ 51-75 % trong đó có hai giống D9 (Hoàng Thảo Long tu Bắc) và D29 (Hoàng Thảo Long tu đá) có hệ số tương đồng cao nhất là 75%. Nhóm phụ thứ hai (II. 2) gồm 4 mẫu giống D12, D13, D14 và D19 có hệ số tương đồng di truyền từ 65-80%. Các giống Kiều về đặc điểm thân lá gần giống nhau, hoa đều dạng trùm nhưng chỉ khác nhau về màu hoa. Trong 4 giống Kiều trên thì có hai giống D13 (Hoàng Thảo Kiều vàng) và D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng) có hệ số tương đồng cao nhất là 80%. Nhóm III: gồm 2 mẫu giống là D23 (Hoàng Thảo Hạc vĩ) và D28 (Hoàng Thảo đùi gà) ở mức độ tương đồng di truyền là 50%. Nhóm IV: gồm 6 giống là các giống D16, D20, D21, D22, D31và D32 và chia ra làm hai nhóm phụ với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 33-50%. Nhóm phụ thứ nhất (IV.1) gồm hai mẫu giống D31 và D32 với hệ số tương quan di truyền là 50%; Nhóm phụ thứ hai (IV.2) gồm các giống D16, D20, D21 và D22 với hệ số tương quan di truyền dao động từ 50-75%. Trong đó, giống D20 và D21 có hệ số tương quan di truyền cao nhất là 75%. Nhóm V: gồm ba giống D8, D24, và D25 có hệ số tương đồng di truyền tương đối cao trong số các nhóm dao động từ 50-100%. Trong nhóm này, hai giống D24 (Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung) đồng d 100%. 13 3.1.3. Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo 32 mẫu . Qua kết quả so sánh giữa sơ đồ hình cây bằng chỉ thị hình thái và sơ đồ hình cây bằng chỉ thị RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5 nhóm khác nhau. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di truyền đều xếp chung vào một nhóm. Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống có hệ số di truyền như nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung). Bên cạnh đó các mẫu giống khác như D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc); hoặc các giống lan Hoàng Thảo Kiều có hệ số tương đồng khá cao từ 65-80%. Tóm lại, việc nghiên cứu, đánh giá và so sánh đa dạng di truyền của tập đoàn giống Hoa lan Hoàng Thảo là công việc rất cần thiết nhằm tạo nên cơ sở dữ liệu cho các phương pháp bảo tồn, phát triển sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền, và đồng thời có ý nghĩa chiến lược trong chương trình cải thiện giống. Việc kết hợp giữa phương pháp . Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc phân loại loài/dưới loài còn nhiều hạn chế, chính vì vậy để xác định giữa các loài, dưới loài cần phải kết hợp giải trình tự ADN lục lạp như vùng ITS, hoặc giải trình tự gen matK, gen rbcL (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012, Liu và cs., 2014). 3.2. Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự vùng ITS 3.2.1. Kết quả khuếch đại vùng ITS bằng PCR Với cặp mồi ITS1 và ITS4, chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn ITS bằng PCR. Kết quả sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất cho mỗi giống lan Hoàng Thảo trên gel agarose 1% sau khi điện di (Hình 3.17). Các băng nằm ở vị trí khoảng 700-800 bp. Như vậy, kích thước vùng gen ITS được khuếch đại là phù hợp. Kết quả này cũng khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả khác khi khuếch đại vùng ITS trên cây lan Hoàng Thảo (Chiang và Tsong, 2012; Trần Hoàng Dũng và cs., 2012; Liu và cs., 2014). Các băng sản phẩm rõ, đúng kích thước nên có thể sử dụng giải trình tự. Sản phẩm đoạn ITS sau khi khuếch đại bằng PCR sẽ được tinh sạch và bằng phương pháp Qiagen Kit. 14 Hình 3.17. Ảnh điện di đoạn ITS của quả 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 Giếng 1-32: Các giống hoa lan Hoàng Thảo; M: 100bp ladder 3.2.2. Kết quả phân tích trình tự các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự vùng ITS 3.3.2.1. Kết quả giải trình tự vùng ITS của 32 mẫu lan Hoàng Thảo Qua kết quả giải trình tự cho thấy, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đã được khuếch đại và giải trình tự vùng ITS bao gồm một phần vùng 18S, toàn bộ vùng ITS1, 5.8S, ITS2 và một phần vùng 26S, tổng chiều dài thu được từ 652 đến 715 nucleotide, trung bình là 685,3 nucleotide. Tỉ lệ % trung bình của T(U)= 22,4%; C = 24,3%; A = 23,7 %; và G =29,6%. Kết quả này cũng khá cũng khá phù hợp với nhận định của Xu và cs., 2005; Sigh và cs., 2012; Liu và cs., 2014. 3.3.2.2. Kết quả so sánh trình tự đoạn ITS một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam và thế giới Để so sánh sự khác biệt các trình tự của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo của Việt nam và thế giới, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự của các mẫu lan Hoàng Thảo của Việt nam và thế giới dựa trên sự phân tích sắp cột thẳng hàng. Dưới đây là một số kết quả so sánh trình tự vùng ITS của một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo của Việt Nam và thế giới. * Kết quả so sánh trình tự mẫu D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc) Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự ITS của mẫu D2, D18 của Việt Nam và hai mẫu D. findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| của thế giới cho thấy ở bảng thống kê số nucleotid của 4 trình tự ITS của loài D.findlayanum có sự giao động số nucleotid của các trình tự từ 688- 694 nucleotid Với kết quả so sánh trình tự các mẫu D.findlayanum cho thấy trình hai mẫu D2 và D18 có khoang 19 sự khác biệt. Khi so sánh hai mẫu D2 và D18 với hai mẫu tham chiếu D.findlayanum thì mẫu D2 và D18 có khoảng 8 sự khác biệt trình tự so với hai mẫu D. findlayanum của thế giới (Hình 3.19). Kết quả này cho thấy các mẫu lan Hoàng Thảo D2 và D18 của Việt Nam không có sự khác biệt mấy so với các mẫu D.findlayanum của thế giới. 15 Hình 3.19. Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D.findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| Tương tự như vậy các mẫu lan Hoàng Thảo khác cũng được phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) với các mẫu lan Hoàng Thảo của thế giới để xác định sự sai khác về trình tự cũng như nhận dạng loài/dưới loài dựa trên trình tự vùng ITS. Tuy nhiên việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank nhằm mục đích cho một kết quả so sánh với nhóm loài tương đồng nhất với trình tự tham chiếu. Kết quả BLAST không thể kết luận chính xác về loài. Với những trường hợp BLAST có độ bao phủ và tương đồng cao (99%) cũng không thể suy ngược lại tên loài. Bởi kết quả BLAST chỉ hiển thị trình tự tương đồng nhất mà trên GenBank hiện có. Do vậy, để có thể xác định đúng tên loài cần phải thực hiện thêm nhiều các phân tích khác như so sánh với dữ liệu hình thái và xác định mối liên hệ qua cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loài Dendrobium để xác định chính xác tên của các mẫu vật trong nghiên cứu này. 3.2.3. Kết quả phân định loài dựa trên cây phát sinh loài Qua hình 3.25 cho thấy, cây phát sinh loài chia 32 mẫu giống lan Hoàng Thảo làm XVII nhóm khác nhau: Nhóm thứ I: gồm 3 trình tự mẫu giống của Việt Nam là D4 (D. anosmum), D5 (D. parishi.var alba) và D6 (D.parishi) với 6 trình tự gồm HM590378.1, HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D.parishi và 2 trình tự EU477499.1, JN388570.1 thuộc loài D.asosmum. Ở vị trí phân kỳ sớm, mẫu giống D6 được nhận dạng về hình thái là D.parishi nhưng nằm gần mẫu giống EU47749.1 được nhận dạng là D.anosmum trong khi đó ở trên 4 mẫu giống HM590378.1. HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D. parishi nằm cùng với nhau. Điều này có thể khẳng định rằng mẫu giống EU47749.1 phải là D. parishi chứ không phải D. anosmum, từ đó ta suy ra mẫu giống D6 thuộc loài D.parishi. Ở vị trí phân kỳ trễ, mẫu giống D4, D5 và mẫu giống JN388570.1 nằm chung một nhóm. Xét về hình thái, mẫu giống D4 được nhận dạng là D.anosmum còn mẫu giống D5 được nhận dạng là D. parishi.var alba. Tuy nhiên hai mẫu giống này lại nằm chung 16 với mẫu giống JN388570.1 trùng khớp đến 99%. Do vậy kết luận mẫu giống D5 chính là D. anosmum.var alba chứ không thể là D.parishii.arlba. Kết quả này cũng trùng khớp với nghiên cứu của Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 khi nghiên cứu phân tích hai loài lan của Việt nam là Hoàng Thảo trầm rừng (D. parishi) và Hoàng Thảo Phi điệp (D. anosmum)(Trần Hoàng Dũng và cs., 2012). Nhóm thứ II bao gồm D9 và D29 với 3 trình tự thuộc loài D.primulinum là KF14399.1, AB593641.1 và AB59352.1. Hai mẫu D9 và D29 nằm chung cùng với mẫu AB59352.1 với chỉ số boostrap lên tới 99%. Đây là hai mẫu Long tu được được phân bố ở hai vùng phía Bắc và Tây Nguyên. Về hình thái, chúng có đặc điểm tương đối giống nhau và được nhận dạng thuộc loài D.primulinum. Do vậy hai mẫu D9 và D29 được nhận dạng chính xác thuộc loài D.primulinum. Nhóm thứ III là mẫu giống D23 được nhận dạng về hình thái là D. aphylum nằm cùng chung nhóm với 4 trình tự là HM590384.1, HQ114247.1, HQ114248.1 và KF143430.1 trùng khớp với nhau đến 100%. Vậy kết luận rằng mẫu D23 thu thập chính xác và là lan Hoàng Thảo Hạc vĩ (D. aphylum). Nhóm thứ IV: bao gồm 2 giống D11 và D28 nằm chung một nhóm với 6 trình tự so sánh. Trong nhóm này, mẫu D11 (D.tortile) phân chia nằm chung với 4 trình tự khác là EU4775071(D.nobile), EU477507.1(D.fiedricksianum), ,KF143518.1(D.sp.Jin XHs.n.9) và EU477511.1 (D.tortile) với chỉ số bootstrap lên tới 98%. Xét về hình thái, D11 khác hoàn toàn về hình thái như thân, lá, hoa so với mẫu EU477507.1 (D. fiedricksianum), KF143518.1(D. sp.Jin XHs.n.9). Ngay từ kết quả so sánh trên Balst, những mẫu này cũng nằm lộn xộn không tập trung. Chính vì vậy mà không thể nhận dạng được mẫu giống D11 có đúng là D.tortile hay không. Tuy nhiên, mẫu giống D28 nằm chung cùng với hai trình tự thuộc D.nobile là KC205193.1 và JN38579.1 với chỉ số bootstrap là 85%. Do vậy mẫu giống D28 được nhận dạng chính xác là D. nobile. Nhóm V: gồm các mẫu giống D27, D2 và D18 chia thành 2 nhóm phụ: - Nhóm phụ thứ 1 bao gồm mẫu D27 (D.aduncum) chia thành một nhóm nằm chung với 3 trình tự khác thuộc loài D.aduncum gồm các trình tự JF713083.1, KF143428.1 và JN388580.1 với chỉ số bootstrap trong nhóm là 99%. Đặc điểm về hình thái, mẫu D27 giống với 3 mẫu còn loại thuộc loài D.aduncum nên có thể khẳng định chính xác đây là loài D.aduncum. Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu D2 và D18, đây là hai mẫu Long tu (D. findlayamum) được thu thập từ hai miền khác nhau. Xét về hình thái chúng giống nhau y hệt về thân, lá, hoa chỉ khác ở chỗ Long tu Bắc (D2) ở giữa môi hoa không có đốm. Khi so sánh trình tự của chúng thì chúng có chỉ số bootstrap là 100% so với trình tự của 3 mẫu KF143246.1, HQ114257.1 và JN388589.1 đều thuộc loài D.findlayamum nên khẳng định hai mẫu D2 và D18 thuộc loài D. findlayamum. 17 79 70 68 76 56 64 70 71 D. parishii voucher NCHU-D89331201-1012|HM590378.1| 64 D. parishii|AB593630.1| 90 D. parishii voucher SBB-0528 |HM054736.1| 79D. parishii voucher SBB-0527 HM054735.1| 82 D. anosmum |EU477499.1| 99 D. parishi - D6 D.parishi.var alba - D5 D. anosmum - D4 99 99 D. anosmum isolate D4 |JN388570.1| 100 D. primulinum voucher Jin X-H 10793 |KF143499.1| D. primulinum |AB593641.1| D. primulinum TBG 118293|AB593521.1| 97 87 99 D. primulinum -D9 90 D. primulinum - D29 D. aphyllum voucher NCHU-D89331201-1018 HM590384.1| D. aphyllum voucher PS2523MT01 |HQ114247.1| D. aphyllum voucher PS2523MT02 |HQ114248.1| 100 D.aphyllum -D23 D. aphyllum voucher Jin X-H 10798 |KF143430.1| D. tortile - D11 96 D. nobile |EU477507.1| 98 D. friedricksianum |EU477505.1| D. sp. Jin X-H s.n. 9 |KF143518.1| 77 62 D. tortile |EU477511.1| D. nobile |KC205193.1| D. nobile - D28 85 59 D. nobile |JN388579.1| D. aduncum - D27 75 100 D. aduncum voucher SBB-0309 |JF713083.1| 99 D. aduncum voucher Jin X-H 9522 |KF143428.1| D. aduncum |JN388580.1| D. findlayanum -D2 75 D. findlayanum - D18 D. findlayanum voucher Jin X-H 11875|KF143462.1| 100 D. findlayanum voucher PS2531MT01 |HQ114257.1| D. findlayanum isolate D23 |JN388589.1| D. chysanthum - D7 D. chrysanthum |JN388584.1| D. chrysanthum |FJ384738.1| 77 D. chysanthum- D8 D. chrysanthum voucher Jin X-H 11430 |KF143443.1| D. chrysanthum voucher SBB-0617 |JF713093.1| 99 D. chrysanthum voucher SBB-0504 |JF713091.1| 80 D. brymerianum - D30 D. brymerianum voucher PS2510MT01|HQ114233.1| 100 D. brymerianum voucher Jin X-H10782 |KF143432.1| D. brymerianum |JN388581.1| D. brymerianum |EU477500.1| D. pulchellum voucher Jin X-H 11878 |KF143503.1| D. moschatum -D3 100 D. moschatum voucher Jin X-H 11886 |KF143492.1| D. daoense - D15 86 D. fimbriatum isolate D22 |JN388588.1| 100 D. fimbriatum - D1 D. fimbriatum voucher PS2507MT01 |HQ114229.1| D. fimbriatum voucher Jin X-H s.n. 16 (KF143461.1) D. chrysotoxum - D20 95 97 D. chrysotoxum - D21 D. chrysotoxum |EU477501.1| D. capillipes voucher NCHU-D89331201 |HM590379.1| 100 D. chrysotoxum voucher PS2501MT03 |HQ114223.1| 99 D. chrysotoxum -D16 74 D. chrysotoxum voucher PS2501MT01 |HQ114221.1| D. chrysotoxum isolate D19 |JN388585.1| D. hancockii voucher Jin X-H 13492 |KF143467.1| 88 D. hancockii isolate D25 |JN388591.1| D. hancockii voucher PS2533MT01 |HQ114259.1| 76 D. hancockii |AB593575.1| D. hancockii - D10 88 D. capillipes - D17 D. capillipes |AF362035.1| 100 D. capillipes voucher Jin X-H 10757 |KF143433.1| D. capillipes voucher PS2502MT01 |HQ114224.1| D. capillipes |JN388582.1| 91 D. amabile - D12 D. thyrsiflorum - D13 100 D. farmeri -D14 D. farmeri -D19 D. haveyanum -D26 100 D. thyrsiflorum |KC205200.1| D. thyrsiflorum voucher Jin X-H 10755 |KF143519.1| D. lindleyi - D24 96 D. lindleyi -D25 D. jenkinsii voucher Jin X-H 10709 |KF143478.1| 100 D. jenkinsii voucher PS2525MT01 |HQ114251.1| D. jenkinsii voucher Jin X-H s.n. 4 |KF143479.1| 99 D. jenkinsii isolate D29 |JN388595.1| D. draconis Rchb.f - D31 75 D. draconis |HM054628.1| 100 D. draconis voucher SBB-0545 |JF713101.1| D. draconis |EU477503.1| 73 D. wattii - D22 99 D. wattii voucher Jin X-H 11817 |KF143525.1| 99 D. longicornu voucher Kurzweil H Lwin S 2647 |KF143484.1| 74 D. longicornu voucher Jin X-H 11663 |KF143485.1| D. christyanum -D32 90 D. christyanum voucher Jin X-H s.n. 3 |KF143442.1| D. christyanum voucher Jin X-H 11045 |KF143441.1| 98 D. christyanum |GU339106.1| D. christyanum |EF629325.1| 0.02 Hình 3.25. Sơ đồ cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS 18