Tài liệu Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (bubalus bubalis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CHĂN NUÔI Nguyễn Khánh Vân NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY (Bubalus bubalis) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI- 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CHĂN NUÔI Nguyễn Khánh Vân NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY (Bubalus bubalis) Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 62. 62. 01. 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS Nguyễn Lai Thành 2. TS Đào Đức Thà HÀ NỘI – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Nguyễn Khánh Vân i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Chăn nuôi; Phòng Đào tạo và thông tin – Viện Chăn nuôi, Ban Giám đốc Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi cùng toàn thể cán bộ Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi nơi tôi công tác đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành nhiệm vụ, được học tập và hoàn thành công trình nghiên cứu của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, trường ĐH KHTN, ĐHQG Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích hình ảnh hiển vi. Để hoàn thành được bản luận án này tôi đã nhận được sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS Nguyễn Lai Thành và TS. Đào Đức Thà. Tôi xin gửi tới các thầy hướng dẫn lòng biết ơn sâu sắc về sự tận tình giúp đỡ, động viên dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Luận án này khó có thể hoàn thành nếu không nhận được sự hỗ trợ của GS. TS Vũ Chí Cương; TS. Hồ Lam Sơn; TS. Trần Xuân Hoàn; TS. Phạm Doãn Lân; TS. Lưu Quang Minh; Th.S Vũ Thị Thu Hương và các bạn đồng nghiệp. Tôi luôn trân trọng sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn gia đình và người thân đã động viên, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình công tác cũng như hoàn thành bản luận án này. Hà Nội,tháng 7 năm 2015 Tác giả luận án Nguyễn Khánh Vân ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU x DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MINH HỌA xii MỞ ĐẦU ……………………………………………………………… 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……………….. 1 2. MỤC TIEU CỦA ĐỀ TÀI…………………………………………… 3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI…………… 4 A. Ý nghĩa khoa học…………………………………………………… 4 B. Ý nghĩa thực tế……………………………………………………… 4 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN……………………… 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC…….. 5 1.1. TẾ BÀO TRỨNG TRÂU………………………………………….. 5 1.1.1. Cấu tạo tế bào trứng trâu ………………………………………… 5 1.1.2. Thu và phân loại chất lượng tế bào trứng trâu…………………… 7 1.1.2.1. Thu và đánh giá số lượng tế bào trứng trâu/buồng trứng ……… 8 1.1.2.2. Đánh giá và phân loại chất lượng trứng trâu…………………… 9 1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI THÀNH THỤC IN VITRO TẾ BÀO TRỨNG TRÂU………………………………………………………… 1.3. QUÁ TRÌNH THÀNH THỤC NHÂN CỦA TẾ BÀO TRỨNG iii 10 11 TRÂU………………………………………………………………….. 1.4. CHẤT BẢO VỆ LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH – GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG …………………………… 12 1.4.1. Các dạng chất bảo vệ lạnh……………………………………… 12 1.4.2. Cơ chế hoạt động của các chất bảo vệ lạnh……………………… 13 1.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng……… 19 1.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng…………………………………………………… 1.4.5. Quá trình giải đông và pha loãng……………………………… 1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG ……………………………… 1.5.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng……………………………………… 1.5.2. Sử khử nước (Dehydration) trong quá trình đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy……………………………………………………………… 20 21 22 22 25 1.5.3. Quá trình cần bằng……………………………………………… 26 1.5.4. Tốc độ đông lạnh……………………………………………… 26 1.5.5. Phương pháp đông lạnh………………………………………… 28 1.5.5.1. Đông lạnh chậm (Slow-freezing)……………………….. 28 1.5.5.2. Thủy tinh hóa (Vitrification)…………………………………… 32 a. Thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống…………………………… 34 b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing)………………………… 35 1.6. ẢNH HƯỞNG CỦA GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN ĐẾN HIỆU QUẢ BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG……………………………… 1.6.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm (GV) hoặc giai đoạn chưa thành thục…………………………………………………… iv 39 40 1.6.2. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII)…… 1.7. MỘT SỐ DẠNG TỔN THƯƠNG LẠNH CỦA TẾ BÀO TRỨNG TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH……………………………. 1.8. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO TRỨNG SAU BẢO QUẢN LẠNH…………………………………………………………………… 1.8.1. Đánh giá chất lượng trứng dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế bào………………………………………………………………...…… 1.8.2. Đánh giá chất lượng dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng……………………………………………………………… CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………………………….. 41 43 44 44 46 48 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu................................................. 48 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................... 48 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.............................................................. 48 2.1.2.1. Thiết bị........................................................................................... 48 2.1.2.2. Hóa chất, dụng cụ......................................................................... 48 2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 49 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 49 2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu................................................... 49 2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ................ 49 2.3.3. Phân loại tế bào trứng....................................................................... 50 2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu......................................................................................... 50 2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu................... 50 2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in 50 v vitro............................................................................................................ 2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro................................................. 51 2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng....................................................................... 51 2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu................................................ 51 2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro......................................................................... 51 2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng................................................ 52 2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống........................................................................................................... 52 2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở........... 52 2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt................. 52 2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh ................. 52 2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái trứng trâu sau đông lạnh-giải đông........................................................................................................... 53 2.4. Thiết kế thí nghiệm…………………………………………… 53 2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê……………………………… 56 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................... 56 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................... 57 3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ........................ 57 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu.......................................................................... 3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu .................................................................................................. 3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu……………………………………… 3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi vi 59 61 63 66 in vitro khác nhau…………………………………………………… 3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu................................................................................................... 3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu…………………………………………………....................... 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu......................................................................................... 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu................................................................. 3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu......................................................................... 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu ........................................................................................... 3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh –giải đông..................................................... 3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh – giải đông.......................................... 3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông................. 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu ...................................................................... 3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông............................................... 3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông.......... vii 70 71 74 78 80 85 88 91 94 101 103 105 3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải 107 đông............................................................................................................ CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ............................................... 114 4.1. Kết luận............................................................................................ 114 4.2. Đề nghị............................................................................................... 114 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.......................... 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 117 Tài liệu tham khảo tiếng Việt.................................................................... 117 Tài liệu tham khảo tiếng Anh.................................................................... 117 PHỤ LỤC.................................................................................................. 144 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BES: Buffalo oestrus serum (Huyết thanh trâu động dục) BSA: Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) buFF: Buffalo follicular fluid (Dịch nang trứng trâu) CR1aa: Charles Rosenkran,s 1 amino acid CR2aa: Charles Rosenkran,s 2 amino acid DMSO: Dimethyl sulfoxide DPBS: Dulbecol phosphate buffered saline (Đệm phosphat) ĐL – GĐ: đông lạnh – giải đông eCG: Equine chorionic gonadotrophin (Huyết thanh ngựa chửa) EG: Ethylene glycol EGF: Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng biểu bì) EMG: Electron microscopy grids (Kính hiển vi lưới điện tử) FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh thai bò) FF: Follicular fluid (Dịch nang trứng) FSH: Follicle stimulating hormone (Hormon kích thích nang trứng) Gly: Glycerol GMP: glass micropipette (Mao quản thủy tinh) GV: Germinal vesicle (Túi mầm) GVBD: Germinal vesicle breakdown (Phá vỡ túi mầm) ICSI: Intracytoplasmic sperm injection (Vi tiêm tinh trùng) IGF-I: Insulin-like growth factor I (Yếu tố điều hòa sinh trưởng giống như Insulin I) IGF-II: Insulin-like growth factor II (Yếu tố điều hòa sinh trưởng giống như Insulin II) ix IVC: in vitro culture (Nuôi in vitro) IVM: in vitro maturation (Thành thục in vitro) IVF: in vitro fertilization (Thụ tinh in vitro) ZP: Zona pellucida (màng sáng) LH: Luteinizing hormone (Hormon kích thích thể vàng) M: mol/l MEM: Minimum Essential Medium MII: Metaphase II (Thành thục nhân) mSOFaa: Synthetic oviduct fluid medium amino acid (Môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp) NST: nhiễm sắc thể OPS: Open pull straw (Cọng rạ hở) pES: Pre – equilibrated solution (Dung dịch trước cân bằng) PBS: Phosphate buffered saline PI: Prodium iode PROH: 1,2 propanediol RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute 1640 SBS: Superovulated buffalo serum SCNT: Somatic cell nuclear transfer (Cấy chuyển nhân tế bào soma) SS: Steer serum (Huyết thanh bê đực) TCM 199: Tisue culture medium 199 TGF-β: Transforming growth factor β VS: Vitrification solution (Dung dịch thủy tinh hóa) x DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 1 Tổng đàn trâu qua các năm ở Việt Nam 143 2 Chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ………… 57 3 4 5 Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi khác nhau……………………………… Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau…….. Nhân tế bào trứng trâu ở các mốc thời gian nuôi in vitro khác nhau.............................................................................................. 62 64 67 Khả năng sống và sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu 6 đầm lầy sau đông lạnh – giải đông trong các dạng chất bảo vệ 72 lạnh khác nhau................................................................................ 7 Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở các nồng độ EG khác nhau………………...... 75 Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông 8 lạnh – giải đông ở các thời gian tiếp xúc khác nhau (tiếp xúc 2 79 bước)............................................................................................ 9 Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu chưa thành thục khi giải đông trong dung dịch có hoặc không có Sucrose…………... 81 10 Số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh- giải đông… 89 11 Chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh-giải đông .. 91 12 Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu đầm 95 xi lầy sau đông lạnh-giải đông......................................................... 13 Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông ở các thời gian nuôi in vitro khác nhau............... 104 Khả năng thành thục in vitro sau đông lạnh-giải đông của tế bào 14 trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác 106 nhau................................................................................................ Khả năng phát triển in vitro tiếp theo sau đông lạnh-giải đông 15 của tế bào trứng trâu được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau............................................................................... xii 109 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình Tên hình Trang 1 Tế bào trứng trâu ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (độ phóng 58 đại 10 lần)…………………………………………………………….. 2 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV)…………………. 68 3 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ giữa I……………………… 68 4 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn kỳ cuối I……………………… 69 5 Tế bào trứng trâu có nhân ở giai đoạn thành thục (Metaphase II)……. 69 6 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị mất lớp tế bào cumulus, 77 tổn thương tế bào chất sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)…………………………………………………………………….. 7 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục bị vỡ màng sáng sau giải 82 đông (độ phóng đại 10 lần)…………………………………………… 8 Tế bào trứng trâu đầm lầy có hình thái bình thường sau đông lạnh – 83 giải đông sau nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần)…………….. 9 Tế bào trứng trâu đầm lầy bị tan rã lớp tế bào nang bao xung quanh 85 sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)………………........... 10 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái không bình 92 thường sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)....................... 11 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường 93 sau đông lạnh – giải đông (độ phóng đại 10 lần)................................... 12 Tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông bằng phương pháp cọng rạ hở sau nuôi in xiii 96 vitro 24 giờ (độ phóng đại 5 lần)............................................................ 13 Phôi trâu 2 tế bào ở ngày thứ 2 sau thụ tinh từ tế bào trứng trâu đầm 97 lầy chưa thành thục có hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông......................................................................................................... 14 Phôi nang trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy chưa thành thục có 98 hình thái bình thường sau đông lạnh – giải đông.................................... 15 Phôi dâu trâu tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải 110 đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ ( độ phóng đại 40 lần).................. 16 Phôi nang trâu giãn nở tạo ra từ tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở thời gian nuôi in vitro 24 giờ (độ phóng đại 40 lần). xiv 111 xv MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu Á và Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới. Chúng là nguồn cung cấp thịt, sữa, sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Một vài tổ chức trên thế giới đã nhấn mạnh tiềm năng của con trâu trong nền kinh tế nông nghiệp của một số quốc gia đang phát triển ở Châu Á do trâu có hiệu quả hơn so với các gia súc khác trong môi trường nuôi khắc nghiệt. Tuy nhiên con trâu vẫn thực sự chưa được chú ý để khai thác tốt tiềm năng này. Trâu cung cấp nguồn sức kéo quan trọng đối với nông nghiệp và nông thôn đặc biệt là ở vùng sâu, đồi núi, ruộng bậc thang nơi khó triển khai thiết bị cơ giới. Chúng có thể cày kéo ở tất cả địa hình như: ruộng nước, ruộng bậc thang, kéo gỗ trong rừng hoặc dưới suối. Bên cạnh việc cung cấp sức kéo, trâu còn là nguồn cung cấp thịt và sữa hoặc là nguồn thức ăn dự trữ cho những lúc khó khăn, nguy cấp; tuy nhiên do khẩu vị của người tiêu dùng chưa quen với sản phẩm này nên sữa trâu chưa trở thành hàng hóa chính. Do đó hiện nay so với một số ngành chăn nuôi khác như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan tâm phát triển đúng mức. Theo số liệu thống kê của Tổng Cục Thống kê và Cục Chăn nuôi Việt Nam, số lượng trâu trên cả nước ta đang có xu hướng giảm dần (Bảng 1 – Phụ lục), chính vì thế cần phải cải thiện khả năng sinh sản của đàn trâu để tránh hiện tượng suy giảm đàn trâu, ảnh hưởng tới nguồn gen quý. Tuy nhiên, chi phí giống cao và các vấn đề về sinh sản như biểu hiện động dục không rõ ràng, tỷ lệ động dục thầm lặng cao (Esposito và cs., 1992; Zicarelli và cs., 1997), khoảng cách giữa các lứa đẻ dài, sự thành thục về tính muộn, ít các nang trứng non, số tế bào trứng tốt/buồng trứng thấp, quá trình sinh sản bị ảnh hưởng bởi mùa vụ (Le Van Ty và cs., 1994) và tỷ lệ thụ thai thấp đã hạn chế sự phát triển của đàn trâu. Sự 1 thành công của chăn nuôi trâu phụ thuộc vào việc cải thiện di truyền mà điều này có thể đạt được bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản. Mặc dù công nghệ sinh học sinh sản đã được nghiên cứu và áp dụng ở loài động vật đặc biệt này nhưng hầu hết chúng không đạt hiệu quả như đối với bò, một loài động vật có rất nhiều nét tương đồng. Tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng trâu ở lò mổ là nguồn nguyên liệu chính được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu về công nghệ sinh học sinh sản trên trâu như: cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT), thụ tinh in vitro (IVF) và vi tiêm tinh trùng (ICSI) (Parnpai và cs., 2014). Nhưng nguồn mẫu tế bào trứng trâu này khá ít và không ổn định, số lượng tế bào trứng tốt thu được trên một buồng trứng trâu thường ít hơn khi so sánh với một số loài vật nuôi khác (bò, lợn). Chính vì vậy việc tạo ra một nguồn nguyên liệu trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là một giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm. Bảo quản lạnh là bước đột phá quan trọng trong khoa học bởi vì đó là một trong các phương pháp khá hiệu quả được sử dụng để bảo tồn sự đa dạng di truyền động vật, trong đó có cả những loài động vật có nguy cơ tuyệt chủng. Việc bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu có ý nghĩa rất quan trọng, nó góp phần gìn giữ nguồn gen những giống trâu quý, đồng thời đó là nguồn nguyên liệu giúp các nhà khoa học có thể sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu về sinh sản hay về phôi sinh học của mình. Trên thế giới vấn đề bảo quản lạnh tế bào trứng được nghiên cứu ở trên một số loài động vật từ khá lâu và đã tạo ra được con non từ tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông (Fuku và cs., 1992, Otoi và cs., 1993). Mặc dù hiện nay quy trình đông lạnh phôi và tinh trùng đã trở nên phổ biến, nhưng quy trình đông lạnh tế bào trứng vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vẫn có một số sai sót xảy ra trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng làm giảm hiệu quả của quá trình này (Leibo, 2008). Quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng 2 trâu đến nay vẫn là vấn đề còn bỏ ngỏ do hiệu quả chưa đạt được như mong muốn. Vấn đề chính đối với bảo quản lạnh tế bào trứng trâu là tỷ lệ sống và khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông không cao. Nguyên nhân là do tế bào trứng trâu có hàm lượng lipid nội bào cao, độ nhạy cảm với những tổn thương lạnh lớn (Boni và cs., 1992). Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục của tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng. Tại Việt Nam trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về con trâu; có thể do sữa trâu chưa phải là thực phẩm hàng hóa chính; chủ yếu chỉ sử dụng trâu làm sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên gần đây trâu được coi là đối tượng chăn nuôi tạo thực phẩm và cho sức kéo nên các nhà khoa học cũng đã quan tâm đến vấn đề ứng dụng công nghệ sinh học trong việc nâng cao khả năng sinh sản và đặc điểm sinh lý sinh sản của trâu nhằm bảo tồn những giống trâu quý. Luận án này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là một lĩnh vực nghiên cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là đông lạnh tế bào trứng trâu thì chưa có báo cáo nào. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Đánh giá ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). 3