Tài liệu Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 Tác giả Võ Châu Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Võ Châu Tuấn MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN.................................................3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................5 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ...................................................................5 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ...............................................5 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật .....................................................6 1.1.2.1. Nuôi cấy callus..................................................................................6 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................7 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ...............10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO...................................................................................19 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật .........................................19 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................19 1.2.2.1. Nhóm terpene ..................................................................................20 1.2.2.2. Nhóm phenol ...................................................................................20 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen............................................................20 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật..............................................................................................................................21 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước........................................................21 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................25 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN ..............................................................28 1.3.2. Thành phần hóa học.............................................................................28 1.3.3. Công dụng .............................................................................................30 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền .......................................................................30 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học ....................................................................30 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen ................35 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................37 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................37 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................38 2.3.1. Nuôi cấy callus ......................................................................................39 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào...................................................................39 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác .............................39 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men..................................40 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào ........................................40 2.3.4. Định lượng tinh dầu .............................................................................41 2.3.5. Định lượng curcumin ...........................................................................41 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước ................................42 2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................42 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu ..................................43 2.3.9. Xử lý thống kê.......................................................................................43 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................44 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................44 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC..............47 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy.........................................................47 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ....................................................................49 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST .................................................................51 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA ..........................................................................51 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D......................................................................52 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ...........................................................52 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon.............................................................54 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose...................................................................54 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose...................................................................56 3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN.....................59 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào .........................................................59 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy......................................................61 3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................61 3.3.2.2. Tốc độ khuấy ...................................................................................62 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí .........................................................63 3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN.........................................................65 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu .............................................................................65 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số ...................67 3.4.3. Hàm lượng curcumin ...........................................................................68 3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................73 3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ...77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................80 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................................................................................................................. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83 PHỤ LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine BA : 6-benzyladenine CIB : centrifugal impeller bioreator cs : cộng sự DMSO : dimethyl sulfoxide ĐC : đối chứng ĐHST : điều hòa sinh trưởng HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid IBA : indolebutyric acid Kin : kinetin L : lít L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine LPS : lipopolysaccharide MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid Nxb : nhà xuất bản TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tên bảng Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L Trang 44 46 48 50 51 52 53 54 56 57 62 63 64 14 15 16 Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 66 67 69 Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene 17 trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự 74 nhiên 18 Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 3 4 5 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 45 47 55 Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình 6 tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 58 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút 7 8 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặt trên máy lắc Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 59 60 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 9 nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 60 100 g 10 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61 Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men 11 nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 65 200 g 12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) 71 13 14 Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 72 73 Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự 15 nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 76 đến 18 ngày 16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77 1 MỞ ĐẦU  1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106]. 2 Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax… [163]. Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82]. Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức 3 chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng” 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu 4 ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L. - Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. - Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro [93]. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút. Mặc dù không thành công trong nuôi cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường Linsmaier và Skoog [85]. Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164]. Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược 6 phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164]. Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177]. Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177]. 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12]. 1.1.2.1. Nuôi cấy callus Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng [93]. Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại 7 trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy chuyển [42]. 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35]. Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù 8 đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104]. Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào. Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn. Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35]. Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Trong quá trình nuôi cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài. Khi các chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế. Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12]. Nhìn chung, có ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục. - Nuôi cấy mẻ Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha nhất định với những điều kiện đặc trưng [7]. Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn, chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn… 9 nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha. Pha lag (pha tiềm phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào môi trường cho đến khi có dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và số lượng tế bào. Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định. Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12]. - Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ dịch nuôi cũ. Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng dưới dạng đậm đặc. Phương thức này vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ, vì toàn bộ thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129]. - Nuôi cấy liên tục Những hạn chế chính của nuôi cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men [48]. Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian nuôi cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định. Trong phương thức nuôi cấy này, dòng đi vào (môi trường mới) bằng với dòng đi ra (gồm môi trường, tế bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138]. 10 Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Về cơ bản, thiết lập một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết ra hoặc không tiết ra môi trường [23]. 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như cải thiện điều kiện nuôi cấy [12]. Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói, khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135]. - Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào. Thể tích đóng gói của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi quay ly tâm. Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu. Các phương pháp này thuận lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình tam giác với điều kiện nuôi cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở lại các điều kiện nuôi cấy trước đó. Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình thái tế bào [93]. - Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh