ì i V / f i . ;>i
DAI HOC QUÓC GIÀ HA NÓI
Tnròng Dai hoc Khoa hoc Tìi nhien
Trình Hong Thài
NGHIÈN CÙU PROTEINAZA VA CHAT ÙC CHE
PROTEINAZA Ò SAU XANH (Heliothis
armigera)
Chuyèn ngành : Sinh ly hoc dòng vàt
Ma sé : 10516
LUAN AN PHO TIEN SY KHOA HOC SINH HOC
Ngiròi hifóng dàn khoa hoc:
1. GS.TS. niam TM Tran Chàu (hiTÓng din chinh)
2. PGS.PTS* Trinh Hflù Hang (hiróng dàn phu)
3. PTS, Nguyln Yèn (hiTÓng dàn phu)
f!^';':0<'^'
Ha noi -1995
BANG CÀc CHU VIET TAT VA KI HIEU
ATEE : N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester
BApNA: N-benzoy1-DL-arginine p-nitroani 1ide
BI: ch^t ÙC che' bromelain
DC: dich chié't
DCN: dich chié't nhóng
DMTN: dich màu tién nhóng
HaP6-I; HaP6-Il: proteinaza cùa sàu xanh tuoi 6
HaP5-I; HaP5-II: proteinaza cùa sàu xanh tu^i 5
HBR: ho9t dò riéng
lU; ddn vi ùc che enzim
KI: chat ùc che kimotripxin
KIA: ho^t dò ùc che kimotripxin
PA: hogit dò proteolitic
PAGE : dién di trèn gel poliacrilamit
PI : chat ùc che proteinaza
PIA: ho^t dò ùc che proteinaza
PMSF: PhenyImethane sulfony1fluoride
PPI: protein ùc che proteinaza
PSI: ch^t ùc che' proteinaza cùa sàu
TIA: ho^t dò ùc che' tripxin
TI: ch^t ùc che' tripxin
TECK: Na-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone
TPCK: N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone
U: ddn vi enz im
M V C
L V C
trang
MÒ dàu
1
Phàn I , Tò'ng quan tal li^u
I. Proteinaza
3
3
1 . B$ii ciidng ve proteinaza
3
2.ProteinazaÒcòntrùng
7
2.1. Proteinaza tièu hoà
7
2.1.1. He thò'ng òng tièu hoà Ò con trùng
7
2.1.2. Proteinaza ruòt giùa cùa con trùng
9
2.1.3. Kièm soàt sU tièt càc proteinaza tièu hoà
17
2.2. Proteinaza trong sV phàt trièn cùa con trùng
19
2.2.1. S\l tàng trUÒng va phàt triè'n Ò con trùng
19
2.2.2.Proteinazalysosom
20
II. Ch^t ùc che' proteinaza
23
1. B^ì
23
cUdng ve chat ùc che proteinaza
1.1. Mot s6 tinh ch^t va eà'u trùe cùa phàn tù PPI
24
1.2. Cd che tiidng tàc giùa chat ùc che Proteinaza va
prote inaza
26
2. Ch^t ùc che' proteinaza b con trùng
27
2.1. Sarcocystatin
28
2.2. Ch^t ùc che' proteinaza xerin
29
2.2.1. Ch^t ùc che' lo^i Kunitz
29
2.2.2. Ch^t ùc che' Serpin
29
2.3. Vai trò cùa chélt ùc che' proteinaza
32
3. Ung d\ing cùa ch^t ùc che proteinaza
33
Phàn II. Nguyèn li^u va phUdng phàp
35
I. Nguyèn 1iéu
35
II. Hoà chà't va thiét bi thi nghi^m
36
III. PhUdng phàp
36
I. Biéu che' thuó'c thù Fo 1 in-Ciocal teau
2.Xàcdinhho9tdòenzim
36
37
2.1. Xàe dinh ho^t dò proteolitic theo phUdng phàp Anson
cài tié'n
37
2.2. xàe djnh ho^t dò phàn giài BApNA theo phUdng phàp
Erlanger
38
2.3. xàe djnh ho^t dò proteolitic b^ng phUdng phàp
khuyè'chtàndiath^ch
3. X à c d j n h d ò b é n v ó i n h i ^ t
38
eùaenzim
39
4. X à c d j n h n h i ò t dò t h i c h h p p c ù a e n z i m
39
5. Xàe dinh pH thich h0p
39
6. Xàe dinh dò ben vói pH
40
7. xàe dinh ành hUÒng cùa càc ion kim lo^i va càc chat
klm hàm
d^e hiéu nhóm
40
8. xàe dinh ho§it dò ùc che' enim
40
9. xàe dinh protein theo phUdng phàp Lowry
40
10. Biòn di trèn gel poliacrilamit
41
II. Biòn di trèn gel poliacrilamit 7,5%, pH8,3 co ed chà't
theo phUdng phàp Hanspal cài tièn
44
12. Xàe dinh proteinaza bÈng. dién di SDS-PAGE co ed chKt 44
13. Tinh s^ch proteinaza va eh^t ùc che' proteinaza
45
Phéìn III. Ké't qua va bàn lu^n
47
1. S\l bièn dòi cùa proteinaza va chStt
ùc che' proteinaza
trong qua trình bièn thài tù àu trùng dèn con trUÒng
thành
47
1.1. Ho§it dò proteolitic va antiproteolitic trong giai
doginàutrùngvàtiénnhòng
47
1.2. Ho§it dò proteolitic va antiproteolitic trong giai
do^innhòngvàcontrUÒngthành
1.2.1. Hàm lU0ng protein,
TIA,
51
KIA trong qua trình
bièn thài tù nhòng dèn con trUÒng thành
51
1.2.2. Ho^it dò proteolitic trong qua trình bièn thài
tùnhòngdè'ncontrUÒngthành
57
2. Tinh sg-ch va nghièn eùu mot so tinh chat cùa proteinaza
Ò sàu xanh
63
2.1. Anh hUÒng cùa mot so yèu tò dèn ho§it dò proteolitic
cùa dich chié't sàu tuò'i 5
63
2.1.1. Ành hUÒng cùa pH va nhi^t dò dè'n ho^t dò
proteoii t ic
63
2.1.2. Bò ben vói nhi^t
65
2.1.3. Bò ben vói pH
66
2.1.4. Anh hUÒng cùa mot so
ion kim lo^i hoà tri 2
mot so' chat khàc dèn ho?it dò enzim
2.2. Tinh s^ch proteinaza va
nghièn eùu mot so
cùa ehùng
2.2.1. Tinh S9ch proteinaza cùa sàu xanh
va
67
tinh chÉlt
70
70
2.2.2. p H t h i c h h 0 p c ù a e n z i m
76
2.2.3- Anh hUÒng cùa ion kim lo^i va mot so chat khàc
dénho§itdòenzim
76
2.2.4. Tinh d^c hi^u ed eh^t cùa HaP6-I va HaP6-II
3. Sy phàn b^ cùa ch^t ùc che' proteinaza Ò
77
càc phàn
khàc nhau cùa ed thè' tién nhòng sàu xanh
85
4. Phò dién di càc PI trong dich chièt tù nhòng va càc phàn
khàc nhau cùa ed thè' tién nhòng sàu xanh
87
5. Tinh S9ch chat ùc che' tripxin tù tién nhòng va nhòng
sàu xanh
89
Phàn IV. Kè't luàn va de nghi
102
A. Kè't luàn
102
B. Bé nghi
104
Phàn V. Tài liòu tham khào
106
l^JKXJ
MCJ
(Heliothis
Sàu xanh
armigera)
là
thuòc bò Lepidoptera,
tUdng dòi phd
thè giói. O nuóc ta,
sàu xanh là sàu
vi vày nò là d6i
tU0ng phòng
trong bòng. Ngoài
biè'n Ò nhiéu
sàu
nUÒc trèn
h^i bòng nghièm trpng,
trù dàng
cày bòng,
con trùng gay h^i
luu y
xanh con
trong càc vùng
gay h^i
càc cày
tróng khàc nhU thàu dàu, thu6c là, cà chua, dàu d6, cày ngò...
Trong nhùng nàm gàn day,
h^i ngUdi ta dà sù dyng
thuòc hoà hpc ngày
thành di eh mòi
de' kié'm
nhiéu lo^i thuòc
càng nhiéu,
càng nghièm
khòng
soàt con trùng gay
hoà hpc. Vi^c
h0p ly
trpng hdn.
dùng
làm phàt s inh
Ngoài viéc dùng thuòc
qua nhiéu gay khà nàng khàng thuòc cùa sàu,
thi thuòc hoà hpc
dà phà vd ckn bang cùa ky sinh thién djch va
sàu h^i trong t\l
nhièn, làm cho sàu h^i
co diéu kién
phàt trièn tu
do vi màt
yèu t6 kim hàm [11]. Vi^c dùng thuòc hoà hpc con gay nèn nhùng
vlLn de nghièm trpng ve mòi trUÒng,
dèn sue khoè con nguòi. Vi vày»
phàp mòi co hiéu qua hdn va
diéu này co ành hUÒng x^u
nguói ta dà di tim nhùng bi^n
it gay h$ii dèn mòi
trUÒng nhU sÙ
dyng càc che' phàm sinh hpc de trù sàu h^ii cày trÒng:
che' phàm
virus Nuclea Polyhydrosis virus (NPV) dà dU0e Vi^n bào v^ th^c
vàt nghièn eùu va àp dyng co hi^u qua. . .
Nàm 1973,
Ryan [145] dà phàt hién ra
cùa thUc vàt nhd chat ùc che proteinaza,
khà nàng bào ve
sau dò là nghièn eùu
cùa nhiéu tàc già khàc [38,70] dà thùc d^y tim kiè'm mot phUdng
phàp mòi de kiè'm soàt con trùng
gay h^i dila trèn khà
nàng ùc
che proteinaza bòi càc eh^t ùc che' cùa ehùng. vi vày»
nghièn eùu ed bàn ve sàu khòng ehi eó y
nhùng
nghia khoa hpc ma con
co y nghia th^c ti^n.
Hién nay,
trèn thè' giòi cùng nhu ò
dang là d6i tU0ng dU0e quan
cày tróng cùa ehùng
tàm nhiéu do
cùng nhU
khà nàng
phòng thi nghièm de sÙ dyng cho nhùng
nUòe ta sàu xanh
tinh chlit phà
nuòi thuàn
ve
màt
sinh
hoà
nói
proteinaza va chat ùc che proteinaza cùa
này t^o diéu kién
cho
vi^c
proteinaza tù thUc vàt co
trùng. Màt khàc,
tim
chung
càn phài eó
cùng
nhU càc
sàu. Nhùng hièu blè't
kiè'm
càc
tàc dyng ùc cliè
chÉit
ùc
che'
proteinaza cùa con
nhùng phàt hién ve ch^t ùc che' proteinaza Ò
con trùng con bò sung cho càc nghièn eùu
ùc che proteinaza
l0i trong
thù nghièm ve thu6c trù
sàu. 9é co Cd sò phòng trù mot càch eó hi^u qua,
nhùng hièu bièt
ho^i
làm
ed
sÒ
cho
diéu tra ve càc chllt
nhùng nghièn eùu ùng dyng
ehùng.
ehùng tòi nhàn de
va chat ùc che proteinaza
tài luàn àn "Nghièn
Ò
sàu
eùu proteinaza
(Hel iothis
xanh
armigera)'*
nh^m gòp phàn nghièn eùu ed bàn ve sàuxanh vói m\ic dich sau:
- Nghièn
eùu
proteinaza
va
ch?lt
ùc che' proteinaza
trong qua trinh phàt trièn va bièn thài cùa sàu xanh.
- Tim hièu proteinaza va ch^t ùc
che' proteinaza Ò sàu
xanh làm co sÒ cho nhùng thù nghièm ve thuòc trù sàu.
Phàn I
éO
TONG QUAN TAI LI^U
I. Proteinaza
1. Bai cUdng ve proteinaza
Proteinaza là enzim
xùc tàc cho
càc lién ké't peptit trong càc
qua trinh thu^
peptìt hoàc trong
phàn
protein theo
phàn ùng:
-CH-C-N-CH- + H2O
I II I I
R O H R'
> -CH-C-OH + HN-CHI II
II
R O
H R'
Trong càc proteinaza,
enzim tièu hoà dU0c nghièn eùu
som hdn cà. Ngay tù thè' k^^ 18,
nhà tU nhièn hpc ngUÒi Phàp là
Reomur dà phàt hién ra trong
dich d^ day cùa chim
tàc dung tièu hoà
dò nhiéu
thit. Sau
àn thit co
proteinaza Ò dòng vàt,
thUc vàt va vi sinh vàt dà dL(0c phàt hié-n.
Viéc phàn lo^i va gpi
tèn càc enzim xùc tàc
ùng thui^ phàn protein cùng thay
dòi qua càc thòi
- Theo Grassmann va Dyekerhoff (1928),
cho phàn
ky [24]:
càc enzim nhóm
này dU0e chia ra nhu sau:
Pròteaza
1
Proteinaza
Peptidaza
- Theo Bergmann va
chia thành 2 nhóm:
.
,
Endopeptidaza
Ross (1936),
peptidaza I51Ì
dU0c
Pept idaza
^
'
,
Exopeptidaza
- 4 -
Theo Barrett va Donald (1986):
Peptidaza
(Pròteaza)
[
I
1
Endopept idaza
Exopeptidaza
(Proteinaza)
Nàm 1960,
Hartley [83] phàn
chia proteinaza thành
nhóm theo ed che' xùc tàc. NhUng do nhùng
hoà hpc trung tàm
xùc tàc
cùa nhóm
4
hiè'u bié't mòi ve màt
này nèn
Barrett [24] da
thay dòi cho phù h0p va dU0c u5^ ban danh phàp hoà sinh quo e tè'
còng nhàn ( 1984).
Theo Barrett [24],
nhóm nhò. Tèn càc
nhóm
trpng nh^t co vai
trò
proteinaza dU0c phàn chia thành 4
này
xùc
bao
tàc
gòm
tèn cùa axit amin quan
trong
(TTHB): proteinaza xerin (EC.3.4.21);
trung
tàm
ho$it dòng
proteinaza xistein (EC.
3.4.22); proteinaza aspartic (EC.3.4.23);
proteinaza kim lo^ii
(EC. 3.4.24).
* Proteinaza xerin:
cùa gdc axit amin xerin trong
trpng óéì
vói ho$it dóng xùc
là nhùng proteinaza eó nhóm -OH
TTHB co vai trò
dàc bi^t quan
tàc cùa enzim. Thuòc
nhóm này co
càc enzim nhU tripxin, kimotripxin,...
Tripxin, kimotripxin bi ùc che' m^nh duòi tàc dyng cùa
DFP (diizopropy1f1uorophosphate)
va
nhiéu
protein
dàc hiéu
khàc nhu ch^t ùc che' tripxin dàu tUdng.
càc proteinaza
kiém va co tinh
xerin
dàc hiéu
thuòng
tUdng dò'i
ho^it
dòng
róng. Tinh
m^tnh b vùng
dàc hiéu cùa
ehùng thè' hi^n ve phia gó'c
kè't bi phàn giài.
peptit chùa nhóm
Vi dy
-CO-
axit amin chùa nhóm -CO-
nhU tripxin
cùa
càc
thuj^ phàn
cùa lién
càc lièn k^t
axit amin kiém (Lys,
Arg),
kimotripxin xùc tàc phàn ùng thu^ phàn lièn kèt peptit co nhóm
-CO- cùa càc axit amin thdm,
* Proteinaza xistein:
càc proteinaza thuòc
co nhóm -SH trong trung tàm ho$it dòng. Nhóm
bièt trong chùc nàng cùa phàn tÙ enzim vi
-SH co vi tri dàc
nò eó khà nàng phàn
ùng cao, tham già nhiéu lo^i
bièn dòi hoà
photphoril hoà,
ankyl hoà. Vai
ò xi hoà,
trong phàn tÙ enzim th^ hi^n Ò nhiéu màt:
trung gian enzim-cd chat,
nhóm này
hpc nhU axit
hoà,
trò cùa nhóm -SH
t^o thành phùc chat
s\l kèt h0p vói ed chat va cofaetor,
duy tri càc càu d^ing ho^t dòng cùa enzim.
càc proteinaza
trung tinh, co
xistein
tinh dàc
hi^u ròng.
dU0c khi nhóm -SH trong TTHB cùa
càc eh^t nhu xistein,
thUÒng
ho^t
dòng
m^inh Ò pH
Proteinaza ehi ho^-t dòng
nò khòng bi bao vày.
Do dò
axit ascorbie b nÒng dò xàe dinh thUÒng
eó tàc dyng làm ben, ho^it ho a enzim này.
Mot SÒ mu6i kim lo^i nàng,
dàc bi^t là càc mu6i thuj-
ngàn nhu p-chloromercuribenzoate (PCMB) va càc eh^t
iodoaxetamit eó tàc dyng ùc che
khàc
nhU
càc proteinaza xistein. Chung
bj ò xi hoà duòi tàc dyng cùa càc ch^t ò xi hoà nhU iot, H3O2.
.. EDTA co khà nàng kè't
h0p vói càc
ion kim lo^i
trong dung
dich, vi vày thuòng làm tàng dò ben cùa proteinaza xistein.
* Proteinaza aspartic:
cacboxyl trong TTHB. càc
là nhùng proteinaza chùa nhóm
nhóm eacboxyl này
thuftc m^ch R
cùa
Asp, giù ho^e cùng
co thè'
polipeptit. Chung dóng vai
càc proteinaza
là nhóm
cacboxyl dàu
trò xùc tàc
aspartic
C cùa chu6i
trong TTHB cùa enzim.
thUdng
ho^it
dòng m^inh Ò pH
axit. Chung bi ùc che' bòi diazoacetylnorleucine methyl
(DNME). Chung eó tinh dàc hiéu é6ì
phia cùa lièn kè't
peptit
bi
vói càc
phàn
ester
axit amin Ò cà hai
giài.
Càe
axit amin này
thuòng là axit amin thdm hoàc là axit amin ky nUÓe.
* Proteinaza kim logii:
là
nhùng proteinaza càn
lo^i cho ho^t dòng xùc tàc cùa ehùng. Nói chung,
klm
càc kim lo^i
co thè tham già trong ho^t dòng xùc tàc cùa càc enzim theo càc
càch khàc nhau:
là thành phàn eà'u t^o cùa coenzim (eatalaza,
peroxidaza. . . ) hoàc t^io
thành l ièn kèt
gò'c axit amin trong phàn tÙ enzim. Ngoài
lo^ii, dàc biét là ion Ca
còng hoà tri
ra,
vói càe
mot s6 ion kim
thUÒng eó tàc dyng làm ben càu trùc
khòng gian cùa phàn tù enzim,
do dò ànti
hUÒng dèn ho^it dòng
xùc tàc cùa ehùng.
càc proteinaza kim lo^i
thUÒng ho^t dòng m^nh
vùng pH trung tinh va eó tinh
dàc hi^u ve phia g^c
chùa nhóm -NH- cùa
peptit
lièn
kè't
(1974) con gpi là aminoendopeptidaza).
(vi
vày,
kè't peptit chùa
axit amin ky nUÓc eó kieh
thUÒc lòn hoàc càc
kim lo^i bi giàm ho^t d^ng
axit amin
nèn Morihara
Càc proteinaza này
thè' tàc dyng Ièn càc lièn
dU0c t^o thành tù càe axit amin phàn
nh^t Ò
nhóm -NH- cùa
co
càc
H è n kè't peptit
tù th^p. Càc proteinaza
m?inh duòi tàc dyng
cùa EDTA,
O.
phenanthrolin,
càc proteinaza
tham già
trong hàu
hè't càc qua trình
quan trpng xày ra trong
he th6ng s6ng.
vai trò chia khoà trong vi^c
diéu hoà qua trinh
protein trong tè' bào ma con
khàc nhu tièu hoà,
Chùng khòng chi
dóng
song dòi mòi
tham già nhiéu qua trinh
sinh ly
hình thành bào tÙ Ò vi sinh vàt, qua trinh
dòng màu, này màm, làm chin qua,..
2, Proteinaza Ò con trùng
2.1. Proteinaza tièu hoà
2.1.1. He thdng ^ng tièu hóa Ò con trùng
MÒ tà chi tièt ve
hoà con trùng eó
thè
giài phSu va
tim
thày
6ng
sinh ly cùa
trong
càc
còng
trinh
tièu
cùa
Wigglesworth [182] va House [86].
He th6ng tièu hoà
cùa con
trùng gÒm
6ng
tièu hoà va
càc tuyè'n lièn quan (hinh 1 ) . Giài phSu rà't biè'n d^i de' thich
h0p vói nhùng yèu
càu riéng
cùa m5i
nhóm còti
trùng 66i
vói
càch sù dyng thùc àn va sU thich ùng thi r^t da d?ing.
Ruòt truv^c
^''^^
tit
Hàu mòn
Wi^ng Tuyé'n
Diéu
nUtyc
bpt
'^'^'Ot
g i ùa
Ruòt
Ong
sau
Ma1p i gh i
Hinh 1. Sd dò chung ve 6ng tièu hoà cùa con trùng
Ong tièu hoà là mot òng nói giùa
3 vùng: ruòt trUÒc,
ruót giùa,
ru$t sau eó nguÒn g^c ngo^i bi ,
mi^ng va hàu mòn. Ce
va ruòt sau.
Ruòt truòc ve
va lòp tè' bào biè'u mò cùa càc
- 8
ed quan này nàm dpc theo lòp biè'u bi- lòp
hình thành nèn
bò
xUdng
thuc hién chùc
nàng du
cùa
con
trù thùc
protein cùng- kltin
trùng, Ru^t trUÒc chù yè'u
àn thò
va dung tich cùa nò
thuòng tàng Ièn theo mùa. TÙ ruòt trUòe càc gòi thùc
àn rièng
biét di vào ruòt giùa qua khoang trUÒc- mot vai eó thè eó phàn
nghièn de' làm giàm kieh thuòe
ndi tièu hoà va hà'p thu
cùa mành thùc àn.
thùc àn. Ruòt
bi, khàc vói ruòt trUÒc va ruòt
tè' bào hinh try kèm theo
Ruòt giùa là
giùa eó nguÒn
g6c nói
sau. Nó dU0e lót bòi
mot lòp
càc té bào
goblet. Càc té
bào hinh
trv eó chùc nàng tiè't enzim tièu hoà va
hStp thy càc chgft trao
d^i hoà tan. Khòng co qua trinh thUc bào
càc mành nhò thùc àn
va vi vày tà't cà thùc àn phài
dU0e tièu hoà dèn phàn
nhò hoà
tan eó thè di qua dU0c màng té bào.
Dién tich bé màt
cùa ruòt giùa
thuóng dU0c tàng
t^i dàu trUÒc bòi su lÒn
ngU0e ra dU0c
gpi là ruòt
vùng khàc nhau
giùa eó
cùa ruòt
tri pH cùa khoang,
già tri này
thè dupe
Ièn
tit. Càc
dàc trUng bòi già
co thè bièn dòi
ro ràng dpc
theo khoang ruòt giùa. Biéu này eó thè
tUdng ùng vói nhùng sU
khàc nhau ve chùc
nàng cùa
ve sU
thu, cùng nhu càc
qua
trinh
tièu hoà rdi ruòt giùa di
cùa nó càe chat
thài
ruòt giùa
Phàn
vào ruòt sau,
chùa
Malpighi. Chùc nàng chù
khàc.
nitd
hoà
yèu cùa ruòt
tièu hoà va h^p
thùc àn khòng dU0c
ndi ma
tan
di
Ò dàu truóc
vào
sau là h^p
càc
6ng
thu nUÓe va
chuàn bi bài t ièt.
Vé pH cùa
òng tièu
dU0c nghièn eùu bòi nhiéu
hoà cùa
^u trùng
Lepidoptera dà
tàc già. Waterhouse [178]
dà phàt
- 9 -
hién thlly pH cao
Ò àu
trùng nhUng
\^i,
trUÒng thành. Trai
màu
eó
trò nèn
pH
luòn
Berenbaum [28] dà chi ra ràng pH cao
quan dén thùc àn thUc vàt va
eó màt
trung
tInh.
cùa òng tièu hoà co lièn
de' bào vé càc loài
vói hàm
[46] dà SÙ dyng vi dién cUc
gàn
co thè vói mùc tanin
àn. pH cao dupc giài thich là
khòi càc ch^t dòc
trung tinh Ò con
lii0ng cao
trong thùc
àn thUc vàt
Ò thUc vàt. Dow
do pH dà tim thà'y già
tri pH cao
hdn 12 Ò ruòt giùa va pH biè'n dò'i dpc theo 6ng tièu hoà. Trong
khi màu, thùc àn,
ruòt sau va phàn luòn luòn eó pH trung tinh
hoàc axit thi già tri pH
tàng Ièn rat
nhanh Ò phàn
trUÒe va
phàn giùa cùa ruòt giùa, rtìi ngà vé phia trung tinh Ò phàn sau
cùa ruòt giùa.
2.1.2. Proteinaza ruòt giùa cùa con trùng
Nghièn eùu nhàm xàe dinh tinh chat cùa proteinaza tièu
hoà dà dU0c thUc
hién vói
dich thò
hoàc nghièn
ruòt giùa hoàc phàn chùa trong ruòt giùa.
h0p nghièn toàn
bò ed
thè. Proteinaza
bòi ho^^t dòng cùa nó trèn mot sÒ ed
Trong mot sò trUdng
thUÒng dU0c
xàe dinh
chat protein nhU gelatin,
cazein va hemoglobin hoàc bòi thu^ phàn càc
nhu càc ester màu cùa càc dSn xuàt axit
dàc hiéu proteinaza xerin,
dóng thè mò
ed eh^t dàc hiéu,
amin. Càc ch^t ùc che'
proteinaza kim lo^i va proteinaza
sulfhydryl dà dU0c kièm tra cùng nhU càc
chat ùc che' t^ng h0p
TECK va TPCK.
Nhiéu nghièn eùu dà
vói djch chi^t thò,
gap phài khó khan
khi nghièn eùu
dàc bi?!t là khòng thè' phàn biét dU0c càc
enzim dàc hi^u rièng vói
enzim eó tinh dàc
hiéu róng. Trong
10 -
mot s6 trUÒng h0p
enzim dà
dU0c tàch
ra,
va trong
rat it
trUÒng h0p enzim tinh s^eh dà dU0c xàe dinh tinh chat,
Nhiéu già thiè't va thUc nghièm dà
chat ùc che enzim tièu hoà di
cùng vói thùc àn.
Khi chat
vói hàm lU0ng tUdng
dU0e dUa ra vói càc
vào òng tièu hoà cùa
ùc che
dòi cao
proteinaza co
(>5% protein
gay dòc dò'i vói con trùng [145]. Vi du,
che tripxin
d$c
hiéu,
nèn
Gooding [73] dà nhàn
enzim
trùng àn càc thùc àn nhu vày dU0c lUa
enzim tièu hoà
con trùng khòng thè phàt
càc enzim proteolitic
dà
proteolitic cùa con
chpn de nghièn eùu. Nàm
tièn hành nghièn eùu càc
bòt ( T e n e b r i o
cùa mpt
morsi tans) ,
dàu tUdng) eó chùa chat ùc
càc
1964, Applebaum va tàp thè [19]
moli tor)
trièn dU0e trèn
dà dU0c
Ò thUc vàt
hoà tan) thi chùng
thày su ùc che' tripxin Ò rutìi Tése (Glossina
Vi nhiéu lo^i h^t (vi dy,
con trùng
vi
bièt ràng
thùc àn dàu
chùng minh
khoang ruòt giùa àu trùng. SÙ dyng chat ùc
là rat
tUdng.
glàu trong
che' va ed chl[t dàc
hi^u eó thè phàt hién dU0e ho^t tinh cùa cacboxypeptidaza B va
aminopeptidaza,
cùng
nhu enzim
tUdng tu
tripxin. Enzim dà
dU0c tinh sgeh tùng phàn nhò phUdng phàp sac ky
trao d^i ion,
eó khà nàng thuj^ phàn càe
va polilizin.
ester axit amin kiém
NÓ bi ùc che bòi chat ùc che tripxin
h0p dU0c hinh thành co hàng
dàu tUdng,
s6 phàn ly
màc dù phùc
cao hdn hàng
s6 phàn
ly cùa phùc h0p chat ùc chè'-tripxin bò.
Proteinaza tièu hoà cùa Tenebrio
dà dU0c Pfleiderer va
Zwilling [137,186] tiép tyc nghièn eùu. Càe tàc già dà tàch
dU0c 2 proteinaza tù con trUÒng thành, Enzim dàu tièn trong so'
11
này ('*proteinaza-a" ) co khò'i lU0ng phàn tù
bòi PMSF, nhUng khòng thùy phàn càc dàn
d^n xuàt cùa tyrozin
hUÒng bòi TECK
khò'i
va
(BAEE hoàc
TPCK.
Enzim
lU0ng phàn tù 60000,
tripxin dàc thù.
Nò
bi
24000 va bi ùc che'
xuàt cùa arginin hoàc
ATEE), NÓ
thù
cùng khòng bj ành
hai ("proteinaza-3") co
nhUng mang tàt cà càe dàc diè'm cùa
ùc
che' bòi
tripxin va bòi TECK va PMSF,
mot
s^ protein ùc che'
nhUng khòng bi ùc che' bòi TPCK.
Proteinaza-p eó ho$it tinh dò'i vói ed chfiit BAEE, nhUng khòng co
ho^t tinh dò'i vói ATEE,
tàc già dà kè't
luàn
va nó thujr phàn polilizin. Vl vày càc
rSng
nó
co
thè' gi6ng
vói
"tripxin
Tenebrio" cùa Applebaum va tàP thè' [19].
Tripxin
nhiéu, va ho^it
tièu
hoà
tinh
cùa
cùa
con
càc
trùng dà dU0c nghièn eùu
enzim
kimotripxin,
cacboxypeptidaza va aminopeptidaza cùng dà dU0e xàe dinh Ò mot
s6
loài con trùng.
s§ich va nghièn
Mot trong
eùu khà
vàng, Vespa orientaiis
chi tièt
trèn dà
dU0c tinh
là kimotripxin
cùa ong bau
dòi ion va sac ky ài
lUc dà tinh
[ 102].
Kè't h0p sac ky trao
s^ich dU0e kimotripxin
nhùng enzim
tù
ruòt
giùa
àu
Enzim co khò'i lU0ng phàn tù 13000-14000,
trùng V,orientai
is »
nhò hdn nhiéu so vói
hàu hè't kimotripxin dà biét [102]. Kh6i lU0ng phàn
tù dà dU0c
xàe dinh bòi mot s^ phUdng phàp nhU:
skc
sièu ly tàm,
ky Ipc
gel, di^n di trèn gel poliacrilamit co va khòng eó SDS- tàt cà
r^t phù h0p vói nhau.
d Tineola
enzim tUdng tu
bissel
tripxin,
1 iel la,
enzim
Ward [174] dà phàt hi^n thÈly
tUdng
tu
kimotripxin,
hp
12
aminopeptidaza,
cacboxypeptidaza va hai metalloendopept idaza.
Bang lUu y trong loài này
là khà nàng thu5^
phàn keratin- mot
protein chiù nhiét va khòng hoà tan. Càc còng trình nghièn eùu
dàu tièn vé con
trùng
tièu
hoà
long
dà
dU0c tò'ng kè't bòi
Waterhouse [179]. Con trùng àn long duy tri diéu ki^n khù m^nh
trong ruòt giùa àu trùng (Eh=-190 dén -280 mV) va do dò eó khà
nàng khù lién ké't disulfit là yéu t6 t^o nèn tinh ben vùng cùa
keratin. vi vày,
sau khi lièn két này bi khù,
keratin eó thè'
bi thujr phàn bòi enzim proteolitic.
Aminopeptidaza cùa T,bisse11ie1
s?ich va ehùng là
mot nhóm
phàn tù va dò tich
phùc t^p
dién
[175].
metal loproteinaza khò'i lU0ng
bi ùc che bòi càc
liei
vSn chUa dU0c
khàc nhau
Bang
chat t^io
phùc càng
chù
y
cua vói
hdn
nhàt [177]. Dùng phUdng phàp
là
2
Cà hai déu
kim lo^i. Hai
chié't tù dich chiét toàn
la va d^ng chù yéu dà
tinh
vé khò'i lU0ng
phàn tù 24000 [176],
caeboxipept idaza dà dU0c tàch
thè' T.bissel
la
bò ed
dU0c tinh s«ich dèn dÓng
Ipc gel dà
xàe dinh dU0c
nó eó
khò'i lU0ng phàn tù bang 72000 (so sành vói 34000 cùa càc enzim
tyy). cùng nhU vói enzim tyy,
nó eó cùng tinh chÉlt bi ùc che
bòi càe chà't ùc che thiol va 1,
10-phenanthro 1 in,
cùng bi ùc che' bòi DFP nhU là enzim n^m
men. Càc enzim này co
tinh dàc hiéu ed chat vói
dipeptit va tripeptit tUdng
càc enzim tyy.
Chùng
co
khà
arginin, lyzin
ò dàu
N tàn
prolin thi khòng
bi
phàn
nàng
cùng,
ci^t,
nhUng nò
tU vói
phàn giài càc peptit vói
con peptit
trong
Leu-Gly-Leu l^i bi thu^' phàn rat nhanh.
khi
vói dàu N là
Z-Glu-Leu
hoàc
- 13 -
Proteinaza
cùa
con
trùng
protein thùc àn thành càc axit
chà't dinh duòng
càn thiè't
xùc
tàc cho sU phàn giài
amin tU do va vi
vày cung cÉtp
cho sU
tàng trUÒng
va phàt trièn
bình thuòng. CÓ 4 lo^i proteinaza:
proteinaza
aspartic (con
gpi là proteinaza
axit),
proteinaza
xistein
(con
gpi
la
proteinaza thiol), proteinaza xerin va meta Iloproteinaza [24].
Nàm 1985, Applebaum [18] dà cho r^ng hàu hét con trùng sÙ dyng
proteinaza xerin vói tinh dàc hiéu tUdng tu tripxin hoàc tUdng
tu kimotripxin
de'
thuìr
phàn
nhièn, nhùng nghièn eùu sau
protein
thùc àn cùa minh. Tuy
này dà-cho thày
khòng phài trUÒng
h0p nào cùng nhu vày [134].
càc còng
trình nghièn
Lepidoptera dà cho théy vói
nhin chung ehùng
co
tripxin" vói pH t6i
ho^t
Uu
Ò
eùu vé
proteinaza Ò
tinh ch^t pH kiém cùa
tinh
proteinaza
àu trùng
ruòt giùa,
xerin
"tUdng tU
vùng kiém [16,17,100,131,141,155].
Phàn lòn àu trùng Coleoptera eó pH cùa ruòt giùa axit yèu,
ho^t tinh proteolitic chù yèu
thuóc vé proteinaza
xistein
Coleoptera là Costelytra
cùa ruòt giùa dU0c
[134,168,183].
zealandica
[123] cùng co hoeit tinh proteinaza
kiém. Ong tièu
hoà
cùa
proteinaza thiol-cathepsin
94]. Nhu vày rò
ràng là
con
[41]
Hai
va Tenebrio
Hemiptera
va Proteinaza
ho^t tinh
xàe dinh là
xerin va pH t6i
trùng
va
co
^u
trùng
moli
tor
Uu Ò vùng
chùa
càc
aspartic [89,90,92,
proteolitic cùa ruót giùa
con trùng biè'n dòi tù loài này dè'n loài khàc vói t^t cà 4 Io?ii
proteinaza dà dU0c tim th^y [167,183],
Gàn day 6 loài con trùng quan trpng dà dU0c nghièn eùu
- 14
vé ho^t tinh proteolitic
Lepidoptera (Agrotis
viiescens)
cùa
dich
ipsilon,
va. mot loài
ruòt
giua [142]. Ba loaì
Heliothis
zea
Coleoptera (Anthonomus
va
Mei
grandis)
iothis
co pH
thich h0p t^i pHlO-11 va ho^t tinh enzim bi ùc che' bòi ch^t ùc
che' tripxin dàu tUdng tù 63-72%,
cùa chùng là càe
proteinaza
ica
undecimpuncta
t§ii pH6-7. E-64,
"tUdng
ta)
eó ho§it
tU
tr ipxin". Tuy
decemlineata
va
tinh proteolitic cUc
d§ii
mot ché[t ùc che' dàc hi^u proteinaza xistein
dà ùc che' ho^t
(Lept inotarsa
xerin
{Leptinotarsa
nhièn 2 loài Coleoptera
Diobrot
ehùng tò proteinaza chù yè'u
dò
proteolitic
decemlineata)
undecimpunctata)
chùng
cùa
va
tò
dich
(Diobrot
69%
ho^t
tinh
ruòt
chù
giùa
100%
ica
yèu cùa chùng là
proteinaza xistein.
Nhùng thu ho^ch gàn day vé
nghièn eùu proteinaza tièu
hoà cùa con trùng càng cùng c6 nhàn dinh vé sU co màt cùa cà 4
lo§ii proteinaza. Bang lUu y còng trình nghièn eùu cùa Gillikin
va tàp thè [72]. It nhàt 15 proteinaza dà dU0c xàe djnh tù òng
tièu hoà cùa àu
Diabrotica
trùng
dyng cùa càc chat
ùc che
virgifera,
dàc hiéu
Nghièn eùu tàc
dà ehùng
tò co cà 4 lo^i
proteinaza, trong dò chù yèu là proteinaza xistein.
Ho?it tinh
tripxin, tUdng
proteolitic,
tu
kimotripxin,
cacboxypeptidaza A va B,
nghièn eùu Ò nhiéu
Khòi lU0ng phàn
trùng biè'n dò'i
tù
bao gÓm
Idxin
va cathepsin B
ho§it tinh
tUdng tU
aminopeptidaza,
hoàc D cùng dà dU0c
loài
con
trùng [42,67,75,91,93,120,148].
cùa
càc
enzim
tù 13000-53000
tUdng tu tripxin cùa con
[17,42,57,71,88,112,131]. Kh6i
- Xem thêm -